2. 广西科学院, 广西南宁 530007;
3. 广西农业职业技术大学, 广西南宁 530007;
4. 广西化工研究院有限公司, 广西南宁 530001;
5. 广西科学院生物研究所有限责任公司, 广西南宁 530007
2. Guangxi Academy of Sciences, Nanning, Guangxi, 530007, China;
3. Guangxi Vocational University of Agriculture, Nanning, Guangxi, 530007, China;
4. Guangxi Research Institute of Chemical Industry Co., Ltd., Nanning, Guangxi, 530001, China;
5. Institute of Biology Co., Ltd., Guangxi Academy of Sciences, Nanning, Guangxi, 530007, China
甘油葡萄糖苷(Glucosylglycerol, GG)是自然界中存在的一类重要糖苷类化合物，由于具有低甜度、低吸湿性、高保水性等理化性质及保护大分子的良好性能和生物活性，其在化妆品、保健品、食品、酶制剂、医药等领域有巨大的应用潜力[1-2]。
GG很难通过植物提取法获得，目前常用的GG生产方法为化学合成法、微生物发酵法及酶催化合成法[3]。Takenaka等[4]在GG化学合成的研究中提到，α-葡萄糖苷酶可催化麦芽糖和丙三醇生成GG，但得到的αGG转化率较低、副产物多，后续纯化步骤复杂且不经济。一些种类的异养型假单胞菌(Pseudomonas sp.)及蓝藻可在特定条件下合成2-αGG[5]；某些高等植物如南非重生草(Myrothamnus flabellifolius)可在体内合成2-βGG[6]。酶法合成αGG是通过在体外高效表达生物体内的酶，进而催化合成αGG。无需依赖其他外部条件，蔗糖磷酸化酶(Sucrose Phosphorylase, SP, EC 2.1.4.7)可催化蔗糖和磷酸盐转变成α-葡萄糖-1-磷酸(α-G-1-P)和D-果糖[7]。Cui等[8]将食品级乳杆菌[罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri，SDMCC050455)]作为宿主，重组表达LrSP基因，构建全细胞生物催化剂生产2-αGG。目前，基因工程酶催化合成αGG的研究中，使用最为广泛的是SP，其主要来源于长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)[9]、青春双歧杆菌(B.adolescentis)[10]、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)[11]和嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharophila)[12]。
蔗糖异构酶(Sucrose Isomerase，SI)与SP同属糖苷水解酶家族，两者在底物特异性、催化机制及工业应用上表现出相似性。但SP在催化转糖苷反应时，是将葡萄糖基从蔗糖转移到其他受体(如磷酸或非磷酸受体)形成新的糖苷键; 而SI在催化转糖苷反应时则无需辅助因子，且热稳定性更好。SI是分子内异构酶，可催化蔗糖进行分子内转糖苷反应，生成蔗糖的同分异构体——异麦芽酮糖(Isomaltulose, 6-O-α-D-glucopyranosyl-D-fructofuranase)和海藻酮糖(Trehalulose, 1-O-α-D-glucopyranosyl-D-fructofuranase)，并水解产生少量的葡萄糖和果糖[13]。在实际生产中，SI主要用于生产蔗糖代替品异麦芽酮糖[14]。
近年来，科研人员已发现多种微生物来源的SI，这些微生物包括主要产生异麦芽酮糖的红色精朊杆菌(Protaminobacter rubrum)[15]、肠杆菌属菌株(Enterobacter sp.)[16]、分散泛菌(Pantoea dispersa)[17]、大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontici)[18]和土生拉乌尔菌(Raoultella terrigena)[19]等，以及主要产生海藻酮糖的放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)[20]和嗜酸假单胞菌(Pseudomonas mesoacidophila)[20-21]。但从自然界中分离筛选的菌株酶活力普遍偏低，为提高SI酶活力，国内外学者采用了多种方法，包括诱变育种[22]，宿主菌株改造[23-25]、启动子和信号肽优化[26-27]、发酵条件优化[27-28]等异源克隆表达方法，定向进化[29]、半理性设计[30]和理性设计[31-32]等分子改造方法。
本团队在前期研究[33-35]中通过聚合酶链式反应(PCR)克隆获得不包括信号肽序列109—1 803 bp片段的大黄欧文氏菌(NCPPB 1578)SI基因序列(GenBank登录号为AY223550)，并通过条件优化实现其高分泌表达。前期研究发现，重组SI不但能以蔗糖为底物进行转糖苷反应，而且可以水解对硝基苯酚-α-葡萄糖苷; 另外，通过突变SI催化袋的苯丙氨酸残基，可以筛选到SI分子内转糖苷活性降低、水解活性提高的突变体，该突变体可用于合成α-熊果苷[33-35]。因此推断，改造后的SI同样可用于合成GG。已有研究表明，将SI定位表达至细胞的周质腔，这样固定化细胞就等于固定化SI，将固定化细胞用于催化反应，不但能实现酶的重复利用，还可以极大降低酶的制作成本，从而实现GG的高效、低成本制备[36]。但通过SI一步法合成GG的方法尚未见报道。本研究拟通过点饱和突变技术改造SI，并以改造后的SI作为催化剂，以蔗糖为糖基供体、丙三醇为糖基受体，一步催化合成αGG。若此方法具有较好的适应性，不仅可以用于合成一系列不同的甘油基糖苷类产物，而且在食品、医药和化妆品等行业都具备实际应用潜力。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株与引物大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)、E.coli DH5α、E.coli XL10-Gold及质粒pSE380-SI、pET22b-SI均为本实验室保存。突变试验所用菌株和质粒见表 1，定点饱和突变引物及其序列见表 2。本研究工程菌构建所用引物：HindⅢSI22bFOR(5′-GGAAGCTTACCGTTCAGCAATCA-3′)、SI22b XhoⅠRE(5′-GACTCGAGCGGATTAAGTTTATAAATGCC-3′)。
| 菌株或质粒 Strain or plasmid |
基因型或表型 Genotype or phenotype |
来源 Source |
| pSE380-SI | pSE380 containing SI ORF | This work |
| pET22b-SI | pET22b containing coding region of SI from nucleotides 109 to 1 803 | This work |
| pET22b-A297 | pET22b-SI containing mutation site in F297 with Ala | This work |
| pET22b-G297 | pET22b-SI containing mutation site in F297 with Gly | This work |
| pET22b-M297 | pET22b-SI containing mutation site in F297 with Met | This work |
| pET22b-P297 | pET22b-SI containing mutation site in F297 with Pro | This work |
| pET22b-S297 | pET22b-SI containing mutation site in F297 with Ser | This work |
| pET22b-T297 | pET22b-SI containing mutation site in F297with Thr | This work |
| pET22b-V297 | pET22b-SI containing mutation site in F297 with Val | This work |
| pET22b-A321 | pET22b-SI containing mutation site in F321 with Ala | This work |
| pET22b-G321 | pET22b-SI containing mutation site in F321 with Gly | This work |
| pET22b-M321 | pET22b-SI containing mutation site in F321 with Met | This work |
| pET22b-P321 | pET22b-SI containing mutation site in F321 with Pro | This work |
| pET22b-S321 | pET22b-SI containing mutation site in F321 with Ser | This work |
| pET22b-T321 | pET22b-SI containing mutation site in F321 with Thr | This work |
| pET22b-V321 | pET22b-SI containing mutation site in F321 with Val | This work |
| E.coli BL21(DE3) | Expression host | Laboratory collection |
| E.coli DH5α | Cloning host | Laboratory collection |
| E.coli XL10-Gold | Cloning host | Laboratory collection |
| 编号 Number |
碱基序列(5′→3′) Nucleotide sequence (5′→3′) |
编号 Number |
碱基序列(5′→3′) Nucleotide sequence (5′→3′) |
|
| A297F | CGGGGGAAATAGCTGGGGTTCCTCTG | A321F | ATATAGCGTTTACGGCTGATCTGATCAGGC | |
| A297R | CAGAGGAACCCCAGCTATTTCCCCCG | A321R | GCCTGATCAGATCAGCCGTAAACGCTATAT | |
| G297F | CGGGGGAAATAGGTGGGGTTCCTCTG | G321F | ATATAGCGTTTACGGGTGATCTGATCAGGC | |
| G297R | CAGAGGAACCCCACCTATTTCCCCCG | G321R | GCCTGATCAGATCACCCGTAAACGCTATAT | |
| M297F | CGGGGGAAATAATGGGGGTTCCTCTG | M321F | ATATAGCGTTTACGATGGATCTGATCAGGC | |
| M297R | CAGAGGAACCCCCATTATTTCCCCCG | M321R | GCCTGATCAGATCCATCGTAAACGCTATAT | |
| P297F | CGGGGGAAATACCTGGGGTTCCTCTG | P321F | ATATAGCGTTTACGCCTGATCTGATCAGGC | |
| P297R | CAGAGGAACCCCAGGTATTTCCCCCG | P321R | GCCTGATCAGATCAGGCGTAAACGCTATAT | |
| S297F | CGGGGGAAATATCTGGGGTTCCTCTG | S321F | ATATAGCGTTTACGTCTGATCTGATCAGGC | |
| S297R | CAGAGGAACCCCAGTTATTTCCCCCG | S321R | GCCTGATCAGATCAGACGTAAACGCTATAT | |
| T297F | CGGGGGAAATAACTGGGGTTCCTCTG | T321F | ATATAGCGTTTACGACTGATCTGATCAGGC | |
| T297R | CAGAGGAACCCCAGTTATTTCCCCCG | T321R | GCCTGATCAGATCAGTCGTAAACGCTATAT | |
| V297F | CGGGGGAAATAGTTGGGGTTCCTCTG | V321F | ATATAGCGTTTACGGTTGATCTGATCAGGC | |
| V297R | CAGAGGAACCCCATCTATTTCCCCCG | V321R | GCCTGATCAGATCAACCGTAAACGCTATAT |
1.1.2 主要试剂
HindⅢ与XhoⅠ等限制性内切酶、DNA聚合酶(Promega生物技术有限公司)，蛋白胨、酵母浸粉(英国Oxoid公司)，α-乳糖、对苯二酚(分析纯，北京索莱宝科技有限公司)，果糖、葡萄糖、异麦芽酮糖、α-熊果苷标准品(美国Sigma-Aldrich公司)，蔗糖、丙三醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，乙腈(色谱纯，成都诺尔施科技有限公司)，甲醇(色谱纯，天津市大茂化学试剂厂)。
1.1.3 培养基LB培养基：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化钠10 g/L。
自诱导培养基ZYM-5052：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、丙三醇5 g/L、葡萄糖0.5 g/L、乳糖2 g/L、十二水磷酸氢二钠8.95 g/L、磷酸二氢钠3.4 g/L、氯化铵2.675 g/L、硫酸钠0.71 g/L、七水硫酸镁0.5 g/L。
1.2 方法 1.2.1 重组表达菌株构建基于本团队前期研究构建的大黄欧文氏菌SI的表达质粒pSE380-SI，设计扩增SI基因功能区109-1 800 bp引物：HindⅢSI22bFOR和SI22bXhoⅠRE，以pSE380-SI为模板进行PCR扩增。将目标特异性片段回收，使用HindⅢ和XhoⅠ双酶切，并连接到pET22b载体上。将连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞中，涂布在含氨苄西林钠(Amp，100 μg/mL)的LB(LB/Amp)固体培养基上，于37 ℃过夜培养。挑取阳性克隆提取质粒进行酶切验证，若酶切片段大小与预期相符，则将克隆质粒交由深圳华大基因科技有限公司测序。将基因序列完全正确的质粒命名为pET22b-SI，将其转化至E.coli BL21 (DE3)作为表达菌株用于后续研究。
1.2.2 SI基因在大肠杆菌中的表达将-80 ℃保存的重组菌种E.coli BL21(DE3)/pET22b-SI划线到LB/Amp平板培养基上，于37 ℃过夜培养，挑取平板上的单菌落接种到5 mL LB/Amp液体培养基中，于30 ℃、220 r/min下培养11—12 h，将菌液以1%(V∶V)的接种量接种到50 mL LB/Amp液体培养基中，于37 ℃、220 r/min下培养5—6 h，加入0.05 mL 100 mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，在25 ℃下诱导18 h，测定发酵液酶活力。
1.2.3 酶活力测定将待测菌液用50 mmol/L的磷酸缓冲液(pH值为6.0)稀释成合适的浓度，取20 μL稀释后的菌液，加入80 μL 7.5 mmol/L的α-对硝基葡萄糖苷(pNPG)，于30 ℃反应10 min后，加入200 μL 1 mol/L的碳酸钠终止反应，混匀后取200 μL样液测定OD405值。
酶活力单位定义：在上述条件下，每分钟催化pNPG生成1 μmoL对硝基苯酚(pNP)所需要的酶量为一个活力单位。
1.2.4 菌体生物量测定单位湿菌体含量计算：取3份50 mL的发酵菌液，离心收集菌体，使用千分之一天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]精确称量菌体湿重，计算3份湿菌体的平均质量后，换算为每毫升菌液所含湿菌体的毫克数(mg/mL)。
1.2.5 E.coli BL21(DE3)/pET22b-SI蛋白诱导表达条件优化 1.2.5.1 IPTG诱导的最佳温度和浓度将-80 ℃中保存的重组菌种E.coli BL21(DE3)/pET22b-SI划线到LB/Amp平板培养基上，于37 ℃过夜培养。将平板上的单菌落接种到5 mL LB/Amp液体培养基中，于30 ℃、220 r/min下培养11—12 h，将种子液以1%(V∶V)的接种量接种到50 mL LB/Amp液体培养基中(置于250 mL三角瓶中)，于37 ℃、220 r/min下培养至对数中期，当OD600值为0.8—1.0时，进行诱导表达实验。(1)诱导温度优化：加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L，分别于20、25、30、35 ℃诱导18 h，取样测定发酵液OD600值和酶活力。(2)诱导浓度优化：加入IPTG使终浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mmol/L，于30 ℃诱导18 h，取样测定发酵液OD600值和酶活力。
1.2.5.2 自诱导最佳温度将-80 ℃中保存的重组菌种E.coli BL21(DE3)/pET22b-SI划线到LB/Amp平板培养基上，于37 ℃过夜培养。将平板上的单菌落接种到5 mL LB/Amp液体培养基中，于30 ℃、220 r/min下培养11—12 h，将种子液以1%(V∶V)的接种量接种到50 mL ZYM-5052/Amp培养基中，分别于20、22、24、26、28、30、32 ℃，220 r/min下过夜培养，取样测定不同温度下发酵液OD600值和酶活力。
1.2.6 F297、F321位点饱和突变及突变体筛选构成SI催化袋的38个氨基酸中有7个苯丙氨酸残基：F185、F186、F205、F297、F319、F321和F364。这7个苯丙氨酸残基以相对松散的结构形式分布于催化袋的底部至顶部，而且相对聚集于与底物果糖基结合的催化袋一侧(图 1)。本团队前期研究[34]结果表明，F185、F186和F2053个位点主要通过疏水和占位作用来保持蔗糖分子在催化袋中的特定构象。对来源于嗜酸假单胞菌MX-45的SI MutB晶体结构的分析则表明，在MutB催化袋入口有一对苯丙氨酸残基[F256(对应SI的F297)和F286(对应SI的F321)]分列在两侧，空间距离约为0.6 nm，由此在催化袋底部上方形成一个约1.1 nm的底物进入或产物离去通道[21]。SI的F321是最靠近催化中心的苯丙氨酸残基。通过饱和突变F297和F321位点，改变两个位点氨基酸残基的体积大小或疏水性强弱，将影响底物进入或产物离去的状态，进而改变酶活特性。
|
| 图 1 SI催化袋中7个苯丙氨酸残基分布 Fig.1 Distribution of seven phenylalanine residues in SI catalytic pocket |
设计突变扩增引物(表 2)，以pET22b-SI为模板进行PCR扩增，取2.5 μL PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。剩余PCR产物用DpnⅠ消化过夜，去除模板DNA后，取5 μL消化混合液用热激法转化到E.coli XL10-Gold后，涂布在含Amp (50 mg/L)的LB平板培养基上。于37 ℃培养12 h以上，从平板中挑取单菌落接种到5 mL LB液体培养基中，于37 ℃培养至菌液略显浑浊，取0.2 mL菌液，加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L，于28 ℃诱导表达4 h，离心收集菌体，用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。将检测到目的蛋白条带的菌株判定为候选菌株，划线分离后，送至深圳华大基因科技有限公司进行测序。
突变体经DNA测序验证正确后，采用自诱导方式发酵诱导表达。在前期研究[33-35]中，对苯二酚与蔗糖发生分子间转糖苷作用生成α-熊果苷，沿用该反应体系，通过比较α-熊果苷产率的高低来评价突变体分子间转糖苷作用的强弱，进而筛选适用于后续甘油葡萄糖苷合成反应试验的优良突变体。反应以1 mol/L的蔗糖和0.1 mol/L的对苯二酚为底物，自诱导发酵液和转化液体积比为1∶4，转化温度为室温，转化5 h后离心，取上清液用高效液相色谱(HPLC)紫外检测器(美国Waters公司)检测组分。
1.2.7 重组工程菌合成GG将筛选的突变体进行发酵诱导培养。取适量发酵液，6 000 r/min离心，弃去上清液，用无菌水洗涤3次，保留菌体，加入转化液(蔗糖浓度为1 mol/L、丙三醇浓度为1 mol/L)，将菌液和转化液按体积比1∶4混合，于30 ℃过夜反应，离心，取上清液用HPLC示差折光检测器(美国Waters公司)检测组分。另取菌体，以同样方法处理，以浓度为1 mol/L的蔗糖溶液替代转化液，菌液与蔗糖溶液体积比为1∶4，于30 ℃过夜反应，离心，取上清液用HPLC示差折光检测器检测组分。
1.2.8 催化反应产物测定αGG催化反应液HPLC检测色谱条件：Wates 600E高效液相色谱仪，配备Waters 2414示差折光检测器和Waters Carbohydrate High Performance色谱柱(4.6 mm×250 mm，4 μm)(美国Waters公司)，流动相采用乙腈、水(体积比为80∶20)，流速为1 mL/min，柱温为35 ℃，进样10 μL。分别配制浓度为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L的丙三醇、蔗糖混合标准品，按上述色谱条件测定标准品，并绘制标准曲线。将反应液稀释适当倍数测定，将结果代入标准曲线计算反应液中相应物质的浓度。利用液相色谱-质谱联用(LC/MS)和核磁共振(NMR)分析确定产物的结构。
1.2.9 转化反应条件优化分别取适量相同体积的工程菌发酵液，离心后弃去上清液，菌体用无菌水洗涤后，再次离心并弃去上清液，加入与发酵液等体积的反应液(蔗糖和丙三醇摩尔浓度比为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)，在28 ℃下分别反应0、5、10、15、20、25 h后终止，使用HPLC测定不同反应时间下反应液中的产物含量变化。反应生成的GG以丙三醇消耗的摩尔量计，产品转化率以丙三醇转化率[即丙三醇消耗量(mol/L)/丙三醇初始浓度(mol/L)]计算，对比不同条件下的丙三醇转化率及GG产量变化。
1.2.10 重组工程菌细胞固定化取适量工程菌发酵液离心收集菌体，分别配制与菌液等体积的2.5%海藻酸钠胶体溶液和1.8%氯化钙溶液：菌体先用适量生理盐水混匀，再加入海藻酸钠胶体一起混匀，包埋30 min，得到混有菌体的海藻酸钠胶体溶液，将该溶液滴入氯化钙溶液，搅拌使其产生颗粒。将配置好的溶液放置于4 ℃冰箱过夜备用。
固定化细胞损失酶活力测定：在每批反应投料前后均取适量固定化细胞，切成芝麻大小的颗粒，精密称取0.010 g，加入100 μL 7.5 mmol/L pNPG，于30 ℃反应10 min后，加入200 μL 1 mol/L的碳酸钠终止反应，混匀，静置1 min，取上清液200 μL测定OD405值。计算酶活力(U/g)，对比每批投料反应前后的酶活力变化。
2 结果与分析 2.1 大黄欧文氏菌SI基因改造和工程菌的构建 2.1.1 分泌表达质粒pET22b-SI的构建质粒pET22b-SI的HindⅢ和XhoⅠ双酶切验证结果显示，泳道1为pET22b空载质粒，泳道2在约1 600 bp位置有一大小与目标片段预期相符的特异片段(图 2)。测序后确定扩增片断基因序列完全正确。
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| M: Lambda DNA(EcoR Ⅰ+HindⅢ); 1:pET22b(XhoⅠ+HindⅢ); 2:pET22b-SI (XhoⅠ+HindⅢ). 图 2 质粒pET22b-SI的HindⅢ和XhoⅠ双酶切验证 Fig.2 Restriction analysis of pET22b-SI plasmid using HindⅢ and XhoⅠ |
2.1.2 E.coli BL21(DE3)/pET22b-SI蛋白诱导表达条件优化 2.1.2.1 IPTG诱导的最佳温度和浓度
将质粒pET22b-SI转化到E.coli BL21(DE3)构建表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET22b-SI，IPTG诱导18 h后，按照1.2.3节的方法测定发酵液的酶活力，结果如图 3所示。当IPTG浓度为0.1—1.0 mmol/L时，各浓度组酶活力均在诱导温度为25 ℃时最高，且在IPTG浓度为0.5 mmol/L、温度为25 ℃的条件下，E.coli BL21(DE3)/pET22b-SI诱导表达的SI酶活力达到最大值，即0.21 U/mL菌液。
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| 图 3 IPTG诱导的最佳温度和浓度 Fig.3 Optimal temperature and concentration during IPTG induction process |
2.1.2.2 E.coli BL21(DE3)/pET22b-SI自诱导最佳温度
用ZYM-5052/Amp培养基诱导18 h后，按照1.2.3节的方法测定发酵液的酶活力，结果如图 4所示。随着培养温度的上升，发酵液(OD600值=1.0时)的酶活力随之上升，在26 ℃达到最高，为0.32 U/mL菌液；当培养温度高于28 ℃时，发酵液的酶活力随培养温度上升而快速下降，因此自诱导表达的温度最佳范围为24—28 ℃。
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| 图 4 E.coli BL21(DE3)/pET22b-SI自诱导最佳温度 Fig.4 Optimal temperature for autoinduction of E.coli BL21(DE3)/pET22b-SI |
2.1.2.3 E.coli BL21(DE3)/pET22b-SI在2种诱导方式下的酶活力对比
基于上述IPTG诱导表达和自诱导表达的最佳条件，对比E.coli BL21(DE3)/pET22b-SI在2种诱导方式下的酶活力，结果表明，自诱导方式得到的菌体密度是IPTG诱导方式的4倍，而在同等密度下进行酶活力比较，自诱导方式酶活力是IPTG诱导方式的4倍，因此自诱导方式整体酶活力约为IPTG诱导方式的16倍(3.36 U/mL)。
2.1.3 F297和F321位点饱和突变体的筛选F297和F321位点饱和突变体的分子间转糖苷酶活力测定结果如表 3所示。一部分突变体的分子间转糖苷酶活力高于野生型。虽然F297A突变体的对苯二酚残留率最低，但其转化生成的α-熊果苷产率并不太高；F321G、F321P、F321M和F321S 4个突变体在反应时间内转化生成的α-熊果苷产率接近或超过40%，表明这几个突变体具有很强的分子间转糖苷作用，F321位点在影响SI转糖苷方面比F297位点更重要。
| 酶 Enzyme |
分子间转糖苷酶 活力/(U/mL) Intermolecular transglycosidase activity/ (U/mL) |
α-熊果苷 产率/% α-arbutin yield/% |
对苯二酚 残留率/% Hydroquinone residual rate/% |
| SI (Wild type) | 0.34 | 11.59 | 85.06 |
| F297A | 0.09 | 34.49 | 21.61 |
| F297G | 0.18 | 1.60 | 96.21 |
| F297M | 0.39 | 19.31 | 77.96 |
| F297P | 0.87 | 22.16 | 72.83 |
| F297S | 0.81 | 13.54 | 80.01 |
| F297T | 2.17 | 20.71 | 74.13 |
| F297V | 1.97 | 27.42 | 67.14 |
| F321A | 0.45 | 0.18 | 97.73 |
| F321G | 0.46 | 37.41 | 60.04 |
| F321M | 1.98 | 45.90 | 51.25 |
| F321P | 0.40 | 36.88 | 60.36 |
| F321S | 0.65 | 40.29 | 55.25 |
| F321T | 0.49 | 28.57 | 68.83 |
| F321V | 0.30 | 20.38 | 77.26 |
2.2 重组工程菌合成GG 2.2.1 GG转化试验结果
以筛选的突变体F321M作为催化剂，以蔗糖和丙三醇作为催化底物，在30 ℃下过夜反应后，取反应液进行HPLC检测。由色谱图(图 5)可以看出，当反应底物只有蔗糖时，蔗糖(E)异构为异麦芽酮糖(F)和海藻酮糖(G)，水解产物葡萄糖(C)和果糖(B)的比例急剧增加，表现为水解活性大幅度增加[图 5(a)]；当反应底物为蔗糖和丙三醇混合体系时，果糖峰基本不变，葡萄糖峰急剧降低，在保留时间为8.5 min处出现一个新产物(D)的样品峰[图 5(b)]，其保留时间与对照品色谱图[图 5(c)]中αGG的保留时间基本吻合。产物D经LC-MS检测，结果显示[M-H]+离子的质荷比(m/z)为255.108，推测该未知产物的分子式为C9H18O8，与αGG的分子量吻合。对纯化后的产物进行NMR分析，1H-NMR图谱在4.63 ppm处有一个双峰信号，其耦合常数(J)为3.7 Hz，推测这一化合物含有1个α型糖苷键；13C-NMR图谱显示6组碳信号，化学位移(δC )分别为99.41、70.84、72.53、70.61、73.06、63.43，表明该化合物中有葡萄糖存在。根据NMR数据推定产物为αGG。
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| A: glycerol; B: fructose; C: glucose; D: glucosylglycerol; E: sucrose; F: isomaltulose; G: trehalulose. 图 5 突变体催化蔗糖体系及蔗糖/丙三醇体系反应液成分的HPLC分析图谱 Fig.5 HPLC analysis chromatograms of reaction components in mutant-catalyzed sucrose and sucrose/glycerol systems |
分别将野生型菌株与突变菌株F321S、F321M、F321G和F321P置于浓度均为1 mol/L的丙三醇、蔗糖混合溶液反应24 h，对比反应产物组成比例(由反应液HPLC检测色谱图所得)，结果显示，F321M转化得到GG的比例最高，约是野生型菌株的7倍(表 4)。后续试验选定突变菌株F321M为试验菌株。
| 酶 Enzyme |
异麦芽 酮糖 Isomal- tulose |
海藻酮糖 Trehalu- lose |
葡萄糖+ 果糖 Glucose+ Frutose |
甘油葡萄 糖苷 GG |
| SI (Wild type) |
80.3 | 9.4 | 6.2 | 4.1 |
| F321G | 35.9 | 3.6 | 39.5 | 21.0 |
| F321M | 34.2 | 4.8 | 32.8 | 28.2 |
| F321P | 61.2 | 5.1 | 22.4 | 11.3 |
| F321S | 62.2 | 4.2 | 20.9 | 12.7 |
2.2.2 转化反应条件优化
各组丙三醇转化率均随反应时间先升高后降低，且随着丙三醇初始浓度增大，各组丙三醇的最大转化率整体呈现逐步下降趋势[图 6(a)]；在不同丙三醇浓度体系中，GG产物浓度均整体上随反应时间先增大后减小[图 6(b)]；随着反应的进行，各浓度的丙三醇转化率逐渐达到最大值，但随后GG产量呈现下降趋势[图 6:(a)、(b)]，推测是GG浓度达到峰值后，便开始水解。蔗糖和丙三醇摩尔浓度分别为1.0 mol/L和5.0 mol/L时，GG产量达到133.6 g/L，但其转化率仅有10%。综合考虑最大摩尔转化率与GG产量，丙三醇摩尔浓度保持在2.0—2.5 mol/L时反应效果最佳[图 6(c)]。
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| (a) Effect of glycerol concentration on conversion rate; (b) Effect of glycerol concentration on GG yield; (c) Comparison of maximum conversion rate. 图 6 转化反应最佳底物摩尔比及最佳反应温度 Fig.6 Optimal substrate molar ratio and reaction temperature for conversion |
2.2.3 重组工程菌细胞固定化
分别测定同一批培养的重组工程菌发酵液及菌体的酶活力，结果显示，发酵液和菌体的酶活力基本一致，因此，推测在pET22b表达系统中，载体自带信号肽pelB，能够将表达的目的蛋白定位于外周质腔，而非分泌到培养液中。固定菌体细胞即相当于固定酶蛋白，可以将重组工程菌固定化后用于转化反应。采用海藻酸钠固定重组工程菌，连续5批固定化细胞损失的酶活力为5%—8%。将固定化细胞用于合成GG的催化反应，在连续投料5批次后酶活力大约损失50%。固定化细胞不仅便于酶的多批次使用，而且易于与底物溶液分离，有助于降低酶转化成本，并有利于后期转化液中αGG的纯化分离。
3 讨论本研究结果进一步印证了F321位点是保证SI催化袋疏水性的重要氨基酸残基。F321位点突变降低了催化基团附近的疏水性，使得水分子(或其他带羟基小分子化合物)更容易进入催化袋或者更容易接近催化基团，让更多的水分子(或其他带羟基小分子化合物)可以作为糖基受体，最终一部分蔗糖通过分子内转糖苷作用形成异麦芽酮糖和海藻酮糖，另一部分蔗糖则通过分子间转糖苷作用形成新的葡萄糖苷化合物。反应路径如图 7所示。
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| 图 7 SI催化合成甘油葡萄糖苷反应路径 Fig.7 SI-catalyzed synthesis of glycerol glucoside reaction pathway |
野生型大黄欧文氏菌SI主要是通过分子内转糖苷作用，催化蔗糖异构为异麦芽酮糖和海藻酮糖。在反应体系中加入其他带羟基的小分子糖基受体(如对苯二酚、丙三醇)，可以生成少量新的糖苷化合物(如α-熊果苷、GG)，但这个反应过程需要消耗大量的蔗糖，并不具备工业生产的经济性。
本研究对大黄欧文氏菌SI催化袋的苯丙氨酸残基进行定点饱和突变，改变了酶的催化特性，并将其应用于酶法合成GG，突变后菌株转化GG的产率较野生型菌株提高了约7倍。此次研究既拓展了SI的应用范围，也为与之相类似的糖苷合成酶的改造应用提供了成功范例。同时，本研究发现筛选到的突变体还有较强的分子内转糖苷作用，导致相当一部分底物蔗糖通过分子内转糖苷作用转化为异麦芽酮糖和海藻酮糖，这不但浪费了底物，也增加了后续产物纯化的压力。如何选择新的位点突变，进一步提高突变体的分子间转糖苷活性，有待后续开展深入研究。
对于αGG的合成，不管是采用酶法，还是采用全细胞催化法，最终的转化液中均含有一定浓度的蔗糖和果糖，虽然有研究报道了从转化液中分离出αGG的方法，但产品收率不高[37]。因此，下游的分离纯化工艺[38]仍然需要改进，以进一步提高αGG的收率。
4 结论本研究构建了大黄欧文氏菌SI的表达质粒pET22b-SI，并优化了诱导方式、诱导条件，实现了工程菌E.coli BL21(DE3)/pET22b-SI的高分泌表达。在以乳糖作为诱导剂的自诱导培养基ZYM-5052/Amp中，该工程菌的整体酶活力为IPTG诱导方式的16倍。研究结果表明，可以用廉价的乳糖替代昂贵的IPTG作为诱导剂，以大幅降低生产制备SI的成本。为进一步提高SI酶活力，本研究对F297和F321这两个重要位点进行定点饱和突变，筛选出4个酶活力及转糖苷活性较高的突变体，成功催化合成了GG并优化了转化反应条件，使GG产量达到133.6 g/L。
本研究利用大黄欧文氏菌SI固定化细胞合成GG，为αGG的工业化生产及应用奠定了理论和实验基础。该方法不仅能简化生产工艺并提高产率、降低生产成本、减少环境污染，还为GG的绿色制造提供了新思路。此外，突变体F321M的性能提升进一步揭示了关键活性位点的作用机制，为GG及同类型糖苷的生物合成提供了重要参考。
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