金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是常见的食源性致病菌之一，属于典型的革兰氏阳性致病菌^[1]。该细菌产生的肠毒素是导致食物中毒的主要因素之一。在食品工业领域，S.aureus污染不仅会让产品变质，造成经济方面的损失，还会直接对消费者健康构成威胁^[2-3]。当前，控制S.aureus的传统方法主要依靠高温处理和抗生素治疗。高温处理会使蛋白质变性，进而影响食品品质与营养；抗生素滥用则会加剧S.aureus的耐药性^[4-5]。所以，研发安全、高效、天然的生物控制策略，是当前研究的关键方向。

近年来乳酸菌因其公认安全(Generally Recognized As Safe, GRAS)状态及丰富的抑菌代谢产物，被视为替代传统方法的理想候选。研究发现，乳酸菌能够产生有机酸、细菌素(如乳链菌肽Nisin)和过氧化氢等多种物质来抑制S.aureus的生长^[6-7]。如薛小格等^[8]报道植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)所产生的细菌素可以破坏S.aureus的细胞膜完整性；长双歧杆菌(Bifidobacterium longum) FB1-4上清液能干扰S.aureus的生物膜形成与毒力基因表达^[9]。但是现有研究大多集中于乳酸菌的拮抗现象描述，针对筛选具有高效、稳定拮抗S.aureus活性的乳酸菌方面的研究仍显不足^[10]。因此，筛选高效拮抗S.aureus的乳酸菌具有广泛的应用前景。

乳酸菌抑菌活性物质的产生常常受到发酵工艺的影响，如发酵培养基的组成及培养条件均对菌体生物量及目标代谢产物的合成有显著影响^[11-13]。未经发酵工艺优化的乳酸菌, 其抗菌代谢产物往往产量低、生产成本高，难以满足规模化应用的需求^[14]。因此，系统优化高产抑菌物质乳酸菌的发酵工艺参数(如碳氮源、温度、pH值、接种量及发酵时间)，以最大限度地提升其目标代谢产物的合成效率，是从实验室研究迈向产业化应用不可或缺的核心环节^[15-16]。因此，本研究拟通过广泛环境采样，筛选对耐药S.aureus具有高效且稳定拮抗活性的乳酸菌株，并对菌株发酵工艺进行优化，进一步探索其安全性及抑菌机理，以期为耐药S.aureus的生物防治及食品防腐剂开发奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品

不同样品间使用独立的无菌工具，避免交叉污染。(1)发酵酸嘢：于2025年6月购买于广西南宁市某菜市场，4 ℃冷藏保存，24 h内处理。(2)果园土壤：于2025年6月采集广西南宁市武鸣区某沃柑园土壤，去除杂质，置于样品袋中，4 ℃冷藏保存，24 h内处理。(3)南美白对虾(Litopenaeus vannamei)肠道：于2025年6月取自广西防城港市某对虾养殖场，使用无菌工具解剖并取其肠道，置于无菌离心管中，冰上保存并立即处理。(4)致病菌：S.aureus ATCC 6538购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

1.1.2 试剂与培养基

试剂：胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、碱性蛋白酶、中性蛋白酶均购自北京宏润宝顺科技有限公司。

培养基：配方中含有糖的培养基于115 ℃灭菌15 min，其他培养基于121 ℃灭菌20 min。

(1) LB (Luria-Bertani)肉汤培养基1 000 mL：LB肉汤培养基粉末25.0 g。

(2) MRS (de Man, Rogosa and Sharpe)肉汤培养基1 000 mL：蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、酵母浸粉4 g、葡萄糖20 g、磷酸二氢钾2 g、柠檬酸三铵2 g、醋酸钠5 g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.05 g、吐温80 1 mL。

(3) MRS固体培养基1 000 mL：蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、酵母浸粉4 g、葡萄糖20 g、磷酸二氢钾2 g、柠檬酸三铵2 g、醋酸钠5 g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.05 g、吐温80 1 mL、琼脂20 g。

(4) MRS-CaCO₃固体培养基1 000 mL：蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、酵母浸粉4 g、葡萄糖20 g、磷酸二氢钾2 g、柠檬酸三铵2 g、醋酸钠5 g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.05 g、吐温80 1 mL、琼脂20 g、碳酸钙20 g。

1.1.3 仪器与设备

Fresco 21微量离心机，金博仕(苏州)生物技术有限公司；Centrifuge 5910 Ri冷冻离心机，德国艾本德公司；T100 PCR仪，上海超敏生物科技有限公司；WD-9413C凝胶成像分析仪，济南来宝医疗器械有限公司；ZWY-2112B恒温培养振荡器，上海智诚投资有限公司；SUPRA 55 Sapphire场发射扫描电子显微镜，德国卡尔蔡司公司；SW-CJ-2FD-Ⅱ超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；JY-SPCT电泳仪，北京君意东方电泳设备有限公司；GI54DS高压灭菌锅，厦门致微及嘉仪器有限公司；真空冷冻干燥机，博医康(北京)仪器有限公司。

1.2 方法 1.2.1 拮抗S.aureus乳酸菌的初筛

各取1 g发酵酸嘢、果园土壤和南美白对虾肠道加入10 mL的生理盐水中，振荡混匀，随后在超净工作台内进行梯度稀释(10^-1、10^-2、10^-3)，每个梯度吸取100 μL均匀涂布于MRS-CaCO₃固体培养基，于35 ℃培养48 h后，挑选大小、颜色不同且出现透明圈的单菌落再次划线接种于新的MRS固体培养基上，于35 ℃培养24 h。待长出形态一致、大小均匀的单菌落后，挑取该单菌落进行甘油保藏，为后续的抑菌试验点样做准备。取S.aureus培养液，调整其OD₆₀₀值至约0.6，再将菌悬液均匀涂布于MRS固体培养基上，使用接种环将上述纯化菌株点种于新的MRS固体培养基上，35 ℃培养48 h后测量点样区出现的抑菌圈直径。

1.2.2 拮抗S.aureus乳酸菌的复筛

取1.2.1节中抑菌圈直径较大的菌株接种于MRS肉汤培养基中，37 ℃、200 r/min振荡培养24 h，于4 ℃、10 000 r/min离心10 min后取上清液，使用真空冷冻干燥机进行真空干燥，获得冻干产物，用无菌水溶解，经0.22 μm滤膜过滤获得无细胞上清液(Cell-Free Supernatant，CFS)^[17]，采用琼脂孔扩散法^[18]，通过过氧化氢和酸排除试验筛选对S.aureus具有抑菌活性的菌株，测定其抑菌圈直径和OD₆₀₀值。

1.2.3 菌株鉴定

形态学鉴定：选取拮抗效果最好的菌株于MRS固体培养基上35 ℃培养48 h后，观察其菌落的形态结构特点，并利用革兰氏染色和扫描电子显微镜观察其细胞形态。

生理生化鉴定：采用《常见细菌系统鉴定手册》^[19]及《伯杰细菌鉴定手册》^[20]中的鉴定方法。

菌株分子鉴定：参照文献[21]，以细菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1541R (5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)，对筛选到的拮抗乳酸菌基因组DNA进行PCR扩增，扩增片段为16S rRNA基因的Ⅴ1—Ⅴ9区，预期产物长度约1 500 bp。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35个循环；72 ℃终延伸10 min。扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序，所获得的结果通过EzBiocCloud数据库(https://www.ezbiocloud.net)进行序列比对，并通过MEGA v 12.0，使用Neighbor-Joining法(自展数为1 000)构建系统发育进化树。

1.2.4 菌株的生长和拮抗S.aureus活性曲线

将菌株接种到MRS肉汤培养基中37 ℃、200 r/min振荡培养36 h，每隔4 h取样测定菌液的OD₆₀₀和pH值，并参照1.2.2节进行离心、冻干、复溶后测定其CFS的抑菌活性。

1.2.5 影响乳酸菌CFS拮抗S.aureus的因素分析 1.2.5.1 酶敏感性试验

参照文献[22]的方法进行酶敏感试验，包含胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、碱性蛋白酶、中性蛋白酶，以未经过处理的CFS作为对照，参照1.2.2节进行抑菌试验。

1.2.5.2 pH值对CFS抑菌能力的影响

使用3 mol/L氢氧化钠和1 mol/L盐酸将离心、冻干、复溶后的CFS的pH值分别调至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，以相同pH值的MRS肉汤培养基作为相应的对照，参照1.2.2节进行抑菌试验。

1.2.5.3 热稳定性试验

参照1.2.2节将乳酸菌菌液经过离心、冻干、复溶后，取CFS在40、60、80、100、121 ℃条件下处理30 min后进行抑菌试验，以未经处理的CFS作为对照。

1.2.6 乳酸菌安全性评价

采用血琼脂平板法^[23]检测乳酸菌的溶血活性，并参照文献[24]进行20种临床抗生素敏感试验，以综合评价其安全性。

1.2.7 单因素试验

乳酸菌发酵工艺优化在30 mL玻璃瓶中进行，装液量10 mL，接种量3%(V/V)，发酵初始pH值为7.0，发酵温度37 ℃，转速200 r/min，发酵时间24 h，吐温80浓度1.0 mL/L, 取发酵液参照1.2.2节进行抑菌试验，研究不同因素对乳酸菌抑菌活性的影响。

(1) 发酵温度优化：接种后的MRS肉汤培养基分别置于30、33、36、39、42 ℃培养，其他因素不变。

(2) 发酵初始pH值优化：MRS肉汤培养基的pH值分别调整为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，其他因素不变。

(3) 发酵时间优化：接种后的MRS肉汤培养基置于37 ℃分别培养12、18、24、30、36、42 h，其他因素不变。

(4) 接种量优化：乳酸菌分别按1%、2%、3%、4%、5%(V/V)的接种量接种于MRS肉汤培养基中，其他因素不变。

(5) 碳源种类优化：以MRS肉汤培养基作为对照配置，分别用20 g/L的不同碳源(果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖)替代MRS肉汤培养基中的碳源成分(葡萄糖)，其他因素不变。

(6) 氮源种类优化：以MRS肉汤培养基作为对照配置，分别用19 g/L的不同氮源(玉米浆、酵母浸粉、蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏)替代MRS肉汤培养基中的氮源成分(蛋白胨、牛肉浸粉和酵母浸粉)，其他因素不变。

(7) 无机盐种类优化：以不含无机盐成分的MRS肉汤培养基作为空白对照配置，分别用9.25 g/L的不同无机盐(硫酸镁、磷酸氢二钾、醋酸钠、柠檬酸三铵、磷酸二氢钾、硫酸锰、硝酸钠、硫酸亚铁、硫酸锌、氯化钠)替代MRS肉汤培养基中的无机盐成分，其他因素不变。

(8) 吐温80浓度优化：将MRS肉汤培养基中的吐温80的浓度分别调整为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL/L，其他因素不变。

1.2.8 正交优化

采用正交试验法优化发酵条件，根据单因素结果选取对抑菌活性影响显著的3个因素(发酵初始pH值、发酵温度、发酵时间)依据SPSS 26.0生成的三因素三水平正交表(表 1)进行试验，根据乳酸菌CFS抑菌圈直径来评价各条件组合的优劣。

1.2.9 优化验证试验

考虑成本和抑菌效果等因素，选择出最适的碳源、氮源、无机盐成分和吐温80浓度，根据1.2.8节的结果来设置培养条件，参照1.2.2节进行抑菌试验来验证最优发酵条件试验结果。

1.3 数据处理

所有试验均设3个生物学重复，最终结果以“均值±标准差”的形式呈现。原始数据先通过Microsoft Excel 2019进行整理，再使用SPSS 26.0完成显著性检验与正交方差分析，并利用GraphPad Prism 8进行图形绘制。

2 结果与分析 2.1 拮抗S.aureus的乳酸菌筛选

从采集样品中共筛选获得44株对S.aureus有明显拮抗作用的乳酸菌菌株[图 1(a)]，进一步通过过氧化氢酶处理排除过氧化氢以及调整pH值排除有机酸抑菌作用后，获得3株(编号为S13、S15和S27)对S.aureus有较强抑菌效果的菌株，其中来源于南美白对虾肠道的菌株S13抑菌圈直径最大，达(23.47±0.72) mm [图 1(b)]。因此，选择菌株S13作为后续试验菌株。

2.2 菌株鉴定

菌株S13的菌落为乳白色、表面光滑、不透明、呈规则圆形且有明显凸起[图 2(a)]；菌株S13的革兰氏染色结果为阳性[图 2(b)]；扫描电子显微镜下菌体大小为2—5 μm [图 2(c)]。生理生化鉴定结果表明，菌株S13可以利用半乳糖及甘露醇，不能利用阿拉伯糖、鼠李糖和乳糖，甲基红试验结果为阳性(表 2)。将测序获得的16S rRNA序列提交至NCBI，获得登录号PZ509329，进一步比对结果表明，菌株S13与菌株Lactiplantibacillus plantarum NBRC 15891^T 16S rRNA序列的相似度为99.93%，构建系统发育树结果显示，菌株S13与L.plantarumNBRC 15891^T聚为一支，自展支持率为62(图 3)。因此，综合形态学、生理生化及16S rRNA序列分析结果，将菌株S13鉴定为植物乳植杆菌(L.plantarum)。

2.3 菌株S13的生长和拮抗S.aureus活性曲线

如图 4所示，接种0—16 h，菌株S13的OD₆₀₀值迅速升高，pH值快速下降，拮抗S.aureus活性呈现上升趋势，抑菌圈直径从0 mm增加至20 mm左右；20—28 h菌体生长进入稳定期，OD₆₀₀值于28 h到达峰值(1.64)，pH值逐渐趋于稳定(3.17左右)，抑菌代谢产物持续增加，拮抗S.aureus活性于28 h时最强，抑菌圈直径达24.41 mm；28 h后菌体进入衰亡期前期，OD₆₀₀值缓慢下降，pH值维持在3.1左右，抑菌圈直径略微降低，但仍维持24 mm左右，这说明前期积累的抑菌物质仍保持较强拮抗能力。

2.4 菌株S13的CFS拮抗S.aureus的影响因素 2.4.1 蛋白酶敏感性试验

如表 3所示，未处理的CFS对照组抑菌圈直径为(22.71±0.66) mm，抑菌活性显著；经胃蛋白酶处理后的CFS，其抑菌圈直径降至(17.63±0.36) mm，抑菌活性虽有所下降但仍保留较强抑菌效果；而经木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、碱性蛋白酶及中性蛋白酶处理后的CFS，其抑菌活性完全丧失。上述结果表明，菌株S13中的抑菌活性物质对蛋白酶十分敏感，由此推断菌株S13所产生的抑菌活性物质可能主要为蛋白类细菌素。

2.4.2 pH值和热稳定性试验结果

菌株S13 CFS的pH值试验结果(表 4)显示，对照组MRS肉汤培养基本身对S.aureus并无拮抗活性，即使将培养基的pH值调整至3.0时，其对S.aureus的拮抗活性仍很微弱，抑菌圈直径只有(2.36±0.18) mm；当pH值大于4.0时对照组均无抑菌活性。但菌株S13的CFS在pH值为3.0时，抑菌活性最强，抑菌圈直径可达到(23.56±0.23) mm；随着pH值逐步升高至7.0时，抑菌活性呈缓慢下降趋势，但抑菌圈直径仍大于13 mm；当pH值升至8.0及以上时，抑菌活性完全丧失。这表明菌株S13的抑菌活性物质需要在酸性至中性环境下维持，而在碱性环境下会导致其活性完全丧失。

热稳定性试验结果(表 5)显示，在40—100 ℃处理条件下菌株S13的CFS对S.aureus的抑菌活性与对照组无显著差异；即使在121 ℃处理条件下，其抑菌圈直径仍为对照组的97%左右。这表明菌株S13的CFS中的抑菌物质具有良好的热稳定性。综上所述，菌株S13的CFS抑菌活性对环境pH值与温度都具有良好的耐受性，可应用于实际生产。

2.5 菌株S13安全性评价

菌株S13在血琼脂平板上未出现溶血圈，而阳性对照S.aureus出现明显溶血圈，这表明菌株S13不产生溶血素，无溶血活性(图 5)。抗生素敏感性试验结果如表 6所示，菌株S13仅对红霉素、氨苄西林呈低度敏感，对青霉素、哌拉西林、米诺环素和强力霉素等4种抗生素为中度敏感，而对其余14种常见抗生素表现为高度敏感，安全性达标，可作为益生菌候选菌株开展后续研究。

2.6 单因素试验优化结果 2.6.1 发酵条件优化

发酵初始pH值为4.0—6.0时，菌株S13的OD₆₀₀值与抑菌圈直径随pH值升高而增加，当初始pH值为6.0时，二者同时达到最大值，表明该菌株所产抑菌物质与菌体生长同步，初始pH值为6.0时最利于菌体增殖与抑菌代谢产物的合成；但当初始pH值＞6.0时，OD₆₀₀值与抑菌圈直径同时下降，菌体生长及抑菌物质的分泌受到影响[图 6(a)]。综上，菌株S13生长及抑菌物质产生的最优初始pH值为6.0。

发酵温度优化结果表明，发酵温度对菌株的抑菌活性物质产生有显著影响(P＜0.05)。在30—36 ℃范围内抑菌圈直径随温度升高而增大，36 ℃时达到最大值，此时OD₆₀₀值约1.6，抑菌圈直径约23 mm；但当温度高于36 ℃时，菌株抑菌活性显著下降(P＜0.05)。因此，菌株S13的最适发酵温度为36 ℃[图 6(b)]。

发酵时间优化结果如图 6(c)所示，当发酵时间小于6 h时，菌株S13生长处于延滞期，OD₆₀₀值较低，无抑菌活性；当发酵时间为12—24 h时，OD₆₀₀值与抑菌圈直径同时随发酵时间增加而增大，发酵24 h时都达到最大值，表明该时间点菌体增殖充分、抑菌代谢产物积累量最高；当发酵时间大于24 h时，二者均呈缓慢回落趋势，提示延长发酵时间易引发营养耗竭或抑菌产物降解。综上，菌株S13最优发酵时间为24 h。

当接种量为1%—3%(V/V)时，OD₆₀₀值与抑菌圈直径同步上升，3%(V/V)时二者均达到最大值，抑菌圈直径为26.08 mm；但当接种量大于3%(V/V)时，菌体OD₆₀₀值与抑菌圈直径同时下降[图 6(d)]，可能是过高的接种量易引发营养竞争、环境pH值骤变、溶氧匮乏，导致菌体生长和抑菌物质合成受阻。因此，菌株S13发酵最适接种量为3%(V/V)。

2.6.2 培养基优化

碳源优化结果如图 7(a)所示，不同碳源对菌株S13的抑菌活性的影响有明显差异(P＜0.05)。当乳糖为碳源时，菌株的抑菌活性最强，抑菌圈直径可达26.97 mm，此时OD₆₀₀值为1.66；蔗糖为碳源时，抑菌活性虽略低(抑菌圈直径为25.66 mm)，但仍高于其他碳源组，此时的OD₆₀₀值为1.5左右。综合考虑菌体生长、抑菌物质产生及原料成本，选择蔗糖为菌株S13发酵的碳源。

氮源优化结果表明，当玉米浆为氮源时，菌株OD₆₀₀值达到最大，为1.69，抑菌圈直径达23.48 mm；其次为胰蛋白胨，OD₆₀₀值和抑菌圈直径分别为1.51和22.17 mm[图 7(b)]。与胰蛋白胨相比，玉米浆的成本更低，因此，选择玉米浆为菌株S13发酵的最适氮源。

无机盐种类优化结果如图 7(c)所示，不同无机盐对菌株的抑菌活性的调控作用差异显著(P0.05)。当添加乙酸钠时，菌株S13的OD₆₀₀值最大，但抑菌活性基本丧失，可能是乙酸钠虽然对菌株生长有一定的激活作用，但却抑制菌株活性物质的产生；无机盐为硫酸锌时，菌株S13的抑菌活性最好，显著高于其他无机盐添加组，但OD₆₀₀值仅为0.2左右；无机盐为硫酸锰时，菌株S13的抑菌活性仅次于硫酸锌，且OD₆₀₀值大于1.0。因此，选择硫酸锰作为菌株S13发酵最适无机盐。

吐温80浓度对菌株S13的生长及抑菌物质产生有显著的调控作用(P＜0.05)。当吐温80的浓度为0.5—3.0 mL/L时，菌株S13的抑菌圈直径随吐温80浓度的增加均呈上升趋势，3.0 mL/L时达到最大，此时的OD₆₀₀值为1.64，抑菌圈直径为25.38 mm，表明该添加浓度最利于菌株生长及抑菌活性物质的合成；但当吐温80浓度继续升高至3.5 mL/L时，菌株S13的抑菌活性开始下降[图 7(d)]。因此，吐温80最适添加浓度为3.0 mL/L。

2.7 正交优化试验结果

采用正交试验探究单因素试验中对发酵影响较大的发酵初始pH值、发酵温度及发酵时间对S13抑菌活性的影响。极差分析结果显示(表 7)，发酵温度的极差(R=2.97)最大，是影响抑菌活性最显著的因素；其次为初始pH值(R=2.82)，发酵时间(R=1.78)影响相对较小。各因素最优水平为发酵温度36 ℃ (K₂=22.29)、初始pH值为6.5 (K₃=22.57)、发酵时间24 h (K₂=22.10)。综合极差与平均值K值分析，获得较优的发酵工艺组合为发酵温度36 ℃、初始pH值为6.5、发酵时间24 h。

方差分析结果(表 8)显示，发酵温度(P = 0.519)、初始pH值(P = 0.530)、发酵时间(P = 0.702)三因素的P值均大于0.5，未达到统计学显著水平。

2.8 验证试验结果

根据单因素试验和正交优化试验结果，确定菌株S13产抑菌物质的最佳工艺条件为发酵初始pH值为6.5、接种量为3%(V/V)、发酵时间为24 h、发酵温度为36 ℃、碳源为20 g/L蔗糖、氮源为19 g/L玉米浆、无机盐为9.25 g/L硫酸锰、吐温80浓度为3.0 mL/L。在该条件下，菌株S13的抑菌圈直径最大可达(26.90±0.82) mm，较优化前的(23.47±0.72) mm提高了14.61%(表 9)，符合试验预期。

3 讨论 3.1 拮抗菌株的筛选与鉴定

本研究从南美白对虾肠道中筛选获得一株可高效拮抗S.aureus的乳酸菌S13，其CFS抑菌圈直径可达(23.47±0.72) mm。这表明该菌株特性和生境特性有着很高的关联性：虾肠道中含有丰富的蛋白质、脂质及可溶性营养成分，在发酵过程中易形成有利于拮抗微生物增殖的微环境^[25]。传统乳制品来源的乳酸菌多以调控发酵风味为主要功能，对S.aureus的针对性拮抗作用有限，从特殊生境中筛选具有强拮抗活性的乳酸菌^[26]，能够有效丰富抗S.aureus乳酸菌的资源库。进一步运用形态学观察、生理生化特征、16S rRNA基因序列分析等菌株鉴定综合手段，保障了菌种分类的准确性，为后续抑菌机制、工艺优化研究奠定了可靠的菌种基础。

3.2 乳酸菌抑菌物质的理化特性与应用潜力解析

乳酸菌生长代谢过程中可产生乳酸，同时会分泌细菌素、乳酸菌素、双乙酰、过氧化氢、胞外肽聚糖等多种抑菌活性物质，从而形成复合抑菌体系，其中乳酸通过降低环境pH值，破坏致病菌细胞膜稳定性、抑制胞内酶活性与物质代谢，对腐败菌、革兰氏阴性/阳性致病菌均有广谱抑制作用。菌株S13的CFS理化特性分析表明其抑菌物质对胃蛋白酶部分敏感，对木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、碱性蛋白酶和中性蛋白酶高度敏感，推断菌株S13的核心抑菌成分为蛋白类细菌素。前人也有类似研究报道，如孙庆申等^[27]和许晓燕等^[28]研究发现，乳酸菌抑菌物质对蛋白酶K、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶敏感，从而确定其抑菌物质为细菌素。菌株S13的CFS具有pH稳定性，在pH值为3.0—7.0时能够维持较高抑菌活性，此范围与多数食品所处的酸碱度区间相符合，适宜用于酸奶、果汁等酸性食品的防腐；经121 ℃高温处理30 min后其抑菌圈直径为(23.57±0.19) mm，为对照组的97%左右，而多数乳酸菌的抑菌活性(如乳链菌肽Nisin)在80 ℃以上就开始显著下降^[29]，表明菌株S13的抑菌物质能够耐受食品加工过程中的高温灭菌。综合考虑无溶血活性试验结果，菌株S13的抑菌物质在食品生物防腐方面展现出明显的应用潜力，能够替代化学防腐剂来降低食品被S.aureus污染的风险。

3.3 菌株发酵工艺优化及成本

本研究运用单因素试验、正交试验对菌株S13发酵工艺进行了优化，从而明确影响菌株产生抑菌活性物质的关键因素。极差分析表明发酵温度属于最有影响力的因素(R=2.97)，在36 ℃时，菌株S13的抑菌活性达到最大，此时OD₆₀₀值约1.6，这说明该温度处于乳酸菌代谢酶系的最适活性区间，既能够保证菌体的增殖效率，又可以促进抑菌物质的合成。发酵温度、初始pH值、发酵时间三因素的P值均大于0.5，未达到统计学显著水平，原因可能是前期单因素试验获得的发酵温度(33—39 ℃)、初始pH值(5.5—6.5)、发酵时间(18—30 h)均为该菌株产抑菌物质的较优区间，所以抑菌活性的变化波动较小；另一个原因可能是抑菌活性通过平板抑菌圈直径进行测定，测定过程可能会有一定的误差，从而导致统计分析不显著。具体原因及最优发酵工艺有待进一步验证。

本研究采用分阶段优化策略，正交试验仅针对发酵温度、发酵初始pH值、发酵时间开展优化，未将培养基组分纳入综合正交设计。主要原因是发酵条件与培养基组分两类因素数量多、交互作用复杂，合并设计会造成试验规模大幅增加，具有一定难度；分阶段优化可分开解析发酵条件和培养基成分的作用规律，试验设计更具针对性。但该设计也存在一定局限性，后续将会进一步补充培养基成分正交试验，并结合响应面法开展发酵条件与培养基成分的联合优化。

在培养基成分优化过程中，碳源选用蔗糖，而不是抑菌活性最优的乳糖；氮源选用抑菌效果最好的玉米浆来替代胰蛋白胨。核心考虑的是工业应用中的成本，蔗糖和乳糖的抑菌圈直径相似，但蔗糖价格仅为乳糖的1/3，玉米浆作为农业副产物，其成本相较于纯化学氮源降低40%以上^[30-31]，并且二者都能够满足菌株生长、抑菌物质合成的需求。在优化无机盐成分时，硫酸锌试验组的抑菌圈直径虽然最大，但是OD₆₀₀值较低。推测其原因可能是锌离子浓度过高，而锌离子本身具有抑菌活性^[32]，因此该组的抑菌效果可能主要来源于锌离子的直接作用，而非菌株S13产生的抑菌物质，这不符合本试验的目标。相比之下，硫酸锰试验组的OD₆₀₀值与抑菌圈直径均表现优异，说明锰离子作为关键酶的辅基，能有效促进菌株生长代谢及抑菌物质合成，且本身无明显抑菌效果。因此，最终选定硫酸锰作为培养基中的无机盐成分。吐温80最适浓度为3.0 mL/L，当浓度继续升高时抑菌效果反而迅速下降，这可能是因为在发酵液中添加适量的吐温80可诱导抑菌物质的合成并释放到胞外，进而提高发酵液中抑菌物质活性与抑菌能力；但浓度过高的吐温80会破坏细胞膜结构，抑制乳酸菌代谢，反而降低抑菌物质产量与抑菌效果^[5]。本次优化综合考量了抑菌活性、生产成本与工艺可操作性，避免了单纯追求活性峰值却忽视产业化可行性的局限，为后续的规模化发酵提供了参考。

4 结论

本研究从南美白对虾肠道筛选获得一株对S.aureus具有显著拮抗效果的乳酸菌S13，抑菌圈直径可达(23.47±0.72) mm，经形态学、生理生化及分子生物学等手段鉴定为植物乳植杆菌(L.plantarum)；蛋白酶敏感性、pH值及热稳定性等试验结果表明，该菌株所产抑菌物质为蛋白类细菌素；进一步利用血琼脂平板法及抗生素敏感性试验证明该菌株为安全性菌株；最后优化获得了该菌株产抑菌物质发酵工艺：初始pH值为6.5、温度为36 ℃、时间为24 h、接种量为3%(V/V)、碳源为20 g/L蔗糖、氮源为19 g/L玉米浆、无机盐为9.25 g/L硫酸锰、吐温80浓度为3 mL/L，在该工艺条件下，菌株S13的CFS抑制活性较优化前提高了14.61%。综上，本研究筛选获得的L.plantarum S13对S.aureus的拮抗效果较好，安全性高，为开发新型食品防腐剂提供了优良的乳酸菌资源。