无患子(Sapindus mukorossi)，别名木患子、油珠子，是无患子科(Sapindaceae)无患子属(Sapindus)落叶乔木，主要分布于我国淮河以南地区，多作为庭荫树、行道树种植^[1]。无患子在我国的应用历史悠久，果实、根、叶片和种仁均可入药，可治疗咳喘、肿毒、疳积等疾病，果皮可用于杀虫消积，有洗面养颜之效^[2-3]。现代研究表明，无患子的假种皮中富含无患子果皮皂苷和常春藤皂苷元，是天然的生物表面活性剂，具有去污^[4]、抗炎、抗菌^[5]、抗氧化、抗病毒和洗锈^[6]等多种生物活性。

朱朝阳等^[7]研究发现无患子果皮皂苷粗提液对大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、白色葡萄球菌(Staphylococcus albus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)具有不同程度的抑制作用，其中对酿酒酵母的抑制作用最好，在样品浓度为111.9 mg·mL^-1时抑菌率高达68.4%。Dai等^[8]研究发现无患子果肉提取物及其组分具有显著抑制红花车轴草(Trifolium pratense)和狗牙根(Cynodon dactylon)的根伸长作用，可开发为新的杂草控制剂。Wei等^[9]研究发现从无患子中提取到的两种皂苷可通过攻击细胞膜抑制痤疮皮肤杆菌(Cutibacterium acnes)的生长，并具有协同增效作用。Selvaraj等^[10]研究表明无患子甲醇提取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜的形成具有明显的抑制作用。张宸搏等^[11]对无患子种质资源树形和叶片表型多样性进行了研究，揭示了无患子叶片表型与叶皂素含量的相关性，发现无患子叶皂素含量与叶片的大小、面积呈负相关关系，即叶片越大，皂素含量反而越低；无患子叶皂素含量与复叶长呈正相关关系。目前对无患子的研究多集中于果皮皂苷的抗炎、除草和抑菌等生物活性，而对果实表型性状与皂苷含量的相关性以及皂苷对植物病原菌的抑制活性等方面的研究较少。因此，本研究拟通过对贵州省黔南布依族苗族自治州独山县10株无患子实生单株的果实横径、纵径、侧径和果重等果实表型性状以及果皮中的常春藤皂苷元含量进行测定，利用Pearson相关性分析探究果实表型性状与常春藤皂苷元含量间的相关性，并采用抑菌圈法和菌丝生长速率法分别测定无患子果皮皂苷对植物病原细菌和植物病原真菌的抑制活性，以期为筛选高皂苷含量的无患子优良单株提供思路，为无患子资源的综合开发和利用提供理论参考。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 供试植物

无患子实生单株A1-A5于2022年11月采自贵州省黔南布依族苗族自治州独山县上司镇上司村香妃庄园(25.6°N，107.5°E，海拔1 000 m)；无患子实生单株B1-B5采自贵州省黔南布依族苗族自治州独山县下司镇喇寨(25.4°N，107.4°E，海拔920 m)，共计10份(每份150个)果实样本。样品采集后，立即送回实验室。

1.1.2 供试菌株

供试真菌包括广西炭疽菌(Colletotrichum guangxiense)、杜英生假隐从赤壳菌(Pseudocrypjonectria elaeocarpicola)、假可可毛色二孢菌(Lasiodiplodia pseudotheobromae)、竹炭疽菌(Coltotrichum bambusicola)；供试细菌包括根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens，G^-)、青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum，G^-)、番茄疮痂病菌(Xanthomonas vesicatoria，G^-)、枯草芽孢杆菌(G⁺)和溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus，G⁺)，以上菌株均由华南农业大学林学与风景园林学院植物与微生物健康实验室提供。

1.1.3 培养基

LB培养基(Luria-Bertani medium)用于供试细菌的培养和抗细菌活性的测定，其配方为氯化钠5 g、酵母浸膏5 g、蛋白胨10 g、琼脂20 g，加去离子水定容至1 000 mL。121 ℃湿热灭菌20 min，备用。LB液体培养基不加琼脂。

马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基用于供试真菌的培养和抗真菌活性的测定，其配方为马铃薯200 g、琼脂20 g、葡萄糖20 g，加去离子水定容至1 000 mL。121 ℃湿热灭菌20 min，备用。

1.1.4 主要试剂及仪器设备

硫酸链霉素(99%)购自美国Sigma公司；氯化钠、95%乙醇等均为国产分析纯，购自天津市富宇精细化工有限公司。JA2003N分析天平(上海精密科学仪器有限公司)，DL91150游标卡尺(宁波得力工具有限公司)，DSY-9143B-2烘箱(广州市深华生物技术有限公司)，LC-16高效液相色谱仪[HPLC，泵(DGU-20A3R)，二极管检测器(SPD-M20A)，自动进样器(SIL-16)，柱温箱(CTO-16L)，岛津企业管理(中国)有限公司]；C₁₈色谱柱(250 mm × 5 mm，5 μm，WONDASIL38020-41，美国Welch科技公司)，ZQ-1三用紫外仪(上海安亭科学仪器厂)。

1.2 果实表型性状测量

每份果实样本分别随机选出30个果实，使用游标卡尺(精度为0.01 mm)测量每个果实的横径、纵径和侧径(图 1)，使用高精度分析天平(精度为0.000 1 g)称量单果鲜重，使用分析天平(精度为0.01 g)称量百粒重。

1.3 含水量测定

每份果实样本分别随机取出45个果实分成3组，每组15个，称量并记录果实鲜重后分别放置于广口瓶中，50 ℃烘箱中烘干，待果实达到恒定的质量后，称量并记录果实干重数据。用剪刀将干燥后的果皮和种子分离，使用分析天平分别称量并记录数据，种子分成种皮和种仁后再次称量并记录数据。含水量(M)的计算公式如下：

$ M(\%)=\frac{M_1-M_2}{M_1} \times 100 \%, $

式中，M₁为每组果实鲜重(g)，M₂为每组果实干重(g)。计算出每组含水量后，取3组求平均值，即为无患子果实中的含水量。

1.4 常春藤皂苷元及无患子果皮皂苷的HPLC定量分析 1.4.1 色谱条件

流动相为含0.01%三氟乙酸的乙腈和水，流速为1 mL·min^-1，色谱柱温度为40 ℃，进样量为20 μL。色谱条件：0-2 min，30%的乙腈等度洗脱；2-40 min，乙腈浓度由30%线性递增到60%洗脱；40-50 min，60%的乙腈等度洗脱；50-55 min，乙腈浓度由60%线性递增到100%洗脱。采用二极管阵列检测器进行检测。

1.4.2 供试品溶液制备

准确称量1 g烘干后的无患子果皮，粉碎后放入50 mL离心管中，按1∶6的比例加入95%乙醇，于室温下冷浸提取3 d，提取3次后合并果皮皂苷液，过滤，使用氮吹仪吹干至恒重，得到无患子果皮皂苷，将其溶解在5 mL的甲醇-水(85∶15，V∶V)溶液中，过0.22 μm的滤膜后于4 ℃下保存备用。取1 mL甲醇-水(85∶15，V∶V)溶液作为空白对照溶液。

1.4.3 标准品溶液配制

精确称取1 mg常春藤皂苷元标准品，置于1.5 mL离心管中，加入1 mL的甲醇-水(85∶15，V∶V)溶液配成浓度为1 000.00 μg·mL^-1的母液，然后用甲醇-水(85∶15，V∶V)溶液依次稀释成500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63 μg·mL^-1的样品溶液，过0.22 μm的滤膜后于4 ℃下保存备用。按照1.4.1节的色谱条件，对标准品溶液进行HPLC分析，建立常春藤皂苷元的峰面积(Y)与实际进样量(X)的标准曲线，线性回归方程为Y=339155X+ 23163(R²=0.999 7)，常春藤皂苷元在0.31-20.00 μg内具有良好的线性关系。

1.4.4 无患子果皮中常春藤皂苷元含量测定

分别精密称取10份1 g的无患子果皮，按照1.4.2节的方法制备供试品溶液，按照1.4.1节的色谱条件进行HPLC分析，重复3次，记录峰面积，计算无患子果皮中常春藤皂苷元的含量。

1.4.5 精密度试验

取标准曲线线性较好的高(1 000.00 μg·mL^-1)、中(125.00 μg·mL^-1)、低(15.63 μg·mL^-1)3个浓度，在同一天内重复进样5次，经HPLC分析后记录峰面积并计算相对标准偏差(RSD)，从而计算日内精密度；对上述3个样品连续进样3 d，每天重复3次，经HPLC分析后记录峰面积，计算RSD，由此得出日间精密度。常春藤皂苷元在3个水平上的日内精密度和日间精密度的RSD均值分别为1.02%和0.76%，均小于2%，说明在此试验条件下精密度良好(表 1)。

1.4.6 稳定性试验

精密吸取供试品溶液20 μL注入HPLC，按照1.4.1节的色谱条件分别于0、6、8、12、18、24 h进样，于210 nm波长下测定，记录峰面积并计算RSD。常春藤皂苷元的RSD为1.75%，样品溶液在24 h内的稳定性良好。

1.4.7 回收率试验

精密称取已知含量的同一批次的无患子果皮样品，分别加入0.5、1.0、2.0倍的常春藤皂苷元标准品，按照1.4.2节的方法制备供试品溶液，经HPLC分析后记录峰面积，计算加标回收率和RSD。常春藤皂苷元加标回收率的平均值为94.9%，RSD的平均值为1.1%(表 2)，较高的加标回收率和较小的RSD证明了该方法的适用性。

1.5 无患子果皮皂苷抗细菌活性测定

精确称取无患子果皮皂苷80 mg，加入0.3 mL二甲基亚砜(DMSO)，待完全溶解后再加入0.7 mL无菌水，得到浓度为80 mg·mL^-1的供试样品。抗细菌活性的测定参照伍慧雄等^[12]的方法并有所改进。供试细菌由于长期保存在-20 ℃条件下，在活性测定前，先用LB培养基进行活化培养(28 ℃，黑暗)48 h，然后挑取单菌落，在LB液体培养基中摇培(28 ℃，黑暗，150 r/min)24 h，将菌液浓度稀释到10⁸ CFU·mL^-1备用。倒好平板后，用移液枪分别吸取50 μL菌液，用玻璃棒涂板。使用灭菌的打孔器在涂有细菌的LB培养基上均匀打出直径为6 mm的4个小孔，分别在每个小孔中加入20 μL的供试样品，供试样品的最终有效质量分别为1.6、0.8、0.4、0.2 mg。4个样品重复处理3次，在黑暗条件下培养24 h，用游标卡尺测量抑菌圈大小。阳性对照为5 μL 2 mg·mL^-1的硫酸链霉素。

1.6 无患子果皮皂苷抗真菌活性测定

采用带毒平板法测定无患子果皮皂苷对3种病原真菌的室内毒力^[13]。精确称取无患子果皮皂苷90 mg，加入0.3 mL DMSO，待完全溶解后再加入0.7 mL无菌水，采用倍半稀释法，用30% DMSO依次稀释成8个不同的浓度。将配制好的不同浓度的提取物分别吸取1 mL加入44 mL的PDA培养基(灭菌，冷却至60 ℃)中，充分混匀后倒入3个无菌的培养皿中，每皿约15 mL，制成含药培养基，得到供试样品的终浓度分别为1 000.00、500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、7.81 μg·mL^-1。用灭菌的打孔器将培养5 d且生长良好的待测病原菌沿边缘打成直径为6 mm的菌饼，菌饼朝下接种于含药PDA培养基上。以加入无菌水的PDA培养基为空白对照，以加入30% DMSO的PDA培养基为阴性对照，以加入98.4%多菌灵的PDA培养基为阳性对照，每个处理重复3次。将配置好的培养基置于28 ℃下培养5 d，待空白对照组的菌落生长至占培养皿面积的2/3时，采用十字交叉法测得不同处理下的菌落直径并计算抑菌率。抑菌率计算公式如下：

$ \rm 纯生长量(mm)=菌落平均直径(mm)－菌饼直 \\ \rm 径(mm), \\ \text { 抑菌率 }(\%)= \\ \frac{\text { 阴性对照菌落纯生长量 }(\mathrm{mm})-\text { 处理菌落纯生长量 }(\mathrm{mm})}{\text { 阴性对照菌落纯生长量 }(\mathrm{mm})} \times \\ 100 \% \text { 。} $

计算不同浓度下的抑菌率，以不同果皮皂苷浓度的对数值为横坐标，以抑菌率的生物统计概率值为纵坐标，得到毒力回归方程和回归系数，同时计算出半数有效浓度(EC₅₀)，比较无患子果皮皂苷对不同病原菌的抑制效果。

1.7 数据处理

采用Excel 2013对数据进行统计分析，采用Origin 2022进行单因素方差分析、Pearson相关性分析^[14]和多重比较并绘制相关性热图，采用GraphPad Prism 8.0.2对数据进行整理并绘图。

2 结果与分析 2.1 无患子果实表型性状

10份无患子果实样品及表型性状分别见图 2和表 3。无患子果实横径为19.31-27.33 mm，均值为22.27 mm；果实纵径为17.48-22.28 mm，均值为19.73 mm；果实侧径为16.16-22.87 mm，均值为18.71 mm；单果鲜重为2.52-6.41 g，均值为4.08 g；百粒重为251.47-641.12 g，均值为407.97 g。其中，B4果实的横径、纵径和侧径均最大，与其他样品相比具有显著性差异(P < 0.05)；B1果实的横径、纵径和侧径均最小，与其他样品相比具有显著性差异(P < 0.05)；单果鲜重、百粒重由高到低依次为B4、A2、A4、B5、A5、B3、A1、A3、B2、B1。

2.2 无患子果实质量和含水量

10份无患子果实鲜重为36.72-96.44 g，果实干重为31.49-82.91 g。果实质量(鲜重和干重)最大的为B4，最小的为B1，与其他样品相比均具有显著性差异(P < 0.05)。果皮干重为15.38-57.62 g，由高到低依次为B4、A2、A4、B2、A1、B3、A5、A3、B5、B1。种子干重为16.11-27.07 g，种皮干重为11.69-19.95 g，种子干重和种皮干重最大的均为A2，最小的为B1；种仁干重为3.53-6.77 g，种仁干重最大的为A2，最小的为A5。含水量为12.51%-23.58%，B5含水量最大，A1含水量最少(表 4)。

2.3 无患子果皮中常春藤皂苷元含量

干果中常春藤皂苷元含量的均值为12.09 mg·g^-1，最高的为B1(16.12 mg·g^-1)；鲜果中常春藤皂苷元含量的均值为10.04 mg·g^-1，最高的为B1(13.82 mg·g^-1)。除了常春藤皂苷元，另选取6个皂苷来计算总皂苷含量，其中干果中总皂苷含量的均值为106.02 mg·g^-1，最高的为B1(135.09 mg·g^-1)；鲜果中总皂苷含量的均值为86.08 mg·g^-1，最高的为B1(115.87 mg·g^-1)。B1干果和鲜果中常春藤皂苷元含量与其他样品相比具有显著性差异(P＜0.05)，而A1、A2、A5、B2、B3、B4、B5鲜果中总皂苷含量无显著性差异(P>0.05)(表 5)。

2.4 无患子果实表型性状与常春藤皂苷元含量的Pearson相关性分析

无患子果实样品的14个性状可划分为果实表型性状(S1-S12)和品质性状(S13、S14)。Pearson相关性分析结果(图 3)表明，果实表型12个性状中，除含水量(S8)与其他性状无显著相关外，果实质量(S2和S3)、果实纵径(S10)、果实横径(S9)、种子干重(S5)等与其他性状均呈显著正相关。无患子两个品质性状指标间呈显著正相关。常春藤皂苷元含量(S13)与总皂苷含量(S14)的相关系数为0.92，即常春藤皂苷元的含量越高，总皂苷含量越高。果实表型性状与品质性状多数无显著相关性，但常春藤皂苷元含量与果实鲜重(S2)、果实干重(S3)、果皮干重(S4)、果实横径(S9)、果重(S12)呈显著负相关。其中，常春藤皂苷元含量与果皮干重的负相关系数最大(-0.43)，即皮薄、果小而轻的无患子果实中常春藤皂苷元含量越高。总皂苷含量仅与果皮干重呈显著负相关，负相关系数为-0.42，即果皮越薄，总皂苷含量越高。

2.5 无患子果皮皂苷抗细菌活性

无患子果皮皂苷对5种供试细菌均表现出抑菌活性(图 4)。其中，当供试样品有效质量小于1.6 mg时，无患子果皮皂苷对溶血葡萄球菌、番茄疮痂病菌和枯草芽孢杆菌的抑菌效果显著高于根癌土壤杆菌(P < 0.05)；当供试样品有效质量为0.2 mg时，无患子果皮皂苷对番茄疮痂病菌的抑菌活性显著高于其他细菌(P＜0.05)，抑菌圈直径为10.31 mm；当供试样品有效质量大于0.4 mg时，无患子果皮皂苷对溶血葡萄球菌、青枯雷尔氏菌和枯草芽孢杆菌的抑菌活性较强，抑菌圈直径大于10 mm；当供试样品有效质量为1.6 mg时，无患子果皮皂苷对溶血葡萄球菌的抑菌活性显著高于其他细菌(P＜0.05)，抑菌圈直径大于15 mm，且对所有菌的抑菌效果均高于链霉素。

2.6 无患子果皮皂苷抗真菌活性

无患子果皮皂苷对杜英生假隐从赤壳菌、广西炭疽菌、竹炭疽菌的抑制活性如表 6所示。其中，无患子果皮皂苷对广西炭疽菌的抑制活性最强，EC₅₀值为36.30 μg·mL^-1；对竹炭疽菌的抑制活性次之，EC₅₀值为57.75 μg·mL^-1；对杜英生假隐从赤壳菌的抑制活性最弱，EC₅₀值为65.31 μg·mL^-1。无患子果皮皂苷的抑菌活性均低于阳性对照多菌灵。由于在无患子果皮皂苷浓度为2 mg·mL^-1的预实验中，对假可可毛色二孢菌未表现出抑制活性，因此未对其进行进一步试验。

3 讨论

本研究对无患子果实横径、侧径、纵径及果重等果实表型性状指标进行测定，结果显示B4是最优果实，所有表型性状均最高；Pearson相关性分析发现果实质量与果实纵径、果实横径和种子干重存在显著正相关，这与李永祥等^[15]得出的无患子果实质量与果实纵径、侧径性状具有显著正相关的研究结果相似。无患子果皮中主要的活性成分为皂苷，具有良好的去污、起泡、抗菌、去屑止痒、抗炎、抗氧化等生物活性，因此皂苷含量已成为无患子良种选育的关键指标^[16]。本研究发现无患子总皂苷含量与其果皮干重呈显著负相关，表明失水后果皮越薄、果越小的无患子果实中总皂苷含量越高，其中B1果实品质性状最优，总皂苷含量最高。此外，皂苷含量与产地也有较高的相关性，但汉龙等^[17]研究发现我国西南地区无患子皂苷的平均含量高于中东部地区；范辉华等^[18]研究发现优树选择指标(包括胸径、树高、树龄、冠幅面积等形态特征)及其生境因子(如海拔高度、年降水量、年平均气温)也会影响皂苷的积累代谢过程。本研究的样品均采自贵州省黔南布依族苗族自治州独山县，样本来源的地域局限性可能在一定程度上影响研究结果的普适性，后续还需进一步分析比较不同地域无患子果皮皂苷含量的差异。值得注意的是，果皮中的皂苷含量在不同时期是动态变化的，郑玉琳等^[19]研究发现无患子果皮皂苷的含量在10月中上旬保持较高水平。因此，在进行良种选育前应充分注意采样时间。无患子果皮皂苷种类丰富，包含多种齐墩果酸型三萜皂苷与大戟烷型三萜皂苷，本研究只测定了常春藤皂苷元的含量，后续研究可进一步拓展评价范围，将多种皂苷类化合物的含量纳入考量，并且不仅局限于果实，不同组织中的皂苷含量也应予以关注，从而建立更完善的无患子良种筛选体系^[20-21]。

近年来随着无患子产业的迅猛发展，无患子果皮皂苷抑制植物病原菌活性的研究也日趋增多。Li等^[22]使用无患子皂苷液对白色念珠菌(Candida albicans)进行培养，结果表明无患子皂苷对白色念珠菌早期生物膜的形成具有良好的抑制作用，能破坏菌丝的表面形态，并显著降低菌丝表面的疏水性和黏附性。赫文琦等^[23]研究表明无患子果皮皂苷液对桉树溃疡病菌(Lasiodiplodia theobromae)、猕猴桃腐烂病菌(Neofusicoccum parvum)和欧美杨树溃疡病菌(Lonsdalea quercina subsp.populi)的抑制作用随着皂苷液质量浓度的增大而增强；Porsche等^[24]研究表明无患子果皮皂苷液对苹果黑星病菌(Venturia inaequalis)和灰霉菌(Botrytis cinerea)有抑制效果，对菌丝生长的抑制率分别为45%和43%；彭玉萌等^[25]利用琼脂稀释法评价分离纯化后的无患子果皮皂苷的生物活性，发现其对稻瘟病病菌(Pyricularia grisea)具有较好的抑制作用。本研究表明无患子果皮皂苷对根癌土壤杆菌、枯草芽孢杆菌、青枯雷尔氏菌、广西炭疽菌均表现出抑制活性，抑菌效果随无患子果皮皂苷有效质量的增加而增强，这说明无患子果皮皂苷具备作为天然抑菌剂开发的潜力。尽管本研究对无患子果皮中的皂苷含量与抑菌活性的量效关系进行了探究，但仍存在局限性，如未对皂苷单体成分进行分离鉴定，关于不同结构皂苷的协同效应还需进一步研究。

4 结论

本研究探究了不同单株无患子果实的表型性状与皂苷含量的关联性，并进一步评估了无患子果皮皂苷的抑菌活性。结果表明，B4果实表型性状最优，B1果实品质性状最优；常春藤皂苷元含量与果实鲜重、果实干重、果皮干重、果实横径、果重呈显著负相关，其中与果皮干重负相关系数最大，为-0.43；无患子果皮皂苷对番茄疮痂病菌表现出最强的抗细菌活性，而对广西炭疽菌表现出最强的抗真菌活性。本研究明确了无患子果实表型性状与皂苷含量的关系，证实了无患子果皮皂苷对多种植物病原菌有抑制活性，可为无患子果皮皂苷的开发和利用以及植物源杀菌剂的研发提供理论依据，有利于无患子产业和我国农业绿色可持续发展。