2. 宜宾职业技术学院五粮液技术与食品工程学院, 四川宜宾 644003;
3. 广西科学院, 广西南宁 530007
2. Wuliangye College of Technology and Food Engineering, Yibin Vocational and Technical College, Yibin, Sichuan, 644003, China;
3. Guangxi Academy of Sciences, Nanning, Guangxi, 530007, China
甘蔗作为重要的糖料作物之一，被广泛种植于热带和亚热带地区[1, 2]。据联合国粮食及农业组织统计数据库(FAOSTAT)统计，2020年我国甘蔗产量和种植面积分别为1.09×108 t和1.4×106 hm2，在世界上排名分别为第三名和第四名[3-5]。甘蔗渣是甘蔗压榨制糖后的废弃物，目前全世界的甘蔗渣年产量为5.13×108 t[6]。我国约有50%的甘蔗渣被用于燃烧发电，这不仅会造成环境污染，而且会有大量的甘蔗渣未被利用[7, 8]。未被及时利用的甘蔗渣，就需要考虑回收和储存的问题。压榨后的甘蔗渣含有约50%的水分，一定量的可溶性糖、粗蛋白质和木质纤维素，如果储存管理不到位，很容易滋生微生物，从而产生霉变[9-11]。厌氧发酵产沼气技术是一种清洁且很有前景的技术，目前已有研究者对甘蔗渣产沼气进行了研究[12, 13]。甘蔗渣厌氧发酵的研究大多集中在提高沼气产量上，如预处理和共消化[14, 15]。在各种预处理方法中，微生物预处理因其环境友好，不需要消耗能量和化学物质而经常被使用[16]。但是，微生物预处理木质纤维素生物质时间长，且其产沼气的效果难以控制，有时还会出现产气量降低的结果[17, 18]。
目前，关于甘蔗渣霉变对其厌氧发酵产沼气的影响以及其沼气产量下降的原因的研究较少。因此，本研究对正常和霉变的甘蔗渣进行厌氧发酵产沼气研究，比较其内在结构、理化性质、发酵参数和物质去除率，分析甘蔗渣霉变后沼气产量下降的原因，以期为甘蔗渣的储存和沼气生产提供参考。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 厌氧发酵接种物厌氧发酵接种物为实验室常用污泥[19]，甘蔗渣由广西糖蔗压榨获得。甘蔗渣自然放置于实验室储藏室1个月后，从中挑选出正常的、没有长霉的甘蔗渣(SCB-C)和霉变的甘蔗渣(SCB-R)。将甘蔗渣剪成1 cm×1 cm×1 cm块状，用于厌氧发酵。
1.1.2 主要试剂盐酸、浓硫酸、乙二醇乙醚购自廉江市爱廉贸易有限公司，重铬酸钾购自中国医药公司北京采购供应站，乙二胺四乙酸二钠、苯酚购自国药集团化学试剂有限公司，邻苯二甲酸氢钾、丙酮购自天津市大茂化学试剂厂，亚硝基铁氰化钠、硫酸银、次氯酸钠购自生工生物工程(上海)股份有限公司，十六烷基三甲胺溴、十二烷基硫酸钠购自阿拉丁试剂(上海)有限公司。
1.1.3 主要仪器GC9790-Ⅱ气相色谱仪(浙江福立分析仪器股份有限公司)，GC-1120气相色谱仪(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)，PHS-3C型pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)，SX2-5-12A箱式电阻炉(上海索域试验设备有限公司)，HWXL-9420A恒温烘箱(上海精宏实验设备有限公司)，HH-6恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)，Elx800全自动酶标仪(美国BioTek公司)，扫描电子显微镜(FEI Quattro S，美国赛默飞公司)。
1.1.4 厌氧发酵反应器厌氧发酵装置如图 1所示。厌氧发酵反应器为2.5 L的玻璃容器，容器口用相应尺寸的硅胶塞盖紧，硅胶塞上开两个孔，一个连接气体收集袋，用于收集厌氧发酵产生的沼气，另一个用于发酵液取样。
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| 图 1 厌氧发酵反应器 Fig.1 Anaerobic fermentation reactor |
1.2 方法 1.2.1 厌氧发酵试验设计
厌氧发酵试验分两组进行，即SCB-C组和SCB-R组。两组采用相同的发酵体系，即底物浓度为7.5 g VS/L，接种物与底物的比例为1∶1 (基于VS)，最后添加自来水至工作体积2.2 L。在35 ℃恒温水浴下，厌氧发酵35 d，每天手动摇匀两次。厌氧发酵开始后，每天对沼气进行测定，12 d后每2 d或4 d对沼气测定1次。在厌氧发酵过程中，每隔2-3 d采集发酵液，对发酵过程参数pH值、总氨氮(Total Ammonia Nitrogen, TAN)、溶解性化学需氧量(Soluble Chemical Oxygen Demand, SCOD)和总挥发酸(Total Volatile Fatty Acids, TVFA)进行测定。
1.2.2 样品表征甘蔗渣的微观形态采用扫描电子显微镜在2 000倍的情景下进行表征。
1.2.3 测定方法含水量、总固体(Total Solids，TS)、挥发性固体(Volatile Solids，VS)采用干重法测定[20]，TS和VS去除率分别采用甘蔗渣沼气发酵前后TS和VS重量减少的百分比来表示；pH值由pH计测定；SCOD参照APHA标准方法测定[21]；TAN采用靛酚蓝比色法测定[22]；TVFA使用气相色谱仪测定[23]；可溶性糖采用苯酚-硫酸法测定[24]；木质纤维素采用范氏(Van Soest)洗涤法测定[25]；总氮使用凯氏定氮法测定[26]。沼气产量用带刻度的针筒从集气袋中抽取进行测定，沼气中甲烷含量用气相色谱仪测定[12]。
1.3 数据处理每个试验均设置3个平行，试验结果采用均值±标准差表示，用Microsoft Office Excel 2019和GraphPad Prism 9进行数据处理和绘图。
2 结果与分析 2.1 甘蔗渣微观形态甘蔗渣的微观形态如图 2所示。从图 2(a)、(b)可以看出，SCB-C的外表面和内部结构均较为光滑平坦，且表面附着物少；其内部骨架清晰，孔隙均匀，未受到明显破坏，结构完整。从图 2(c)可以看出，SCB-R的外表面存在较多附着物，结构粗糙。从图 2(d)可以看出，SCB-R内部骨架因大量的附着物覆盖而难以辨别，还存在较多的菌丝和真菌。由此可知，经过储存后，霉变会对甘蔗渣的形态结构造成显著的影响。
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| 图 2 甘蔗渣外表面和内部结构的SEM图(×2 000) Fig.2 SEM images of sugarcane bagasse′s outside surface and internal structure (×2 000) |
2.2 甘蔗渣理化指标分析
两种甘蔗渣样品的理化指标分析结果如表 1所示。由表 1可知，甘蔗渣发生霉变后其含水量(56.8%)会保持较高水平，是正常储存的甘蔗渣含水量(12.8%)的4.4倍。SCB-R组中的总固体率与SCB-C相比有所下降，但两者的挥发性固体则相对一致。此外，SCB-C组和SCB-R组中的可溶性糖含量分别为10.9、0.5 mg/g，可见甘蔗渣霉变后其可溶性糖几乎被消化完，下降幅度达到95.4%。SCB-R组中的总氮含量为51.7 mg/g，比SCB-C组提高48.6%。SCB-R组的纤维素、半纤维素和酸不溶性木质素含量均高于SCB-C组，可能与可溶性糖的急剧消耗有关。SCB-R组中的纤维素含量较高(43.8%)，使其结晶聚合物的比例增加，加之难以消化的酸不溶性木质素含量高(10.3%)和可溶性糖含量较低，这些指标都表明霉变的甘蔗渣在厌氧消化中的表现不如正常的甘蔗渣。
| 样品 Sample |
含水量/(%，w/w) Water content/(%，w/w) |
总固体率/(%，w/w) Total solids rate/(%，w/w) |
挥发性固体/(%, TS) Volatile solids/(%, TS) |
可溶性糖/(mg/g) Soluble sugar/(mg/g) |
总氮/(mg/g) Total nitrogen/(mg/g) |
纤维素/(%, TS) Cellulose (%, TS) |
半纤维素/(%, TS) Hemicellulose (%, TS) |
酸不溶性木质素/(%, TS) Acid insoluble lignin/(%, TS) |
| SCB-C | 12.8±0.7 | 87.2±0.7 | 94.9±1.8 | 10.9±0.4 | 34.8±2.3 | 33.3±1.2 | 22.8±1.1 | 6.7±1.1 |
| SCB-R | 56.8±1.9 | 43.2±1.9 | 95.2±1.5 | 0.5±0.1 | 51.7±4.2 | 43.8±3.0 | 29.6±0.3 | 10.3±2.3 |
2.3 甘蔗渣产沼气变化
甘蔗渣样品每日沼气、甲烷产量以及累积沼气、甲烷产量如图 3所示。从图 3可以看出，SCB-C组和SCB-R组中每日沼气产量与甲烷产量的趋势具有较高的一致性，与Pan等[27]的报道相似。由图 3(a)可知，SCB-C组有两个产气高峰，第1个产气高峰为第1天，日产沼气量达85.8 mL/g VS，这是由SCB-C的可溶性糖较多且主要用于微生物生长繁殖所造成的，所以此时的日产甲烷量较低；第2个产气高峰为第6天，日产沼气量为45.2 mL/g VS，此时日产甲烷量也达到最高峰，为32.1 mL/g VS，此后日产沼气和甲烷量逐渐下降。从图 3(b)可以看出，SCB-R组只有一个产气高峰，日产沼气和甲烷分别在第2天和第3天达到最高峰，日产沼气和甲烷的量分别为14.9、3.1 mL/g VS。在整个厌氧发酵期间，SCB-C组的产气量远大于SCB-R组。从图 3(c)、(d)可以看出，SCB-C组的累积沼气产量为276.1 mL/g VS，是SCB-R组累积沼气产量(108.7 mL/g VS)的2.5倍；SCB-C组的累积甲烷产量为103.4 mL/g VS，是SCB-R组累积甲烷产量(22.8 mL/g VS)的4.5倍。此外，通过观察累积产气量曲线可知，在SCB-C组的厌氧发酵中，90%的沼气和甲烷分别在前8 d和前7 d产生，分别比SCB-R组快14 d和13 d。综上可知，不仅SCB-C组的产气量大于SCB-R组，而且SCB-C组的产气速率也远比SCB-R组快。
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| 图 3 不同甘蔗渣样品的每日产气量和累积产气量 Fig.3 Daily gas yield and cumulative gas production of different sugarcane bagasse samples |
2.4 甘蔗渣厌氧发酵过程参数变化
在厌氧发酵中，对不同甘蔗渣的发酵过程参数(pH值、SCOD、TAN和TVFA)进行监测，结果如图 4所示。由图 4(a)可知，厌氧发酵开始后，SCB-C组和SCB-R组的pH值均迅速下降，特别是SCB-C组的pH值下降至5.5，这是由SCB-C组的可溶性糖等物质的水解、酸化产生的。由图 4(b)可知，厌氧发酵前期，SCB-C组SCOD的最高值(3 229.0 mg/L)远大于SCB-R组的最高值(954.0 mg/L)。由图 4(c)可知，在1-22 d内，SCB-R组的TAN值(159.7-175.0 mg/L)均高于同时期的SCB-C组(148.9-167.2 mg/L)，但是由于SCB-R组缺乏可溶性糖，故仅TAN的提高并未对SCB-R的产气量有很好的提升作用。如图 4(d)所示，SCB-C组TVFA的最大值为1 855.8 mg/L，比SCB-R组的最大值(1 470.3 mg/L)高26.2%。随着SCB-C组和SCB-R组SCOD和TVFA逐渐被消耗，两组的pH值逐渐上升并恢复至原来的水平。在整个厌氧发酵周期中，除SCB-C组和SCB-R组的pH值在发酵前期不处于最佳产甲烷范围(pH值为6.5-7.5)外[28]，其他指标均处于厌氧发酵的正常范围之内，也未观察到高浓度的TAN和TVFA的积累，厌氧发酵系统稳定性良好。
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| 图 4 不同甘蔗渣样品厌氧发酵过程参数的变化 Fig.4 Changes of anaerobic fermentation parameters of sugarcane bagasse samples |
2.5 甘蔗渣厌氧发酵的TS和VS去除率
厌氧发酵结束后，收集不同甘蔗渣的固体沼渣，并在105 ℃下烘干，进行甘蔗渣厌氧发酵的TS和VS去除率分析，其结果如图 5所示。由图 5可知，经过35 d的厌氧发酵，SCB-C组的TS去除率为40.3%，SCB-R组的TS去除率为23.1%，比SCB-C组少17.2%，这主要是SCB-C组的可溶性糖、SCOD等含量较高且易于厌氧消化所致。SCB-R组的VS去除率为21.6%，仅为SCB-C组(38.1%)的56.7%。综上，SCB-C组的TS和VS去除率均明显大于SCB-R组。有研究表明在理论上原料中的VS去除越多，转化为生物能源就越多[23]，这与本研究中SCB-C组的产气量高于SCB-R组的结果一致。
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| 图 5 不同甘蔗渣样品厌氧发酵的TS和VS去除率 Fig.5 Removal rates of TS and VS of sugarcane bagasse samples in anaerobic fermentation |
3 讨论
本研究对压榨后的、在室内自然条件储存的甘蔗渣微观形态和理化性质进行了研究，发现霉变的甘蔗渣的结构和性质都发生了显著变化。甘蔗渣在室内自然储存会接触地面和空气中的大量微生物，加之压榨后的甘蔗渣含有水分和可溶性糖，这实际上可以看成是一个缓慢的生物发酵过程。在此过程中，如果甘蔗渣的水分没有及时去除，甘蔗渣的颜色会从淡黄色逐渐转变为深褐色或黑褐色，这可能是大部分正常的甘蔗渣处于堆积储存表层，而霉变的甘蔗渣处于堆积储存的内部，从而使霉变的甘蔗渣保持充足水分，加之有较容易利用的糖类，会使微生物在甘蔗渣上大量繁殖，从而形成腐败、霉斑，或如杜珂珂等[29]报道的生物预处理水稻秸秆后，更多的木质素被暴露出来所致。同时，微生物会破坏甘蔗渣表面的蜡质层，使不能降解的硅脱落[29, 30]，使得甘蔗渣表面的结构变得更加粗糙。随着储存时间的延长，微生物会进入甘蔗渣内部，消化容易利用的组分，进一步破坏甘蔗渣的内部结构[29]，从而使其结构坍塌且布满微生物。因此，压榨后的甘蔗渣如需长期存放，应注意通风干燥，尽量避免堆放，使水分快速降低，以防甘蔗渣腐败和霉变。
此外，本研究发现SCB-R组的累积沼气产量和甲烷产量比SCB-C组分别降低60.6%和77.9%，该结果与范晓娟等[18]用白腐菌糙皮侧耳预处理水葫芦(Eichhornia crassipes)25 d，其沼气产量和甲烷产量分别降低的报道一致。柴春月等[17]对生物预处理小麦秸秆产沼气的研究发现，生物预处理10 d和15 d时，沼气产量分别比对照组提高42.0%和41.0%，当预处理时间超过20 d时，沼气产量反而下降37.0%，可能是生物预处理时间过长，微生物消耗了较多产沼气的底物，这与本研究中SCB-R组的可溶性糖比SCB-C组急剧下降的结果一致。本研究中SCB-R组的总氮含量比SCB-C组高，与楚莉莉等[31]报道的生物预处理可以降低秸秆的碳氮比、提高氮含量的结果相似，这虽然有利于沼气发酵，但是缺乏易厌氧消化的底物也使得沼气发酵难以进行。本研究中SCB-R组的产气量下降和产气速率变慢，其原因可能是在沼气发酵过程中缺乏可溶性糖，使沼气发酵启动困难，该结果与Pan等[15]的研究一致。此外，李砚飞等[32]研究发现木霉对纤维素和木质素的降解效果较差，以及Qu等[30]研究发现生物预处理会提高纤维的结晶度，这些情况也会阻碍沼气发酵。因此，考虑到木质纤维素生物质的沼气发酵中可溶性糖-纤维-氮素的营养平衡，甘蔗渣的生物预处理时间应避免过长。
4 结论本研究通过对正常和霉变两种不同形态的甘蔗渣进行对比，探究了甘蔗渣霉变对其结构、理化性质和厌氧发酵产沼气的影响。结果表明，霉变的甘蔗渣的结构被破坏, 其理化性质发生了很大改变，木质纤维素含量有所上升。在厌氧发酵过程中，SCB-C组的SCOD和TVFA最高值远大于SCB-R组，SCB-R组的TS和VS去除率均小于SCB-C组，SCB-R组的累积沼气产量和甲烷产量比SCB-C组分别降低60.6%和77.9%。总之，压榨后的甘蔗渣如果储存不当，其结构会被破坏，可溶性糖含量急剧下降，沼气发酵启动困难，固体去除率降低，从而大大削弱了其产沼气的潜力。因此，压榨后的甘蔗渣如需长期存放，应注意通风干燥，尽量避免堆放，使水分快速降低，以防甘蔗渣腐败和霉变导致可溶性糖的损失。此外，甘蔗渣含有丰富的木质纤维素，而氮素相对缺乏，对其进行生物预处理可破坏木质纤维素结构、增加氮含量，然而过度的生物预处理会消耗大量的可溶性糖，从而打破沼气发酵中可溶性糖-纤维-氮素的平衡，所以甘蔗渣的生物预处理时间不宜过长。
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