槐米为豆科(Fabaceae)植物槐(Sophora japonica)在槐花未开放时摘下后干燥得到的花蕾，也称“槐花米”。其药性微寒、味苦，富含芦丁和槲皮素等活性成分^{[1, 2]}，具有凉血止血的功效^[3]，对便血、血痢、痨血、头晕、肝热目赤等有一定的治疗功效^[4]，是我国常用的传统中药材^[5]。作为药食同源中药材，槐米还可用于茶饮、烹饪。作为茶饮，槐米茶具有一定的保健功效^[6-8]，在热水冲泡的条件下槐米茶内的黄酮类、多酚类等多种活性成分析出到茶水中^[9]。冲泡条件(茶与水体积比、冲泡时间、冲泡次数、冲泡温度等因素)影响着槐米中活性成分的析出^[10-12]。然而目前关于槐米的研究主要集中在化学成分^[13-18]、药理成分^{[14, 19, 20]}、提取工艺^[21-23]等方面，关于如何优化槐米茶冲泡条件及茶汤对ABTS阳离子自由基(ABTS⁺·)的清除作用这两方面的研究尚未开展。因此，本研究以市场上主要的两种槐米茶(广西槐米茶和山西槐米茶)为原料，结合单因素与响应面试验，探究槐米茶的最佳冲泡条件及槐米茶茶汤对ABTS⁺·的清除作用，以确定槐米茶的最佳冲泡条件，为科学利用槐米茶提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料

目前，市场上的槐米茶主要可分为广西槐米茶和山西槐米茶两大类。本研究中广西槐米茶的制作过程如下：2020年8月在槐米种植基地(广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所)采集未开放的槐花花蕾，除杂，蒸汽杀青10 min，晒干后置于砂锅中翻炒至焦黄。山西槐米茶购买于山西密家茶叶有限公司，产地为山西运城。

1.2 单因素试验 1.2.1 冲泡时间对ABTS⁺·的清除作用

称取1 g槐米茶，加入90℃、40 mL的纯净水分别冲泡1 min、2 min、3 min、4 min、5 min，取第1次冲泡所得茶汤，按照ABTS自由基清除能力测试试剂盒(以下简称“ABTS试剂盒”)方法测定茶汤对ABTS⁺·的清除能力，每个处理进行3次重复，计算清除率。取最优冲泡时间进行下一个单因素试验。

1.2.2 冲泡体积对ABTS⁺·的清除作用

称取1 g槐米茶，加入90℃ 40 mL、50 mL、60 mL、70 mL、80 mL的纯净水，按上一步所得的最优冲泡时间冲泡，按照ABTS试剂盒方法测定茶汤对ABTS⁺·的清除能力，每个处理进行3次重复，计算清除率。取最优冲泡体积进行下一个单因素试验。

1.2.3 冲泡次数对ABTS⁺·的清除作用

称取1 g槐米茶，按上述试验所得的最优冲泡体积加入纯净水，用最优冲泡时间对槐米茶进行冲泡，取冲泡1次、2次、3次、4次所得的茶汤，按照ABTS试剂盒方法测定茶汤对ABTS⁺·的清除能力，每个处理进行3次重复，计算清除率。取最优次数进行下一个单因素试验。

1.2.4 冲泡温度对ABTS⁺·的清除作用

称取1 g槐米茶，取上述试验所得的最优冲泡时间、体积和次数，分别用60℃、70℃、80℃、90℃的纯净水对槐米茶进行冲泡，按照ABTS试剂盒方法测定茶汤对ABTS⁺·的清除能力，每个处理进行3次重复，计算清除率。取最优冲泡温度进行下一个单因素试验。

1.2.5 冲泡用水对ABTS⁺·的清除作用

称取1 g槐米茶，在上述试验所得的最优条件下，分别用自来水、怡宝纯净水、农夫山泉矿泉水、桂林本地山泉水、康师傅矿物质水冲泡，按照ABTS试剂盒方法测定茶汤对ABTS⁺·的清除能力，每个处理进行3次重复，计算清除率。

1.3 响应面试验

以冲泡时间、冲泡体积、冲泡次数、冲泡温度4个影响因素为自变量，ABTS⁺·清除率为因变量，通过4因素3水平的响应面试验进一步优化槐米茶茶汤冲泡条件，表 1为试验设计。

1.4 槐米茶茶汤ABTS⁺·清除率测定

将槐米茶茶汤稀释9倍后，按照ABTS试剂盒说明书测定其对ABTS⁺·的清除能力，计算清除率。

1.5 数据处理

每个检测指标测定3次，用均数±标准差表示数据结果。采用Origin 8.6及SPSS 11.5软件进行数据分析，采用Ducan法进行显著性分析(P＜0.05)。

2 结果与分析 2.1 单因素试验结果与分析 2.1.1 冲泡时间对槐米茶茶汤ABTS⁺·清除率的影响

由表 2可知，广西槐米茶冲泡3 min得到的茶汤的ABTS⁺·清除率最高，显著高于冲泡2 min和4 min的茶汤(P＜0.05)。在冲泡5 min时所得到的山西槐米茶茶汤对ABTS⁺·的清除能力最强(P＜0.05)，高于冲泡4 min和6 min的茶汤。两种槐米茶茶汤的ABTS⁺·清除率在达到最佳冲泡时间前均随着冲泡时间的增加而升高，过了最高点后随着时间的增加而下降。因此，分别选择2 min、3 min、4 min和4 min、5 min、6 min作为广西槐米茶和山西槐米茶后续响应面试验的冲泡时间条件。

2.1.2 冲泡体积对槐米茶茶汤ABTS⁺·清除率的影响

由表 3可知，茶汤的ABTS⁺·清除率随着冲泡体积的增加而递减，两种槐米茶茶汤的ABTS⁺·清除率均在冲泡体积为40 mL时最高，在80 mL时最低。在最优冲泡体积条件下，广西槐米茶茶汤的ABTS⁺·清除率比山西槐米茶茶汤高11.25%。在80 mL条件下山西槐米茶茶汤的ABTS⁺·清除率比广西槐米茶高5.20%。随着冲泡体积的增加，广西槐米茶的清除率下降幅度较山西槐米茶大。因此，选择40 mL、50 mL、60 mL作为两种槐米茶后续响应面试验的冲泡体积条件。

2.1.3 冲泡次数对槐米茶茶汤ABTS⁺·清除率的影响

由表 4可知，两种槐米茶第1次冲泡的ABTS⁺·清除率均最高，随着冲泡次数的增加，ABTS⁺·清除率明显呈下降趋势。广西槐米茶茶汤的ABTS⁺·清除率下降幅度比山西槐米茶茶汤大，广西槐米茶第1次冲泡的ABTS⁺·清除率比第5次冲泡高19.57%，而山西槐米茶第1次冲泡的清除率仅较第5次高7.63%，第5次冲泡时山西槐米茶比广西槐米茶高20.15%。因此，选择冲泡次数1次、2次、3次作为两种槐米茶后续响应面试验的冲泡次数条件。

2.1.4 冲泡温度对槐米茶茶汤ABTS⁺·清除率的影响

由表 5可知，广西槐米茶茶汤的ABTS⁺·清除率随冲泡温度的升高呈现先升后降的趋势，冲泡温度为80℃时茶汤对ABTS⁺·的清除能力最大。随着冲泡温度的升高，山西槐米茶茶汤的ABTS⁺·清除能力持续上升。冲泡温度为90℃时茶汤的ABTS⁺·清除能力显著高于其他温度(P＜0.05)。试验结果表明，广西槐米茶比山西槐米茶对温度的变化更加敏感。为探索山西槐米茶的最佳冲泡温度，后续将冲泡温度分别升至95℃与100℃，发现ABTS⁺·清除率仍继续上升，但从80℃开始，ABTS⁺·清除率上升最明显。因此，选择70℃、80℃、90℃作为两种槐米茶后续响应面试验的冲泡温度条件。

2.1.5 冲泡用水对槐米茶茶汤ABTS⁺·清除率的影响

由表 6可知，用怡宝纯净水冲泡得到的广西槐米茶茶汤的清除能力最高，其ABTS⁺·清除率比自来水、康师傅矿物质水、农夫山泉矿泉水和桂林本地山泉水分别高4.78%、4.38%、12.72%及22.60%。利用桂林本地山泉水冲泡所得的茶汤清除率最低，仅为7.66%。对于山西槐米茶，也是用怡宝纯净水冲泡得到的茶汤ABTS⁺·清除率最高，但与其他水质冲泡的茶汤差距不大，分别比自来水、矿物质水、矿泉水和山泉水高0.55%、0.09%、0.92%及1.11%。

2.2 响应面试验结果与分析 2.2.1 广西槐米茶茶汤响应面试验结果

对试验数据进行回归分析，得到广西槐米茶茶汤的二次多元回归方程为y=35.71-0.28A-3.283B-4.16C+1.71D-0.18AB-1.36AC+0.97AD+3.37BC-0.79BD-0.62CD-15.16A²-3.21B²+1.54C²-2.91D²。由表 7可知，广西槐米茶茶汤模型的P值小于0.000 1，失拟项(P=0.196 5＞0.05)不显著，说明模型拟合度较好，选择合理。决定系数R²为0.992 1，校正后的决定系数R_Adj²=0.984 2，与R²接近。实验的精确度(C.V.)为2.66%，表明该模型可用于预测冲泡条件对广西槐米茶茶汤ABTS⁺·清除率的影响。3个一次项B、C、D及4个二次项A²、B²、C²、D²对ABTS⁺·清除率有影响，交互项AC、AD、BC对ABTS⁺·清除率的影响较大，其他因素的影响不显著。各因素对ABTS⁺·清除率的影响顺序为冲泡次数＞冲泡体积＞冲泡温度＞冲泡时间，4个因素间相互影响的主次关系顺序为BC＞AC＞AD＞BD＞CD＞AB。

2.2.2 山西槐米茶茶汤响应面结果及分析

对试验数据进行回归分析，得到山西槐米茶茶汤的二次多元回归方程为y=37.21-0.11A-1.22B-1.80C+1.62D-0.12AB-0.35AC+1.08AD+0.30BC-0.41BD-0.14CD-1.10A²-0.61B²-1.54C²-1.80D²。由表 8可知，此模型的P值小于0.000 1，失拟项(P=0.051＞0.05)不显著，非试验因素对试验结果影响较小。决定系数R²为0.990 0，校正后的决定系数R_Adj²为0.980 0，与R²接近。实验的精确度(C.V.)为0.86%，表明该模型贴合实际试验，可用于预测冲泡条件对山西槐米茶茶汤ABTS⁺·清除率的影响。各因素对ABTS⁺·清除率的影响顺序为冲泡次数＞冲泡温度＞冲泡体积＞冲泡时间，4个因素间相互影响的主次关系顺序为AD＞BD＞AC＞BC＞CD＞AB。

2.2.3 两种槐米茶响应面分析与优化

根据二次回归方程绘出响应曲面图，在试验范围内，交互作用存在于两两因素之间，同时其他因素固定在零水平时，影响因素间的交互作用可在等高线上反映出其强弱关系，不同因素的交互作用越弱时，等高线越圆；不同因素间的交互作用越强，等高线为椭圆形。由图 1至图 6可知，冲泡体积、冲泡次数、冲泡温度3个因素间的交互作用显著(P＜0.05)，某个因素变动时其他因素也会变动。通过模型预测，广西槐米茶在2.99 min、40.11 mL、1.07次、88.69℃冲泡条件下所得茶汤的ABTS⁺·清除率为44.55%；山西槐米茶在5.02 min、40.16 mL、1.03次、87.75℃冲泡条件下所得茶汤的ABTS⁺·清除率为38.74%。考虑到实际操作，对上述结果进行调整，广西槐米茶的最优冲泡条件为3 min、40 mL、1次、90℃；山西槐米茶的最优冲泡条件为5 min、40 mL、1次、90℃。在此条件下进行3次平行试验验证，广西槐米茶茶汤的ABTS⁺·清除率均值为(45.61±1.62)%，山西槐米茶茶汤的ABTS⁺·清除率均值为(37.90±1.02)%，与预测值接近，说明模型对优化槐米茶冲泡条件具有指导意义。

3 讨论

本研究中茶汤的ABTS⁺·清除率在达到最高值前，随着冲泡时间的增加而升高，因为冲泡时间的增加加大了槐米茶中芦丁等活性物质的析出，更多活性物质与试剂发生反应，清除率也随之增大。过了最佳冲泡时间后，槐米茶内溶出的物质容易发生氧化反应，导致茶汤中的芦丁、槲皮素等抗氧化活性成分被破坏，茶汤对ABTS⁺·的清除能力下降。冲泡体积影响槐米茶的清除率主要与茶汤中多酚类、黄酮类等化学成分浓度密切相关。在一定范围内，冲泡体积越小，槐米茶茶汤内的抗氧化活性成分浓度越高，与ABTS⁺·反应越大，清除能力也随着增大; 反之，冲泡体积越大，槐米茶茶汤中活性成分被稀释，浓度降低，清除能力也随之降低。

广西槐米茶第1次冲泡与第5次冲泡的ABTS⁺·清除率下降幅度远大于山西槐米茶，说明广西槐米茶的抗氧化活性成分在第1次冲泡时析出较多，随着冲泡次数增加，槐米茶中的抗氧化活性成分已基本析出，与ABTS⁺·的结合物质逐渐减少，导致清除率下降，茶香味淡薄，口感不佳。山西槐米茶茶汤的ABTS⁺·清除率也随着冲泡次数的增加呈下降趋势，但下降幅度较小，第5次冲泡与第1次冲泡相比仅下降了7.63%，说明槐米茶中的活性成分未完全析出，还可进行多次冲泡。不同产地的槐米茶的冲泡次数对ABTS⁺·清除率的影响不同，可能是茶叶耐泡特性不同导致的^[24]。

冲泡温度会影响茶汤的总体品质^[25]，随着冲泡温度的升高，茶叶中的色素及其他化学成分的析出量增加，使茶汤颜色与风味更胜一筹。然而冲泡温度过高会对溶出的活性物质造成破坏^[26]，导致ABTS⁺·清除率下降。水质中化学元素的多少也会影响茶汤对ABTS⁺·的清除能力。研究表明，水中离子越少，茶汤对ABTS⁺·的清除能力越强，这在一定程度上与茶汤中的黄酮类、多酚类被水中的离子诱导后进行了氧化降解反应有关^[27-29]。

4 结论

槐米茶是我国历史悠久的一种保健茶，其独特的风味深受消费者欢迎，但冲泡方式在很大程度上制约了槐米茶茶汤风味及保健功效的发挥。本研究通过单因素试验确定广西和山西两种槐米茶合适的冲泡条件，并利用响应面分析法对冲泡条件组合进一步优化，得出以下结论：在1∶40 (g/mL)的茶水比例下90℃的纯净水冲泡3 min、冲泡1次得到的广西槐米茶茶汤对ABTS⁺·的清除效果最佳；在1∶40 (g/mL)的茶水比例下90℃的纯净水冲泡5 min、冲泡1次得到的山西槐米茶茶汤对ABTS⁺·的清除效果最佳。平行试验中理论值与实际值接近，两个模型均能够较好地预测槐米茶茶汤的实际ABTS⁺·清除率。对两种产地的槐米茶最佳冲泡条件的优化，为广大消费者提供了效果较佳的冲泡条件，有利于槐米茶的进一步研究与开发。