土茯苓(Smilax glabra)为百合科(Liliaceae)菝葜属(Smilax)植物光叶菝葜(Smilax corbularia)的干燥根茎，又名草禹余粮、土萆薢、刺猪苓等^[1]，为多年生常绿攀缘状灌木，产于我国甘肃(南部)和长江流域以南等地区。土茯苓常生于海拔1 800 m以下的林中、灌丛下、河岸或山谷中，也见于林缘与疏林中，其入药部分为干燥后的根茎，具有解毒、除湿、通利关节的功效，常用于治疗梅毒及汞中毒所致的肢体痉挛、筋骨疼痛以及湿热淋浊等症^[2]。此外，土茯苓是“龟苓膏”的主要原料之一，民间亦用其根茎煲汤以预防疾病，具有广泛的药用和食用价值^[3]。目前，关于土茯苓的研究多集中于化学成分^{[4, 5]}、活性成分^[6]、药理作用^[7-10]等方面，在种苗质量分级标准方面的研究还未见报道。由于土茯苓以野生为主，人们长期过度采挖导致野生资源日渐稀少，造成土茯苓资源的不可持续利用问题日益严重。

目前，关于土茯苓人工种植及种苗繁育的相关研究较少，并且仅少数地区开始人工种植，如广西灵山、全州等地。因此，为满足市场需求，规范人工栽培从而确保土茯苓植物资源的可持续发展势在必行。优质的种苗是保证土茯苓后期高产的重要因素。本研究通过对土茯苓种苗的质量指标进行测量和分析，制定土茯苓种苗质量分级标准，拟为土茯苓人工种植繁育以及生产优质的土茯苓种苗提供理论依据，同时为土茯苓种苗质量分级地方标准的制定奠定坚实的基础。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试验材料

试验材料为土茯苓2年生种子苗，于2022年2月分别购买于湖南、广西、广东、贵州、福建5地的苗圃。

1.1.2 试验地概况

试验地位于广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所药食同源植物种质圃(25°08′29.69″ N，110°31′24.51″ E)。海拔为180-300 m，气候温和，雨量充沛，光照充足，四季分明，无霜期达316 d。年平均气温19.1℃，最冷为1月，最热为7月，极端最高气温39.4℃(2003年)，极端最低气温-4.7℃(1999年)；年平均日照时间为1 397.5 h，全年有效积温6.34℃。春季冷空气活动频繁，低温阴雨天气较多；夏季雨水集中，常有洪涝灾害发生；秋冬季干旱多风。年降水量1 854.8 mm，多集中于4-8月，占全年降水量的73%；年平均蒸发量1 461 mm，年相对湿度78.0%，干湿季明显；年日照时数约1 550 h，有霜日9-24 d，属中亚热带季风气候区。

1.2 方法 1.2.1 测量指标

在试验地同一育苗点随机抽取50株土茯苓种子苗(集中缓苗1个月)，分别测量种苗的基径、株高、分枝数、根粗、根长、根数、球茎长、球茎宽、全株干重、地上部分干重、地下部分干重等11个指标。其中，根粗为最大根粗，根长为最大根长，根数为一级侧根数，球茎长、宽分别为东西和南北方向的宽度。

1.2.2 分级标准计算公式

① 数据的标准化。为使统计分析在同一水平上，先用极差法标准化处理原始测量数据，再用标准化值(Z_ij)进行分析^[11-14]。

$Z_{i j}=\left(X_{i j}-X_{i \min }\right) /\left(X_{i \max }-X_{i \min }\right), $

(1)

式中，Z为标准化值，i代表相关指标，j为所测量的种苗序号(1，2，…，50)，X_ij为样本指标的测量值，X_imax、X_imin分别为所测量的总样苗中对应指标的最大值和最小值。

② 初始分级。苗木初始分级选择具有代表性的2个指标作为分级指标，按照相应指标的标准化值之和从大到小排序，人为地在小群距离较明显的地方将群体分为3个小群^[11-14]。

③ 修正分级。为了尽量避免人为的初始分级造成的误差，需分别计算该相应指标各级的标准化值的平均值，将其作为该级的凝聚中心，计算个体与相邻凝聚中心的距离d，以距离凝聚中心的最近距离为标准对初始分级结果进行修正，修正公式为欧式距离公式^[11-14]。

$d_{i j}=\sqrt{\sum\limits_{k=1}^n\left(x_{i k}-x_{j k}\right)^2}$

(2)

式中，d_ij表示欧氏距离，n表示n维向量，x_ik表示第k个i向量的值，x_jk表示第k个j向量的值。

最终选择2个分级指标，因此n=2，公式(2)变为公式(3)：

$d_{i j}=\sqrt{\left(D_i-D_j\right)^2+\left(H_i-H_j\right)^2}, $

(3)

式中，i表示种苗序号(1, 2, …, 50)，j表示分级级别，D_i表示代表性指标1的标准化值，H_i表示代表性指标2的标准化值，D_j表示代表性指标1的标准化值的平均值，H_j表示代表性指标2的标准化值的平均值。

④ 计算临界值。根据最终凝聚中心，求出半径d′值，即可计算出各级别种苗的临界值，最终确定各级别种苗的分级界限^[11-14]。半径d′的计算公式如下：

$d^{\prime}=\sqrt{K s_{D \text { 标 }}^2+s_{H \text { 标 }}^2} {, }$

(4)

式中，K=1，s_D标²、s_H标²分别为各级种苗中两个代表性指标标准化值的标准差，计算公式如下：

$s_{i \text { 标 }}^2=\frac{\sum\left(X_i-\bar{X}\right)^2}{n-1}, $

(5)

式中，X_i为代表性指标的标准化值，X为代表性指标标准化值的平均值，n为代表性指标的总数。

1.3 数据处理

运用Excel 2021和SPSS 26.0对种苗数据进行统计分析，先经相关分析确定质量指标，再采用聚类分析的方法进行分级^{[15, 16]}。

2 结果与分析 2.1 分级指标确定

土茯苓种苗各指标间的相关矩阵如表 1所示。由表 1可知，种苗的全株干重是矩阵的相关中心，是最能评价种苗质量好坏的指标。除了根粗(0.252)和根长(0.210)，其余指标与全株干重的相关性都较强，相关系数分别为0.304(基径)、0.322(株高)、0.312(分枝数)、0.651(根数)、0.401(球茎长)、0.310(球茎宽)、0.563(球茎数)、0.751(地上部分干重)、0.966(地下部分干重)。通过充分了解有关土茯苓种苗的信息，结合实际生产的可操作性，选择与全株干重相关性较强的根数和球茎数作为土茯苓种苗质量分级的代表性指标。由于根数与全株干重的相关性(0.651)强于球茎数与全株干重的相关性(0.563)，因此根数为影响全株干重的主要因子，球茎数为次要因子。

2.2 数据的标准化

利用式(1)对原始数据进行标准化，计算得到根数及球茎数的标准化值如表 2所示。有13株种苗的根数标准化值为0.51-1.00，其余均为0.00-0.50，27号种苗的根数标准化值为1.00，33号种苗标准化后的根数为0。仅有9株种苗的球茎数标准化值为0.6-1.0，其余均为0-0.5，13号种苗标准化后的球茎数为1，23号种苗标准化后的球茎数为0。

2.3 种苗初始分级

苗木初始分级最终选择根数和球茎数作为分级指标，种苗大致按照根数和球茎数的数量从多到少排序。全株干重较重的土茯苓种苗，一般球茎数多的根数也较多，由于存在少数根数多但球茎数较少或根数少但球茎数较多的情况，因此，将根数和球茎数的标准化值之和在同一维坐标上排序(图 1)，在分群较明显的地方划分种苗等级，共划分为3小群(即3级)，结果如表 3所示。

2.4 修正分级

由表 4可知，第1次修正时Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级种苗的凝聚中心分别为Ⅰ₁(0.67，0.68)、Ⅱ₁(0.42，0.38)、Ⅲ₁(0.23，0.21)，第1次修正中的25号和42号种苗从Ⅱ级变动为Ⅲ级，38号和39号种苗从Ⅲ级变动为Ⅱ级。基于第1次修正的结果对所有种苗进行第2次修正分级，修正后各级种苗的凝聚中心分别为Ⅰ₂(0.67，0.68)、Ⅱ₂(0.45，0.36)、Ⅲ₂(0.20，0.23)，其中9号种苗由Ⅲ级变动为Ⅱ级。第3次修正分级时种苗的分级不再发生变化，因此修正分级结束。土茯苓种苗的第3次欧式距离修正分级结果如表 5所示。

2.5 确定分级临界值

Ⅰ级种苗和Ⅱ级种苗的最终凝聚中心分别为Ⅰ₃(0.67，0.68)、Ⅱ₃(0.45，0.36)，根据式(4)、式(5)可得d₁^′=0.281，d₂^′=0.214，由此可得Ⅰ级种苗和Ⅱ级种苗的临界点分别为Ⅰ^′(0.48，0.48)、Ⅱ^′(0.28，0.22)，如图 2所示。将以上两组数据代回式(1)中，得出各级种苗的下限值，Ⅰ级种苗：根数≥37.4，球茎数≥6.8；Ⅱ级种苗：根数≥28.3，球茎数≥4.2。

参考崔子佳等^[17]、欧斌等^[18]的分级方法，苗木一般分为3个等级，其中Ⅰ、Ⅱ级苗为合格苗，Ⅲ级苗为不合格苗，Ⅲ级苗需留圃继续培育。由表 1可知根数是影响全株干重的主要因子，在生产过程中，应优先考虑根数，其次考虑球茎数。若根数为Ⅰ级，球茎数为Ⅰ级或者Ⅱ级，则该种苗判为Ⅰ级；根数为Ⅱ级，球茎数为Ⅰ级或者Ⅱ级，则该种苗判为Ⅱ级；根数或球茎数为Ⅲ级，则该种苗判为Ⅲ级。分级结果如表 6所示，本研究所抽取的50株土茯苓种苗中，Ⅰ级苗为17株(占比为34%)，Ⅱ级种苗为10株(占比为20%)，因此本研究的种苗中合格苗占54%，不合格苗占46%。

3 讨论

种苗是中药材生产的物质基础，优质的种苗是实现中药材规范化生产的基础和源头^{[19, 20]}。高云峰^[21]在根类中药材种苗质量分级研究综述中指出，掌叶大黄(Rheum palmatum)、甘草(Glycyrrhiza uralensis)、岗梅(Ilex asprella)、丹参(Salvia miltiorrhiza)等多种根类中药材均开展了种苗质量分级标准的研究。目前，种苗质量分级方法^[22]主要有逐步聚类分析法、K-聚类分析法、聚类中心±标准差法、平均值±标准差法、正态分布法等，其中逐步聚类分析法是一种常用、方便、可靠的分级方法，在划分苗木质量等级中应用广泛。

土茯苓作为一种传统的药食两用的根类中药材，市场需求量巨大，但目前未见土茯苓种苗质量标准的相关报道，因此本研究以根数和球茎数作为分级指标，对土茯苓2年生种苗进行逐步聚类分析，得到其质量分级标准，即Ⅰ级种苗：根数≥37.4，球茎数≥6.8；Ⅱ级种苗：28.3≤根数＜37.4，4.2≤球茎数＜6.8；Ⅲ级种苗：根数＜28.3或球茎数＜4.2。研究结果可为土茯苓种苗出圃、提高种苗质量以及促进土茯苓规范化栽培生产提供参考依据。在实际生产中，立地条件不同，种苗的质量可能存在一定差异，因此除了考虑根数和球茎数分级指标外，还应根据各地的具体立地条件考虑种苗的生长状况是否健壮、枝叶是否茂盛、色泽是否油润鲜活、有无病虫害及机械损伤等^[23]。因此，在实际应用时，应根据当地的实际情况，将本研究分级方法作为参照基础，采用多方面相结合的方法为土茯苓种苗出圃提供参考。