香荚兰属(Vanilla Plum ex Mill)作为兰科中具有较高经济价值的属之一，全球已知约有70种。目前我国共发现4种香荚兰属种质资源，分别是台湾香荚兰(Vanilla somai Hayata)、越南香荚兰(V.annamica)、大香荚兰(V.siamensis)和深圳香荚兰(V.shenzhenica)。台湾香荚兰(Vanilla somai Hayata)主要分布于林下、溪边林下或岩壁上^[1]。据民间记载，台湾香荚兰具有一定的药用价值，其花中含有的挥发油具有解热的功效，民间常用其新鲜的花汁涂抹全身治疗高热不退，此外其花汁用来涂抹头发可达到固发的效果^[2]。目前对台湾香荚兰活性物质的研究鲜有报道，为更系统、科学地开发和利用台湾香荚兰资源，对其黄酮等活性物质的研究十分有意义。黄酮类化合物广泛存在于植物中，因其具有较好的抗氧化能力，被广泛应用于食品、保健品等行业。黄酮类化合物还具有良好的抗肿瘤、抗炎镇痛、抗病毒等功效^[3]，在机体的免疫系统调节方面发挥着巨大的作用^[4]，因此在医药领域也颇受欢迎。铁皮石斛(Dendrobium officinale)^[5]、广东石豆兰(Bulbophyllum kwangtungense)^[6]等作为传统的兰科药用植物，含有丰富的黄酮类活性成分，近些年来对其黄酮类活性成分的研究也在逐步深入。与此同时，其他兰科植物黄酮类成分的分析研究也在陆续开展。现阶段，关于台湾香荚兰药用价值的记载还仅限于民间，尚未被《中国药典》记载，国内外有关其总体的药用价值和化学成分的相关文献还较少。本研究拟采用超声辅助提取法和响应面法确定台湾香荚兰总黄酮的最佳提取工艺，并测定台湾香荚兰总黄酮的DPPH自由基清除率、羟基自由基(·OH)清除率、超氧阴离子自由基(O₂^-·)清除率和总还原力，以评价其抗氧化能力，为台湾香荚兰资源的开发和综合利用提供科学的理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料

芦丁对照品(B20771-100 mg，上海源叶生物科技有限公司，HPLC≥98%)，无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、L-抗坏血酸、DPPH、水杨酸、硫酸亚铁、过氧化氢、三羟基氨基甲烷(Tris)、邻苯三酚、盐酸、磷酸盐缓冲液、三氯乙酸、铁氰化钾、三氯化铁等试剂均为分析纯。台湾香荚兰(Vanilla somai Hayata)全株采自广西雅长兰科植物国家级自然保护区。

仪器：TU-1901型双光束紫外可见分光光度计购自北京普析通用仪器有限责任公司；DL-720E智能超声波和万分之一电子分析天平购自梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；HH-S4数显恒温水浴锅购自金坛双捷实验仪器厂；QE-100高速粉碎机购自浙江屹立工贸有限公司。

1.2 方法 1.2.1 样品处理

将采集到的台湾香荚兰洗净，在60℃的条件下烘干48 h，粉碎后过60目筛，制成样品粉末，备用。

1.2.2 对照品溶液的制备

精密称取0.012 5 g芦丁对照品，用60%乙醇定容于25 mL的容量瓶中，摇匀，制成0.500 mg/mL的对照品溶液。

1.2.3 供试品溶液的制备

准确称取0.5 g样品粉末，按照1:50 (g/mL)的料液比，加入50%乙醇25 mL，在60℃、300 W的条件下超声辅助提取30 min，过滤，复提3次，然后定容于100 mL容量瓶中，即得。

1.2.4 最大吸收波长的确定

精密吸取1.2.2节对照品溶液和1.2.3节供试品溶液各2 mL，分别置于25 mL容量瓶中，各瓶中加入5%亚硝酸钠溶液2 mL，摇匀后放置6 min，加入5%硝酸铝溶液2 mL，摇匀后放置6 min，加入4%氢氧化钠溶液4 mL，摇匀后用60%乙醇稀释至刻度线，放置15 min后，用蒸馏水代替供试品溶液并以相同方法处理后的空白试剂作为参比溶液，于300-600 nm波长下扫描，发现在510 nm处吸光值最大，故选择510 nm作为最大吸收波长。

1.2.5 标准曲线的制备

分别精密吸取0.0 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL对照品溶液置于25 mL容量中，用60%乙醇加至2.0 mL，按照1.2.4节方法加样操作，于510 nm下测定吸光值。以芦丁的浓度(mg/mL)为横坐标，吸光值作为纵坐标，制作标准曲线，并计算回归方程。得到回归方程：y=11.743x+0.002 (R²=0.999 3)。

1.3 单因素试验 1.3.1 提取时间对台湾香荚兰总黄酮含量的影响

准确称取样品粉末0.5 g，按照1:50 (g/mL)的料液比，加入50%乙醇25 mL，在60℃、300 W的条件下分别超声辅助提取10 min、30 min、60 min、90 min、120 min，过滤，复提3次，然后定容于100 mL的容量瓶中。之后，按照1.2.4节方法加样操作，于510 nm处测定吸光值，最后计算出不同提取时间下的总黄酮含量。每种处理做3组重复。选取最佳提取时间，进行下一步单因素试验。

1.3.2 乙醇浓度对台湾香荚兰总黄酮含量的影响

准确称取样品粉末0.5 g，按照1:50 (g/mL)的料液比，分别加入40%、50%、60%、70%、80%的乙醇25 mL，在60℃、300 W的条件下分别超声辅助提取30 min，过滤，复提3次，然后定容于100 mL的容量瓶中。之后，按照1.2.4节方法加样操作，于510 nm处测定吸光值，最后计算出总黄酮含量。每种处理做3组重复。选取最佳乙醇浓度，进行下一步单因素试验。

1.3.3 料液比对台湾香荚兰总黄酮含量的影响

准确称取样品粉末0.5 g，按照1:20 (g/mL)、1:30 (g/mL)、1:40 (g/mL)、1:50 (g/mL)、1:60 (g/mL)的料液比，加入50%乙醇，在60℃、300 W的条件下分别超声辅助提取30 min，过滤，复提3次，然后定容于100 mL的容量瓶中，之后，按照1.2.4节方法加样操作，于510 nm处测定吸光值，最后计算出总黄酮含量。每种处理做3组重复。

1.4 响应面分析

根据单因素试验结果，利用Design Expert 8.0.6软件设计响应面试验。以提取时间(A)、乙醇浓度(B)、料液比(C)为自变量，以台湾香荚兰的总黄酮含量(Y)为考察指标，共计17个试验点进行组合试验，因素与水平见表 1。

1.5 抗氧化活性的测定

根据以上试验结果，采用最佳提取工艺对台湾香荚兰中的总黄酮进行提取，并将提取液(0.059 5 mg/mL)稀释成0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.03 mg/mL、0.04 mg/mL、0.05 mg/mL 5个浓度的样品测试液，用于对台湾香荚兰总黄酮的抗氧化活性进行综合评价。

1.5.1 台湾香荚兰总黄酮对DPPH自由基清除能力

DPPH自由基清除能力的测定参考宋佳敏等^[7]的方法，并稍做调整。分别取5个浓度的4 mL样液于试管中，加入等体积的0.1 mmol/L的DPPH溶液，充分混匀后，在室温下避光保存30 min，用无水乙醇作参比溶液(下同)，于517 nm处测定样品液中的吸光值，记为A₁；4 mL样液与无水乙醇等体积混合后测定吸光值，记为A₂；用4 mL蒸馏水代替样液，与4 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液混合后测定吸光值，记为A₀。以相同浓度的L-抗坏血酸作阳性对照。

$ \mathrm{DPPH} 自由基清除率 (\%)=\left(1-\frac{A_{1}-A_{2}}{A_{0}}\right) \times \\ 100 \% 。$

1.5.2 台湾香荚兰总黄酮对羟基自由基(·OH)清除能力

羟基自由基(·OH)清除能力的测定参考Fenton反应体系^[8]，并稍做调整。取2.0 mL不同浓度梯度的样品溶液，依次加入1.0 mL 2.5 mmol/L的水杨酸溶液、1.0 mL 5 mmol/L的FeSO₄溶液和2.0 mL蒸馏水，充分混匀后加入1.0 mL 5 mmol/L的H₂O₂溶液来启动反应，在37℃恒温水浴30 min后，用蒸馏水作参比溶液(下同)，于510 nm处测定吸光值，记为A_s；用1.0 mL蒸馏水代替H₂O₂溶液处理的样品溶液，测定的吸光值记为A_b；用2.0 mL蒸馏水代替样品溶液，测定的吸光值记为A_p。以相同浓度梯度的L-抗坏血酸作阳性对照。

$ 羟基自由基(·\text{OH})清除率(\%)=\\ \left(1-\frac{A_{\mathrm{s}}-A_{\mathrm{b}}}{A_{\mathrm{p}}}\right) \times 100 \%。$

1.5.3 台湾香荚兰总黄酮对超氧阴离子自由基(O₂^-·)清除能力

超氧阴离子自由基(O₂^-·)清除能力的测定参考张德华等^[9]的邻苯三酚自氧化法。取1.0 mL不同浓度的样品溶液，加入5.0 mL Tris-HCl缓冲液(0.05 mol/L，pH值为8.2，25℃水浴20 min)，再加入0.5 mL 25 mmol/L的邻苯三酚溶液，混匀后于25℃条件下水浴5 min，立即加入0.2 mL 8 mol/L的HCl来终止反应，用蒸馏水作参比溶液(下同)，于320 nm处测定吸光值，记为A_q；用0.5 mL蒸馏水代替邻苯三酚，测定的吸光值记为A_g；用1.0 mL蒸馏水代替样品溶液，作空白对照，记为A_f。以相同浓度梯度的L-抗坏血酸作阳性对照。

$ 超氧阴离子自由基\left(\mathrm{O}_{2}^{-} \cdot\right)清除率= \\\left(1-\frac{A_{\mathrm{q}}-A_{\mathrm{g}}}{A_{\mathrm{f}}}\right) \times 100 \%。$

1.5.4 台湾香荚兰总黄酮总还原力测定

总还原力的测定参考朱成豪等^[10]的方法。取2.0 mL不同浓度梯度的样品溶液，先加入2.5 mL 0.2 mol/L的磷酸缓冲液(pH值为6.6)，再加入2.5 mL 1%的铁氰化钾溶液，混匀后在50℃条件下水浴20 min，迅速冷却，加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液来终止反应。取2.5 mL的上清液，加入2.5 mL的蒸馏水和0.5 mL 0.1%的FeCl₃溶液，混匀，静置10 min后，用蒸馏水作参比溶液，于700 nm下测定吸光值。以相同浓度梯度的L-抗坏血酸作阳性对照。

1.6 数据处理

采用Excel 2010和SPSS 18.0软件进行数据处理与分析，绘图采用Origin 2019软件。

2 结果与分析 2.1 单因素试验结果 2.1.1 提取时间对台湾香荚兰总黄酮含量的影响

由图 1可知，台湾香荚兰的总黄酮含量随着提取时间的增加呈现先增加后降低的趋势，在提取时间为30 min时，总黄酮含量到达最高值1.053%，之后，随着提取时间继续增加，总黄酮的含量则逐渐降低。

2.1.2 乙醇浓度对台湾香荚兰总黄酮含量的影响

由图 2可知，台湾香荚兰总黄酮含量随着乙醇浓度增加呈现先增加后降低的趋势，在乙醇浓度为50%时，总黄酮含量达到最高值1.250%。在此之后，随着乙醇浓度继续增加，总黄酮含量逐渐降低。

2.1.3 料液比对台湾香荚兰总黄酮含量的影响

由图 3可知，台湾香荚兰总黄酮含量随着料液比的增加呈现先增加后降低的趋势，当料液比增加到1:50 (g/mL)时，总黄酮含量达到最高值0.962%，当料液比继续增加时，总黄酮含量呈现降低的趋势。

2.2 响应面试验结果与分析 2.2.1 响应面试验结果

根据表 1设定的水平和因素，共计17个试验点，其中12个为析因点，5个为零点。各个水平下总黄酮含量见表 2。

由表 3数据可知：模型中F值为7.65，P=0.006 9 < 0.01，且失拟误差的P值为0.909 4>0.05，两者表明模型具有极显著的统计学意义并且失拟性不显著，试验结果受未知因素的影响较小；模型的相关系数R²=0.907 7，表明模型具有良好的可信度；矫正系数R_Adj²=0.789 1，表示该模型可以解释78.91%的试验数据。对表 3中的数据进行二项多元回归拟合，得到回归方程：Y=1.21+0.075A-0.075B+0.018B+0.077AB-0.051AC+(7.250E-0.04)BC-0.27A²-0.15B²-0.090C²，其中台湾香荚兰总黄酮含量用Y表示。由回归方程可知，因素A²对含量Y具有极显著的影响，因素B²对含量Y具有显著的影响，其他因素的影响效果不明显，表明各单因素与台湾香荚兰总黄酮含量Y之间存在着复杂的关系。结合表 3中的数据和回归方程可知，3个单因素对台湾香荚兰总黄酮含量Y的影响大小为乙醇浓度B>提取时间A>料液比C。

2.2.2 响应面交互作用分析

利用Design Expert 8.0.6软件，对A、B、C 3个因素进行交互并分析比较，分别做出AB、AC、BC 3个等高线图和响应面三维曲线图。由图 4可知，在一定范围内，随着各因素数值的增加，总黄酮含量(响应值)也会随之增加；达到最高点后随着各因素数值继续增加，总黄酮含量(响应值)则会减少。坡度的大小，表明两个因素的交互程度，坡度越大，两个因素的交互作用就越强，反之则弱。两个因素形成的等高线越接近椭圆形，表示两者的交互作用越显著。由此可知，提取时间(A)与乙醇浓度(B)的交互效果大于提取时间(A)和料液比(C)的交互效果，大于乙醇浓度(B)和料液比(C)的交互效果，即AB>AC>BC。

2.2.3 优化与验证试验结果

根据以上响应面模型和结果分析，得出台湾香荚兰总黄酮的最佳提取条件：提取时间为37.5 min，乙醇浓度为45.6%，料液比为1:50.7 (g/mL)。在此条件下，模型预测台湾香荚兰的总黄酮含量为1.22%。为方便试验，将试验条件调整为38 min，乙醇浓度为46%，料液比为1:51 (g/mL)，在此条件下进行3次平行验证试验，得到台湾香荚兰总黄酮的实际含量为1.19%，RSD值为0.65%(n=3)，与模型预测含量相差0.03%，表示该模型具有较高的可靠性，且提取工艺的重现性较好。

2.3 台湾香荚兰总黄酮的抗氧化活性 2.3.1 对DPPH自由基清除能力

由图 5可知，当浓度为0.01-0.04 mg/mL时，台湾香荚兰总黄酮对DPPH自由基的清除能力随着浓度的增加逐渐增强，其清除率从42.1%增加到90.6%，在此之后，总黄酮对DPPH自由基的清除率趋于平缓。L-抗坏血酸对DPPH自由基的清除能力基本保持在90%以上，且变化的趋势较为平缓。总黄酮和L-抗坏血酸对DDPH自由基的清除能力，都是先增加后趋于平缓，两者在趋于平缓后，其清除能力相差较小，表明台湾香荚兰总黄酮对DPPH自由基具有较好的清除能力。将0.01-0.04 mg/mL的样品浓度(X₁)与该浓度梯度下所对应的总黄酮对DPPH自由基的清除率(Y₁)进行线性拟合，得到回归方程：Y₁=1599.3X₁+30.387 (R₁²=0.950 6)，则总黄酮对DPPH自由基的IC₅₀值为0.012 3 mg/mL。

2.3.2 对羟基自由基清除能力

由图 6可知，当浓度为0.01-0.03 mg/mL时，随着浓度的增加，台湾香荚兰总黄酮对羟基自由基的清除能力逐渐增强，但趋势较为平缓，其清除率从46.8%增加到59.1%；当浓度为0.03-0.05 mg/mL时增加较快，清除率从59.1%增加到76.5%。L-抗坏血酸对羟基自由基的清除能力基本保持在85%以上且变化较小。台湾香荚兰总黄酮对羟基自由基的清除能力明显低于同浓度的L-抗坏血酸。将样品浓度(X₂)与总黄酮对羟基自由基的清除率(Y₂)进行线性拟合，得到回归方程：Y₂=753.13X₂+37.992 (R₂²=0.991)，则总黄酮对羟基自由基的IC₅₀值为0.015 9 mg/mL。

2.3.3 超氧阴离子自由基(O₂^-·)清除能力

由图 7可以看出，当浓度为0.01-0.05 mg/mL时，随着浓度的增加，台湾香荚兰总黄酮对O₂^-·的清除能力也随之增强，清除率从40.2%增加到57.3%，且两者存在一定的线性关系。当L-抗坏血酸的浓度为0.01-0.03 mg/mL时，清除率增加得较快；当浓度为0.03-0.05 mg/mL时，清除率的增加相对变缓。总黄酮对O₂^-·的清除能力低于同浓度的L-抗坏血酸，但两者相差不大。将样品浓度(X₃)与总黄酮对O₂^-·的清除率(Y₃)进行线性拟合，得到回归方程：Y₃=432.44X₃+35.902 (R₃²=0.998 9)，则总黄酮对O₂^-·的IC₅₀值为0.032 6 mg/mL。

2.3.4 总还原力

以L-抗坏血酸为对照，测定台湾香荚兰总黄酮的总还原力，结果如图 8所示。随着总黄酮浓度的升高，其还原能力也随之升高，且两者存在一定的线性关系。通过对比可以发现，总黄酮的总还原能力略低于同浓度的L-抗坏血酸。对总黄酮和L-抗坏血酸总还原力进行线性拟合，得到回归方程分别为Y₄=11.454X₄+0.0149 (R₄²=0.998)、Y₅=19.995X₅-0.171 (R₅²=0.991)。当吸光值为0.5时，对应总黄酮和L-抗坏血酸的浓度分别为0.042 mg/mL、0.034 mg/mL，可以得到总黄酮的总还原力为L-抗坏血酸的79.2%。

3 讨论

目前，总黄酮的提取方法主要有乙醇回流提取法、浸提法、超声辅助提取法和超临界萃取法等。本研究以台湾香荚兰为原料，采用超声辅助提取法提取其总黄酮。超声辅助提取是利用超声波的机械效应、空化效应以及热效应，加速分子的运动速度和穿透力，从而增加有效物质的溶出，超声辅助提取相对于其他提取方法，如回流法、浸渍法等，具有提取效率高、操作简单等优点。本研究将乙醇作为总黄酮的提取溶剂，符合黄酮类化合物易溶于乙醇等有机溶剂的特点，在一定范围内，总黄酮的含量随着乙醇体积分数的增加而增加，当超过一定限度后，过高的乙醇浓度使植物细胞外的渗透压大于细胞内，从而限制有效物质的溶出；就提取时间而言，一方面提取时间的增加一定程度上可以增加总黄酮的溶出，使提取效率提高，另一方面，超声时间的延长，可能会使部分黄酮类化合物结构被破坏以及增加其他类型化合物溶出，从而降低黄酮类化合物的含量；适当的料液比可以增加目标产物的溶出，而过大的料液比不但使产物的含量下降，还会造成溶剂的浪费。本研究通过单因素试验得到最佳试验点，再经过软件设计得到17个试验线和完整连续的面，最终在面中得到最佳值。通过响应面试验，不仅可以使目标产物的提取率达到最大，还节省了生产成本。

通过研究发现，台湾香荚兰中总黄酮的含量为1.19%，其总黄酮的还原能力为L-抗坏血酸的79.2%，对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基的IC₅₀值分别为0.012 3 mg/mL、0.015 9 mg/mL、0.032 6 mg/mL。与广东石豆兰^[11]、石仙桃(Pholidota chinensis Lindl.)^[12]等兰科药用植物相比，台湾香荚兰中的总黄酮具有较为突出的抗氧化能力，但总黄酮的类型还不明确，需要进一步分离和鉴定。

4 结论

本研究采用超声辅助提取的方法，对台湾香荚兰中的总黄酮进行提取与测定，并采用单因素试验和响应面交互试验相结合的方法，得出3个单因素对台湾香荚兰中总黄酮含量的影响大小为乙醇浓度(B)>提取时间(A)>料液比(C)，并确定了台湾香荚兰中总黄酮的最佳提取条件：提取时间为37.5 min，乙醇浓度为45.6%，料液比为1:50.7 (g/mL)。在最佳提取条件下，台湾香荚兰中总黄酮的实际含量为1.19%，与预测值相差0.03%。台湾香荚兰总黄酮的还原能力为L-抗坏血酸的79.2%，对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子的IC₅₀值分别为0.012 3 mg/mL、0.015 9 mg/mL、0.032 6 mg/mL，表明台湾香荚兰总黄酮具有较好的抗氧化活性，具有很好的开发利用前景。