0 引言

金花茶组植物(Camellia, sect.Chrysantha Chang)是山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)的珍稀濒危常绿灌木或小乔木^[1]，是全球知名的珍贵观赏植物^[2]。该组植物的花呈金黄色，金瓣玉蕊，娇艳多姿^[3]，高贵优雅，具有极高的商业价值和观赏价值，并拥有“植物界大熊猫”“山茶花女王”“茶族皇后”“神奇的东方魔茶”^[4]等美誉。金花茶组植物属于极具开发和利用价值的广西优势资源植物^[5]，拥有超过400种不同种类的营养物质^[6]，如总皂苷、总多糖、茶多酚、总黄酮等活性营养物质，VB₁、VB₂、VC、VE等维生素，Se、Mo、Zn等微量元素和K、Ca、Mg等营养元素。研究表明，金花茶具有多种保健作用：可以延缓机体衰老^[7]；具有一定的抗菌效果，有助于预防人体癌变^[8]；预防人体动脉粥样硬化，有利于降低高血脂和高血压^[9]；有利于降低胆固醇、脂蛋白、血糖^[10]等。鉴于金花茶的濒危现状和高应用价值^[11]，已有许多研究对其种群群落特征、繁育情况和活性成分进行研究^[12-14]，而关于金花茶抗氧化活性的研究大多以金花茶的叶片为原材料，对活性物质如茶多酚^[15]、总黄酮^[16]、总皂苷^[17]、总多糖^[18]等进行单一化学成分和抗氧化活性研究。韦霄等^[2]综合评价普通金花茶(C.nitidissima)、平果金花茶(C.pingguoensis)、毛瓣金花茶(C.pubipetala)等3种植物叶片抗氧化活性大小，认为毛瓣金花茶提取液的抗氧化活性强于其他2种植物；宁恩创等^[16]研究显脉金花茶(C.euphlebia)新鲜叶中总黄酮抗氧化活性，结果显示金花茶总黄酮能有效地清除羟基自由基(·OH)、超氧阴离子自由基(O₂^-·)和脂质过氧基(ROO·)，具有明显的抗氧化活性；牛广俊等^[18]测定金花茶不同部位的多糖含量并探讨其体外抗氧化活性的差异，结果显示金花茶花、叶、芽尖、果壳中的多糖含量分别为32.88，29.48，35.89，30.02 g·kg^-1，抗氧化活性综合评分为芽尖>花>果壳>叶；程金生等^[17]通过检测金花茶花对·OH、DPPH·、O₂^-·以及亚硝酸盐(NO₂^-)的去除作用判断金花茶花总皂苷抗氧化活性，认为金花茶花具有较好的抗氧化能力，是一种较好的自由基清除天然原料。抗氧化活性强弱可能是多种活性物质综合协调作用产生的结果^[19]，所以单以一种活性成分为研究目标，不足以评价研究对象的抗氧化活性，而且涉及金花茶花的研究鲜有报道。因此，本试验以9种金花茶花为试验材料，测定其抗氧化活性及主要活性成分茶多酚、总黄酮的含量，旨在探讨不同金花茶花抗氧化活性的差异及其与茶多酚、总黄酮含量的关系，为研究开发优质金花茶产品提供科学参考。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验样品与试剂

样品：不同种类的金花茶花(经广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所韦霄研究员鉴定，样品保存在该单位特色经济植物研究中心)。

试剂：邻二氮菲，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，无水乙醇，FeSO₄，邻苯三酚，H₂O₂，DPPH，Tris-HCl，铁氰化钾，HCl，NaNO₂，三氯乙酸，NaOH，FeCl₃，Al(NO₃)₃，福林酚试剂，Na₂CO₃，香草醛，冰醋酸，硫酸均为分析纯；芦丁对照品(MUST-12040302，中国药品生物制品检定所生产)，没食子酸对照品(B20851-20mg，上海源叶生物有限公司生产)，人参皂苷Rg1对照品(B21057-20mg，上海源叶生物有限公司生产)。

1.1.2 主要仪器设备

TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司生产)，万分之一电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司生产)，HH-S4数显恒温水浴锅(金坛双捷实验仪器厂生产)，DL-720E智能超声波清洗器(上海五相仪器仪表有限公司生产)。

1.2 方法 1.2.1 样品处理

在开花期采集不同种类的金花茶盛开花朵(表 1)，将采集的金花茶花洗净，置于微波炉里杀青5 min，然后在60℃烘箱内烘24 h，粉碎，过60目筛，备用。精密称取0.1 g金花茶花粉末，置10 mL离心管中。按原料:提取剂=1:45 (g·mL^-1)的比例在试管中加入20%乙醇溶液，然后在300 W超声条件下提取，提取温度为70℃，提取53 min^[8]。过滤得上清液，再用20%乙醇溶液定容到100 mL，摇匀，得1 mg·mL^-1样品提取液，待用。每个样品做3个重复实验。

1.2.2 金花茶花对·OH去除能力测定

取11组干燥洁净的试管(每组3支试管做平行)编号为A—K，分别加入2 mL pH值为7.45的磷酸盐缓冲溶液(PBS)，1 mL 0.75 mmol·L^-1邻二氮菲溶液和1 mL 0.75 mmol·L^-1 FeSO₄溶液，充分混匀。往A组3支试管中各加入2 mL无菌蒸馏水，B组3支试管中各加入1 mL 0.01% H₂O₂溶液和1 mL无菌蒸馏水，剩下的9组试管分别添加1 mL 0.01% H₂O₂溶液和9种金花茶花样品提取液1 mL。将各组试管内溶液充分混匀后于37℃恒温条件水浴60 min^[20]，取出冷却后采用紫外可见分光光度计在536 nm处测定溶液的吸光值。A组试管的吸光值记为A_b，B组试管的吸光值记为A_p，剩余9组试管的吸光值则记为A_s，按公式(1)计算9种金花茶花对·OH的清除率。

$ \cdot{\rm{ }}\;{\rm{OH}} \; 清除率\left( {{\rm{ }}\% {\rm{ }}} \right){\rm{ }} = {\rm{ }}({A_{\rm{s}}} - {A_{\rm{p}}})/({A_{\rm{b}}} - {A_{\rm{p}}}){\rm{ }} \times 100\% {\rm{ }}。$

(1)

1.2.3 金花茶花对DPPH·去除能力测定

精密称取0.004 0 g的DPPH结晶，加入100 mL无水乙醇，配成浓度为0.04 mg·mL^-1的溶液，避光保存。取2 mL不同种金花茶花样品提取液分别与2 mL 0.04 mg·mL^-1 DPPH溶液进行等体积混合，在暗处静置30 min^[21]，然后采用紫外可见分光光度计在517 nm处测定吸光值，记为A₁。取2 mL不同种金花茶花样品提取液与2 mL无水乙醇溶液进行等体积混合，在暗处静置30 min后在517 nm处测定吸光值，记为A₂。取2 mL 0.04 mg·mL^-1 DPPH溶液与2 mL无水乙醇溶液混合，在暗处静置30 min后在517 nm处测定吸光值，记为A₀。按公式(2)计算9种金花茶花对DPPH·的清除率。

$ {\rm{DPPH}} \cdot 清除率\left( {{\rm{ }}\% {\rm{ }}} \right){\rm{ }} = {\rm{ }}[{A_0} - {\rm{ }}({A_1} - {A_2}){\rm{ }}]/{A_0} \times 100\% {\rm{ }} $

(2)

1.2.4 金花茶花对O₂^-·去除能力测定

将0.05 mol·L^-1 Tris-HCl缓冲液(pH值为8.2)在25℃恒温水浴锅中放置20 min进行预热，用移液枪吸取5 mL Tris-HCl缓冲液于各组试管中，然后加入0.5 mL 25 mmol·L^-1邻苯三酚溶液，混匀后再分别加入1 mL 9种金花茶花的样品提取液，充分混匀，放入25℃恒温水浴锅中反应4 min。反应后立即往各试管添加2滴8 mol·L^-1 HCl溶液来阻断反应^[22]，用紫外可见分光光度计在299 nm处测定吸光值，记为B₁。用1 mL无菌蒸馏水取代上述的1 mL金花茶花样品提取液，测定其吸光值记为B₀；用0.5 mL无菌蒸馏水取代反应体系中的0.5 mL 25 mmol·L^-1邻苯三酚溶液，测定其吸光值记为B₂。按公式(3)计算9种金花茶花对O₂^-·的清除率。

$ {\rm{O}}_2^ - \cdot 清 除 率 \left( {{\rm{ }}\% {\rm{ }}} \right){\rm{ }} = {\rm{ }}[{B_0} - {\rm{ }}({B_1} - {B_2}){\rm{ }}]/{B_0} \times 100\% {\rm{ }} $

(3)

1.2.5 金花茶花总还原力测定

取9组试管分别编号为1—9(每组有3支试管做重复试验)，用移液枪分别取9种金花茶花的样品提取液2.5 mL置于各组试管中，加入2.5 mL 1%铁氰化钾溶液，混匀；再加入2.5 mL 0.2 mol·L^-1 PBS，充分振荡后在50℃恒温水浴锅中反应0.5 h。反应完毕后取出，迅速冷却后加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，随后在3 000 r·min^-1离心0.1 h。用移液枪取5 mL上清液于干净试管中，加入4 mL无菌蒸馏水和1 mL 0.1% FeCl₃溶液，充分混匀，静置反应6 min，然后用紫外可见分光光度计测定其在700 nm处吸光值A₇₀₀^[23]。溶液的A₇₀₀越大，表示其还原能力越强, 即抗氧化活性越强。

1.2.6 总黄酮含量测定

总黄酮含量测定参照文献[24]的方法，分别取9种金花茶花样品提取液1 mL进行试验，计算样品中总黄酮含量。

1.2.7 茶多酚含量测定

茶多酚含量测定参照《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的测定方法》(GB/T 8313—2008)^[25]进行，分别取9种金花茶花样品提取液1 mL进行测定，计算样品中茶多酚含量。

1.3 数据处理

结合功效系数法及距离法^[26]综合评价9种金花茶花抗氧化活性的大小，功效系数的计算方法如公式(4)所示，距离法的计算公式如公式(5)所示。

$ d_{i}=\frac{x_{i}-x_{s i}}{x_{h i}-x_{s i}} \times 40+60(i=1, 2, \cdots, n), $

(4)

式中, d_i表示第i个参评指标的功效系数，x_i表示第i个参评指标的值，x_hi表示参评指标的上限阈值，x_si表示参评指标的下限阈值。

$ S_{j}=\sum\limits_{i=1}^{n}\left|100-d_{i j}\right|, $

(5)

式中, S_j表示第j个参评金花茶的综合评分值，d_ij表示第j个参评金花茶花第i个参评指标的功效系数。

采用SPSS 23.0软件对9种金花茶花抗氧化活性及其总黄酮、茶多酚含量进行方差分析和多重比较(Duncan法)，并进行相关性分析。

2 结果与分析 2.1 抗氧化活性测定结果 2.1.1 对·OH去除能力

由图 1可知，9种金花茶花对·OH的去除能力差异显著(P＜0.05)，其中中东金花茶对·OH的清除率最高，为(92.89±0.35)%；东兴金花茶对·OH的清除率最低，为(16.26±0.70)%。龙州金花茶和毛瓣金花茶对·OH的去除能力无显著性差异(P＞0.05)，崇左金花茶和普通金花茶对·OH的去除能力也无显著性差异(P＞0.05)。

2.1.2 对DPPH·去除能力

由图 2可知，9种金花茶花对DPPH·的清除率几乎都达90%以上，可见金花茶花对DPPH·的去除效果都比较好，但是不同种类金花茶花对DPPH·的去除能力有显著性差异(P<0.05)。其中崇左金花茶对DPPH·的去除作用最强，清除率为(94.70±0.10)%；天峨金花茶花对DPPH·的去除作用最弱，清除率为(89.52±0.21)%。

2.1.3 对O₂^-·去除能力

由图 3可知，9种金花茶花对O₂^-·的去除能力差异显著(P<0.05)。武鸣金花茶对O₂^-·的清除率最高，为(11.88±0.34)%；中东金花茶对O₂^-·的清除率最低，为(6.20±0.42)%。东兴金花茶与凹脉金花茶、东兴金花茶和天峨金花茶对O₂^-·的去除能力差异均不显著(P＞0.05)。

2.1.4 总还原力测定结果

由图 4可知，9种金花茶花总还原力差异显著(P<0.05)，其中中东金花茶吸光值最大(1.55)，说明其总还原力最强；东兴金花茶吸光值最小(0.57)，说明其总还原能力最弱。龙州金花茶和凹脉金花茶的总还原力无显著性差异(P＞0.05)，崇左金花茶花和普通金花茶的总还原力也无显著性差异(P＞0.05)。

2.1.5 抗氧化活性综合评价结果

不同测定方法得到的抗氧化活性结果有一定的差异，所以不能用单一的指标来进行评判。本文结合功效系数法和距离法计算出不同金花茶花抗氧化活性的综合评分值(总距离)，数值越小代表抗氧化活性越强。9种金花茶花抗氧化活性由强到弱依次为凹脉金花茶＞毛瓣金花茶＞中东金花茶＞武鸣金花茶＞崇左金花茶＞龙州金花茶＞普通金花茶＞天峨金花茶＞东兴金花茶(表 2)。

2.2 主要活性成分含量 2.2.1 总黄酮含量

由图 5可知，9种金花茶花总黄酮含量差异显著(P<0.05)。中东金花茶总黄酮含量(24.71%)最高，其次是龙州金花茶(21.60%)，而东兴金花茶含量(2.42%)最低。凹脉金花茶与毛瓣金花茶、普通金花茶与崇左金花茶、普通金花茶与天峨金花茶的总黄酮含量都无显著性差异(P＞0.05)。

2.2.2 茶多酚含量

如图 6所示，9种金花茶花茶多酚含量差异显著(P<0.05)。中东金花茶花茶多酚含量(10.21%)最高，其次是龙州金花茶(8.74%)，东兴金花茶含量(1.03%)最低。龙州金花茶、凹脉金花茶和毛瓣金花茶三者间茶多酚含量无显著性差异(P＞0.05)，天峨金花茶和武鸣金花茶也无显著性差异(P＞0.05)。

2.3 抗氧化活性与主要活性物质含量相关性分析

表 3列出9种金花茶花抗氧化活性与总黄酮、茶多酚含量之间的相关性。结果表明：金花茶花对·OH去除能力和总还原力均与总黄酮、茶多酚含量呈极显著正相关关系(P<0.01)，对O₂^-·去除能力与总黄酮、茶多酚含量呈极显著负相关关系(P<0.01)，对DPPH·去除能力与总黄酮、茶多酚含量均无显著相关关系(P>0.05)。

3 讨论

金花茶花抗氧化活性的大小及其主要活性成分含量的高低是衡量其开发利用价值的重要指标。不同种类的金花茶花抗氧化活性存在显著差异(P<0.05)。本研究9种金花茶花去除DPPH·的效果均较好，几乎都在90%以上，原因可能是本实验样品溶液的浓度为1 mg·mL^-1，处于对DPPH·去除效果较理想的浓度范围内^[2]，因此对DPPH·去除率均较高，总黄酮和茶多酚含量的高低与其对DPPH·的清除能力无显著相关关系。

不同金花茶花去除O₂^-·的能力较弱，武鸣金花茶花对O₂^-·的去除率最高为(11.88±0.34)%。宁恩创等^[27]研究金花茶多酚抗氧化活性，认为茶多酚分子中都含有羟基结构，而该结构与邻苯三酚结构相似^[28]，O₂^-·在氧化邻苯三酚的同时会使茶多酚快速氧化，产生更多O₂^-·。而金花茶花总黄酮、茶多酚等活性成分都含有羟基结构，推测其可能在反应中被氧化，无法较好地发挥抗氧化作用。本研究中金花茶花对O₂^-·的去除能力与总黄酮含量、茶多酚含量均呈极显著负相关关系，可能与反应体系不稳定有关^[8]。

金花茶花对·OH的去除能力和总还原力均与活性成分总黄酮、茶多酚含量呈极显著的正相关关系，说明总黄酮和茶多酚这两种活性成分是金花茶花抗氧化能力的部分物质基础。但是金花茶花中还含有其他的重要生理保健物质^[29]和营养成分如总多糖、总皂苷和微量的矿物质元素Fe、Mn、Zn等，它们可能相互协调，对金花茶花的抗氧化能力起到一定的促进作用。为更好地深入探讨金花茶花的抗氧化活性，后期还需要对这些生理活性物质、营养成分以及微量矿质元素等进一步分析。

4 结论

通过对9种金花茶花抗氧化活性及总黄酮、茶多酚含量的测定与分析，结果表明金花茶花抗氧化活性由强到弱依次为凹脉金花茶＞毛瓣金花茶＞中东金花茶＞武鸣金花茶＞崇左金花茶＞龙州金花茶＞普通金花茶＞天峨金花茶＞东兴金花茶；金花茶花对·OH的去除能力和总还原力与其总黄酮、茶多酚含量呈极显著正相关关系。本研究对金花茶药用价值和生理保健功能的进一步研究具有积极意义，亦可为开发优质金花茶产品提供参考。