0 引言

绿桐(Paulownia fortunei×Paulownia tomentosa)也叫青桐，是玄参科泡桐属(Paulownia)植物，因树皮呈绿色而得名，是由白花泡桐Paulownia fortunei与毛泡桐Paulownia tomentosa通过杂交培育出来的泡桐新品种。绿桐具有适应性强、生长迅速、成材量大、木材物理性能好、可高密度种植等优点^[1-4]，故其幼苗的市场需求量极大。由于绿桐种子较小且发芽率低，因此目前主要采用埋根或埋条等无性繁殖方式来获得绿桐幼苗。但是，绿桐无性繁殖速度慢且需要较大的人力及占地面积，导致在短期内难以获得大量优质苗木。另外，在无性繁殖过程中易造成苗木体内病毒的“累积”效应，致使丛枝病(通过种根和种苗传播)逐代加重，严重影响绿桐的生长速度和成材率。通过组织培养技术快速获得大量的绿桐组培苗，可以解决当前在种植区苗木带菌率高、病害随繁殖材料传播蔓延等问题，满足当前市场需求。有关泡桐属其他树种的组织培养研究较多，如范国强等对白花泡桐的愈伤诱导^[5]及体细胞胚诱导^[6-8]等组织培养技术进行研究，认为泡桐最适诱导愈伤组织培养基为MS+0.1 mg/L萘乙酸(NAA)+14 mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)；幼芽生根最优培养基为1/2 MS+0.1 mg/L NAA。刘飞等^[9]对组培苗离体开花体系进行了研究。孔德广等^[10]采取温度处理组培苗后结合茎尖培养脱去植物菌原体的脱毒方法，既能保证种苗无病，又能保持泡桐原来的优良特性。田国忠等以泡桐成年树上茎段为外植体，获取再生植株，并结合茎尖培养方法进行脱毒试验^[11]，同时还对泡桐组培脱毒苗和规模化生产关键技术进行优化和完善^{[12, 13]}，结果表明使用0.1%升汞(HgCl₂)对外植体进行消毒(茎尖消毒7-8 min，茎段消毒10-12 min)，消毒效果较好，且对外植体伤害较小，萌发较快，易获得无菌苗；春季营养杯苗移栽适宜时间为3月中旬至5月初，秋季移栽时间为8月下旬至10月上旬。杨晨星等^[14]对大岩桐外植体消毒进行研究，结果显示10% H₂O₂消毒处理，外植体污染和褐化率较高；消毒效果较好的2个组合为75%乙醇30 s+0.1% HgCl₂消毒10 min和75%乙醇30 s+5% NaClO消毒10 min，该研究为其他类似植物外植体消毒提供参考。江香梅等^[15]以“桐优1”等3个泡桐品种的叶片、茎段、根萌条为外植体材料进行诱导试验，结果发现根萌条是建立泡桐无菌体系的理想材料。苏江等^[16]建立白花泡桐的组织培养技术，认为最佳培养基如下：初代诱导培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA，芽诱导率超70%；继代增殖培养基为MS+4.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L IBA和MS+0.4 mg/L 6-BA+0.04 mg/L IBA中交替培养，增殖系数可达6.0以上，且芽长势健壮，外植体发生玻璃化的概率小于5%；生根培养基为1/2 MS+0.2 mg/L NAA，生根率达98%以上。这些研究为泡桐的快速扩大繁殖奠定了良好技术基础，为绿桐的组织培养提供了丰富的理论参考。但由于植物组织培养存在种属特异性，不同种属之间差别很大^[17]，因此不同泡桐优良单株的最优组培脱毒技术和方法也不尽相同^[18]。另外，幼苗从生根到室外移栽成活率极低，因此需要对绿桐组织培养技术进一步研究。目前有关绿桐组织培养的研究还鲜有报道，加之市场上绿桐组培苗供应量小，价格奇高(每株高达几十元)，完全满足不了市场需求。因此，本研究拟建立绿桐快繁技术体系，通过对外植体消毒方式、不定芽诱导及增殖继代、组培苗生根及室外移栽等因素进行系统性研究，为工厂化生产绿桐组培苗提供技术参考。

1 材料与方法 1.1 材料

供试材料绿桐1号由广西瑞谱生物科技有限公司提供，选取当年生嫩枝或从大树旁长出的嫩枝作为外植体，取材期为2018年4月。所用琼脂，蔗糖，MS培养基所需的微量元素、大量元素，有机物试剂，以及植物生长调节剂如6-苄氨基嘌呤(6-BA)、赤霉素(GA₃)、2, 4-对氯苯氧乙酸(2, 4-D)、萘乙酸(NAA)、吲哚-3-丁酸(IBA)均为国产分析纯。

1.2 方法 1.2.1 外植体消毒

选取健壮的速生绿桐当年生枝条。截取前端30 cm左右，剪去叶片，保留叶柄2-3 cm，修整后的枝条置于加有2滴洗洁精的水中浸泡5 min；流水冲洗20 min，转入超净台，剪成长4-5 cm且带有一个或者2个叶柄的小段，用75%酒精浸泡30 s。然后分成3等份分别进行以下处理：(1)0.1%升汞浸泡8 min；(2)10%次氯酸钠和0.1%升汞等体积混合，浸泡8 min；(3)10%次氯酸钠和0.1%升汞等体积混合消毒处理5 min，无菌水冲洗1次，然后用0.1%升汞消毒3 min。最后分别用无菌水冲洗3次后待用。每个处理10瓶，每瓶接种10个外植体，外植体得率(%)=无污染外植体数/外植体总数×100%。

1.2.2 植物生长调节剂及其用量对腋芽萌发的影响

将消毒外植体(茎段)两端各斜切小部分并除去叶柄，然后接种于含有不同浓度6-BA (0.8，1.0，1.2 mg/L)、GA₃ (0，0.8 mg/L)和2, 4-D (0.5，1.0 mg/L)的MS培养基中诱导腋芽，每个处理3个重复，每个重复接种外植体50个。培养过程中统计污染率，培养30 d后统计腋芽诱导率。诱导率(%)=萌发腋芽数/接种茎段数×100%。

1.2.3 植物生长调节剂及其用量对不定芽增殖的影响

初代培养诱导出的不定芽离体后，分别接种于含有不同浓度的6-BA (0.6，0.8，1.0，1.2 mg/L)和NAA (0，0.2，0.4 mg/L)的MS增殖培养基上，每个处理3个重复，每个重复接种不定芽60个。培养30 d后统计不定芽的增殖系数，期间定期观察不定芽的长势。

1.2.4 植物生长调节剂及其用量对不定芽生根的影响

剪取继代增殖培养中长势较好、株高3 cm以上的不定芽，分别接种于含不同浓度的IBA (0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg·L^-1)和NAA (0.2, 0.4, 0.6 mg/L)的1/2 MS生根培养基中，每个处理3个重复，每个重复接种不定芽50个，每个组培瓶接种不定芽5个。培养15 d后，统计平均根长、根数、生根率及芽生长情况。生根率(%)=生根的不定芽数/接种的总芽数×100%。

上述培养基均添加30 g/L蔗糖，4.5 g/L琼脂粉，调整pH值为5.8。培养室温度为26-28℃，光强为2 200 lx，光照周期为12 h/d。

1.2.5 组培苗室外移栽

组培苗生根培养约30 d后，选择株高8-10 cm，根长约3 cm且根系发育良好的绿桐无菌苗，将根部培养基清洗干净，清洗时应避免根部断裂或受伤，然后移栽至无菌营养土中。采取以下移栽方式移栽：①直接移栽——将组培移栽至无直射光照室内培养7 d，然后室外正常自然光照；②先炼苗后再移栽——将组培苗在自然通风及光照条件下的实验室炼苗7 d，然后移栽并进行覆膜保湿7 d，转入室外正常自然光照；③不炼苗，移苗后覆膜——组培苗移苗后覆膜保湿7 d，室外正常自然光照。35 d后统计各个处理的移栽成活率。

2 结果与分析 2.1 消毒方法对绿桐外植体污染及腋芽萌发的影响

消毒处理方式及消毒时间对外植体污染及腋芽萌发有显著影响：消毒剂毒性过大或消毒时间过长，腋芽萌发慢甚至不萌发；消毒剂毒性过小或时间过短，外植体灭菌不彻底，污染率过高。

从表 1可以看出，不同消毒方式处理的茎段，其萌发时间不同且茎段的颜色也会受到影响，方法(1)和(2)的萌发时间较长，外植体污染率均超过50%，且外植体颜色由最初的深绿色变为浅绿色，有的甚至变为棕色，说明消毒对外植体伤害较大；方法(3)处理过的茎段得率最高为62%，且腋芽萌发时间也最短(12 d)，说明此消毒方法最有效，且对外植体毒害较小，保证了外植体的成活和诱导效果。因此，消毒方法(3)适用于绿桐茎段的消毒。

2.2 植物生长调节剂对不定芽诱导的影响

在含不同植物生长调节剂的MS培养基上，茎段腋芽萌动及长势差异明显(表 2)。MS培养基中的生长调节剂为1.0 mg/L 6-BA + 1.0 mg/L 2, 4-D + 0.8 mg/L GA₃时，茎段腋芽诱导效果最好，诱导率可达78%;诱导时间约12 d时，叶柄基部的芽点开始萌动，约20 d逐渐生长成不定芽，且长势最好，诱导出的不定芽比较健壮。而其他配方诱导率较低，腋芽长势弱，萌发较慢。

2.3 植物生长调节剂对绿桐不定芽增殖的影响

将诱导产生的不定芽切段转接到含不同浓度6-BA和NAA的MS增殖培养基上，不定芽出现时间及增殖系数随着培养基中6-BA、NAA组成及含量的变化而不同(表 3)。当培养基中无植物生长调节剂时，无法实现不定芽增殖。培养基中只添加6-BA时，茎段均能诱导产生不定芽，当6-BA浓度为1.0 mg/L，不定芽增殖系数最高(1.08)；而其浓度高于1.0 mg/L时，增殖系数开始下降。培养基中只添加NAA时，无法实现不定芽增殖，但接种的不定芽茎段长势良好，有明显的伸长现象，并产生较多的根。当培养基中6-BA和NAA浓度分别为0.8，0.4 mg/L时，不定芽增殖效果最好，增殖系数可达2.02，继代培养周期约为21 d，不定芽生长粗壮(图 1a)；当6-BA和NAA浓度分别为0.8，0.6 mg/L时，新的不定芽叶片出现玻璃化现象，增殖系数降低。以上结果表明：绿桐不定芽增殖的最适植物生长调节剂为0.8 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA。

2.4 植物生长调节剂对绿桐不定芽生根的影响

剪取株高3 cm以上且带有4片左右叶片的绿桐小芽转入生根培养基上诱导生根，7 d左右有的小芽基部开始出现白色凸起，然后逐渐成长为根系，15 d后统计生根实验结果。由表 4可以看出，不添加任何激素时，绿桐小芽根点出现时间晚，根数量少且长势弱；而在添加植物生长调节剂的培养基上，小苗的生根率都较高。当植物生长调节剂组合为0.6 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA，以及0.4 mg/L NAA+0.4 mg/L IBA时，小芽在8-10 d出现根点，但根生长较慢，粗短、丛生，植株生长也较慢；当组合为0.8 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA，以及0.8 mg/L NAA+0.4 mg/L IBA时，小芽出现根点需要8-10 d，根生长较快，但基部会有愈伤组织出现，有的根呈海绵状，植株长势旺盛，但不利于后期移栽；当植物生长调节剂组合为0.6 mg/L NAA +0.4 mg/L IBA时，7 d即可观察到大量根长出，培养30 d时生根率可达100%，且根长势均匀、数量多且健壮，根系长满培养基；叶片肥厚，呈深绿色，株高可达10 cm以上(图 1b)。以上结果表明，绿桐不定芽生根最适植物生长调节剂为0.6 mg/L NAA+0.4 mg/L IBA。

2.5 炼苗及移栽方式对绿桐无菌苗成活的影响

炼苗及不同的移栽方式对绿桐幼苗成活率有显著影响(表 5)。移栽方式①中，绿桐幼苗未经炼苗，且未进行任何保湿措施，绿桐无菌苗成活率较低，只有35%；方式③虽然进行了膜覆盖保湿保温处理，但未进行炼苗，绿桐无菌苗成活率为52%；而移栽方式②先对绿桐幼苗进行自然光炼苗处理后再移苗，并用保湿膜覆盖，以保持幼苗湿度和温度，其存活率可达92%(图 1c)。绿桐幼苗生长2个月可高达30 cm，可进行移栽(图 1d)。

3 讨论 3.1 消毒方式对绿桐外植体消毒效果影响

获得无菌外植体是植物组织培养成功的必要前提，常通过化学药剂如酒精、升汞、次氯酸钠等对植物材料表面进行消毒，不同消毒方式对植物的消毒机理和伤害不同，消毒剂及消毒时间对植物外植体的消毒效果、存活率及出芽率有显著影响^[5]。为降低对外植体的伤害且达到消毒目的，通常将消毒剂组合使用。另外，消毒时间过长对外植体的毒害作用较大，会褐化外植体或者直接将其杀死，进而使腋芽无法萌发，无法建立组培体系；若消毒时间过短，则无法获得无菌外植体^[19]。田国忠等^[12]研究发现，酒精对泡桐外植体伤害较大，消毒剂可以只用0.1%升汞，但污染率偏高。本研究在借鉴前人经验的基础上，对绿桐消毒方式进行研究，结果发现：只是用酒精，消毒效果较差且容易褐化，这与前人研究结果一致^{[11, 18]}；当使用3种消毒剂组合(先用75%酒精消毒后，再用10%的次氯酸钠与0.1%升汞等体积混合液消毒，最后用0.1%升汞消毒)时，外植体污染率低于40%，且受到的伤害最小，易于腋芽萌发，这与一些文献报道结果类似^[14]。

3.2 植物生长调节剂在绿桐组织培养中的作用

植物生长调节剂的组成及浓度对离体组织的诱导、增殖及生根等生长发育起关键作用^[20]。其中细胞分裂素可引起细胞分裂并诱导芽的萌发和生长，生长素则促进植物细胞伸长和根系分化。在特定范围内，外植体芽的诱导、增殖及根的分化由细胞分裂素与生长素的种类和浓度决定^[21]。本研究发现6-BA对绿桐不定芽产生起到关键作用，不添加6-BA时无法诱导出不定芽，这与一些研究结果类似^{[5, 14]}。但单纯的6-BA不利于绿桐芽的诱导分化，诱导率较低，芽生长比较缓慢；而6-BA过高时，虽可诱导产生大量不定芽，但玻璃化严重；本实验在借鉴前人研究^{[10, 13]}的基础上，通过额外添加激素GA₃，获得最优诱导培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2, 4-D+0.8 mg/L GA₃，该培养基配方提高了绿桐出芽诱导率，且芽生长健壮。另外，在生根诱导实验时发现：NAA浓度偏高会导致绿桐组培苗产生大量愈伤组织和畸形根，而过低又会导致生根率偏低、生根慢，且根比较细弱，这与许多报道类似^{[5, 21, 22]}。在添加NAA的基础上，再添加0.4 mg/L IBA，可使绿桐生根率达100%，且植株更加健壮和整齐，所以绿桐生根诱导培养基为1/2 MS+0.6 mg/L NAA+0.4 mg/L IBA，这与前人报道^{[5, 9]}稍有出入，可能是不同基因型和外植体差异造成。

3.3 绿桐组培苗移栽

植物组培苗的炼苗和移栽是快繁体系最后一个核心环节。移栽成活率的高低直接影响组培快繁的生产成本^[23]。组培苗不经过炼苗直接进行移栽，由于植株过于幼嫩，移栽后易引起烂根死亡，影响幼苗的成活率^[24]。基质的选择、灭菌及移栽后的保温、保湿等措施对苗的成活也起到重要作用。试管苗比较幼嫩，从无菌转入有菌环境生长，如果没有灭菌、保湿等保护性措施就很难抵御外界杂菌的侵染及干燥等复杂环境，容易染菌或干枯死掉，所以移栽前必须做好基质的消毒及移栽后的覆膜保温、保湿等工作^[25]。本实验中，先对绿桐组培苗炼苗7 d后再进行移栽，移栽后用地膜覆盖保湿，组培苗成活率可达92%。

4 结论

本研究对绿桐外植体消毒方式、诱导分化及炼苗条件进行实验，结果表明：最佳消毒方式为依次采用75%乙醇、等体积10%次氯酸钠与0.1%升汞混合液、0.1%升汞消毒；选择当年生嫩条顶端10 cm长度的茎段为最佳外植体；外植体在MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2, 4-D+0.8 mg/L GA₃的培养基中，能诱导出长势健壮的不定芽；在MS+0.8 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA的增殖培养基中，增殖系数达2.02；而生根以1/2 MS+0.6 mg/L IBA+0.4 mg/L NAA培养基为最佳，生根率可达100%；组培苗炼苗后移栽，再进行覆膜保湿，移栽存活率可达92%。本研究建立了一整套绿桐快速繁殖体系，为后期绿桐组培苗大规模生产打下良好基础。