0 引言

苦丁茶(Ilex latifolia)属冬青科冬青属苦丁茶冬青种^[1]，常生长于海拔400-800 m的山谷、溪边杂木林或灌丛中，主要分布在西南和华南等地区。苦丁茶中主要含有多酚、多糖、生物碱、甾体、三萜、皂苷、黄酮、氨基酸、维生素及对人体有益的多种微量元素等^[2]，是民间一种传统凉茶饮料，具有清热镇痛、清凉解毒、降脂降压、抑菌减肥之功效^[3]。五棱苦丁茶(Ilex pentagona)是冬青科冬青属植物，多生长于石灰山林中，其味甘苦，性凉微寒，具有清热解毒、降压减肥、抑癌防癌等药理疗效，可作苦丁茶的代用品^[4]。异叶梁王茶(Nothopanax davidii)系五加科梁王茶属植物，主要分布于疏林或阳性灌丛中、林缘、岩石隙。药用部位为树皮，民间草药，具有抗风湿、强筋骨等功效^[5]，彝药用其根皮、茎皮治疗胃病、咽喉热痛。梁王茶还可以泡开水作茶饮。苦丁茶、五棱苦丁茶、异叶梁王茶是喀斯特地区的特色药材及凉茶饮品，广西桂西北、桂东北及贵州、云南等山区少数民族广泛饮用的保健养身茶，具有较好的经济价值。本研究采用单因素和响应面方法优化五棱苦丁茶的总黄酮提取工艺，并采用此工艺提取苦丁茶、五棱苦丁茶和异叶梁王茶的总黄酮，进一步对其体外抗氧化活性进行体外羟基自由基、超氧阴离子和二苯基苦基苯肼自由基的清除试验^[6]，为苦丁茶、五棱苦丁茶、异叶梁王茶的提取工艺研究、开发利用提供一些科学理论知识。

1 材料与方法 1.1 材料

五棱苦丁茶、异叶梁王茶采自广西乐业神木天坑(24°48′41″ N, 106°28′05″ E)，苦丁茶采自广西植物研究所(桂林雁山区)。实验使用3种茶的叶片，烘干粉碎，过60目筛。

1.2 方法 1.2.1 总黄酮标准曲线的制作

精取芦丁标准样品20 mg，溶于60%乙醇中并定溶于50 mL容量瓶，得到0.4 mg·mL^-1的芦丁标准液。分别吸取标准液1，2，4，6，8，10 mL置于25 mL容量瓶中，加入10 mL 50%乙醇、1 mL 5%亚硝酸混匀，静置6 min；然后加入1 mL 10%硝酸铝混匀并静置6 min，最后加入10 mL 4%氢氧化钠并使用50%乙醇定容，静置15 min后在510 mm处测定吸光值。获得总黄酮回归方程：y=0.1852x+0.031，R²=0.999 5，并绘制标准曲线。

1.2.2 提取工艺

分别称取样品粉末0.5 g，按照一定料液比加入40 %乙醇，在适宜温度下超声提取一定时间，提取结束后，过滤，定容至50 mL，即得供试品溶液。

精取3 mL试品溶液，加50%乙醇至10 mL，再加入5%亚硝酸钠1 mL，混匀，静置6 min；加10%硝酸铝溶液1 mL，混匀，静置6 min；加4%氢氧化钠溶液10 mL，50%乙醇调至刻度，混匀，静置15 min后在510 nm处测定吸光度，按照总黄酮回归方程计算总黄酮含量。

1.2.3 单因素试验

参考唐健民等^[7]，赵娟娟^[8]的试验方法，采用乙醇浓度、料液比、温度、时间、超声波功率、超声波频率等进行单因素试验，考察各因素对五棱苦丁茶总黄酮得率的影响。

1.2.4 响应面分析

分析对比各单因素试验对五棱苦丁茶总黄酮得率的影响，选取影响总黄酮得率比较大的4个因素：料液比、超声功率、提取温度、提取时间(表 1)，通过Design Expert 8.0.6软件设计进行组合试验^[9-12]。

1.2.5 体外抗氧化活性试验

参照文献[13-16]，对·OH清除率、DPPH·清除率、·O₂^-清除率和总还原力的测定实验步骤进行设计，以VC作对照。其计算公式如下：

·OH清除率(%)=(A_s—A_p)/(A_b—A_p)×100%，

DPPH·清除率(%)=[A₀—(A₁—A₂)]/A₀×100%，

·O₂^-清除率(%)=[A₀—(A₁—A₂)]/A₀×100%。

2 结果与分析 2.1 单因素试验结果 2.1.1 乙醇浓度对总黄酮得率的影响

如图 1所示，乙醇浓度对五棱苦丁茶总黄酮得率有较明显的影响。随着乙醇浓度的增加，总黄酮得率呈现先增加后降低的趋势。在乙醇浓度为20%时，总黄酮的得率最低，为2.79%；随着乙醇浓度增加至40%时，总黄酮得率达到最高值4.31%；后期乙醇浓度虽然不断增加，但总黄酮得率都未能超过4.31%，因此确定提取总黄酮的最佳乙醇浓度为40%。

2.1.2 料液比对总黄酮得率的影响

物料的精准对于试验成本的节约非常重要。由图 2可知，料液比从1:20 (g/mL)增加至1:30 (g/mL)，总黄酮得率显著提高；料液比由1:30 (g/mL)至1:40 (g/mL)，总黄酮得率增幅平缓；当料液比为1:50 (g/mL)时，总黄酮得率达到最高值5.01%。随后随着料液比的增加得率急速下降。因此，结果表明料液比1:50 (g/mL)为宜，继续增大溶剂量不仅浪费溶剂而且还会降低总黄酮的产出。

2.1.3 温度对总黄酮得率的影响

温度对总黄酮的提取影响较大，温度较低无法充分浸提; 温度较高则会破坏化合物的结构，影响总黄酮的产出。从图 3可看出，提取温度为30℃时，五棱苦丁茶总黄酮得率只有3.10%；随着温度上升，总黄酮的得率也不断提高，在60℃时达到峰值，为4.27%。后期温度虽然不断升高，但是总黄酮得率反而逐渐降低，说明五棱苦丁茶总黄酮提取的最佳温度为60℃。

2.1.4 时间对总黄酮得率的影响

由图 4看出，超声提取时间在30 min时，五棱苦丁茶的总黄酮提取效率最高，达到4.38%。当提取时间不足30 min时，提取不完全，得率低；超过30 min, 则随着时间的增加，总黄酮得率逐渐下降，说明超声时间过长，空化作用使得总黄酮得率下降。因此，最佳的提取时间定为30 min。

2.1.5 超声功率对总黄酮得率的影响

超声功率过小，提取不完全；超声功率过高，空化作用会破坏总黄酮的结构，影响提取率。由图 5可知，五棱苦丁茶总黄酮得率在420 W时达到最大值，为4.03%。因此，最佳的超声功率定420 W。

2.1.6 超声频率对总黄酮得率的影响

根据图 6可得，超声频率为低频(35 kHz)时的提取率优于超声高频(61 kHz)。超声低频时，五棱苦丁茶总黄酮得率为3.53%；超声高频时，总黄酮得率为3.09%。因此，超声辅助提取总黄酮时选择低频(35 kHz)。

2.2 响应面试验 2.2.1 响应面试验结果

以料液比、超声功率、提取温度、提取时间为自变量，设计响应面试验(表 2)。模型回归方程为Y=4.52+0.057A+0.11B+0.40C+0.20D-0.035AB+0.11AC-0.054AD-0.073BC+0.002BD-0.046CD-0.23A²-0.15B²-0.39C²-0.25D²，其中Y为总黄酮得率的预测值。该模型回归方程相关系数R²=0.984 0，矫正系数AdjR²=0.986 0。由表 3可以看出，P＜0.000 1，表明此模型在显著性上极其显著，试验的实际值和预测值拟合度比较好，具有较高的统计学意义。

2.2.2 模型交互作用分析

通过Design-Expert软件将AC、BC、AD交互进行比较分析，获得响应面曲线图(图 7)：每个响应曲面都开口向下，呈现凸面形状，等高线图 3D图上的投影为最高值，交互作用点突出表示各因素对总黄酮提取的影响也显著突出。

2.2.3 条件优化与结果验证

通过响应面模型优化，获得五棱苦丁茶总黄酮的最佳提取条件：料液比1:50(g/mL)，超声功率316.8 W，提取温度64.9℃，提取时间35.2 min，提取率为4.47%。用最佳条件进行验证试验(重复5次)，得到五棱苦丁茶总黄酮得率的平均值为4.98%。实际值和预测值相差0.11，表明该提取工艺重复性好，模型可靠。

2.3 3种茶叶总黄酮含量比较

根据优化后的五棱苦丁茶总黄酮提取工艺，分别对3种茶叶进行总黄酮提取及含量测定。由图 8可知，苦丁茶、五棱苦丁茶和异叶梁王茶总黄酮含量分别是10.61%、4.98%和15.73%，其中异叶梁王茶总黄酮物质最多。

2.4 3种茶叶总黄酮体外抗氧化活性

对3种茶中的总黄酮进行羟基自由基·OH、超氧阴离子·O₂^-、二苯基苦基苯肼自由基DPPH·清除试验。当黄酮浓度为1 mg/mL时，苦丁茶、五棱苦丁茶和异叶梁王茶对·OH的清除率分别是39.61%、12.33%和53.02%，对·O₂^-的清除率分别26.84%、23.92%和49.84%，对DPPH·的清除率分别是69.22%、58.52%和73.96%。其中异叶梁王茶的抗氧化性最强，对·OH、·O₂^-和DPPH·的清除率最高，分别为53.02%、49.84%和73.96%(表 4)。

3 讨论

本试验通过响应面法优化五棱苦丁茶总黄酮提取工艺，获得五棱苦丁茶总黄酮提取工艺的最佳组合：超声波功率316.8 W，超声频率35 kHz，乙醇浓度40%，料液比1:50，提取温度64.9℃，提取时间35.2 min。使用最佳提取条件对苦丁茶、五棱苦丁茶、异叶梁王茶进行总黄酮提取，其得率分别为10.61%、4.98%和15.73%。笔者同时还研究了苦丁茶总黄酮的提取工艺，通过单因素试验和响应面试验，得到苦丁茶总黄酮的最佳提取工艺组合：超声波功率(411.6 W)，超声频率(35 kHz)，乙醇浓度(100%)，料液比(1:48.5 g/mL)，提取温度(68.9℃)，提取时间(20 min)，此工艺所提取的苦丁茶总黄酮得率为9.02%(实验数据未发表)。通过两个工艺对比发现，采用五棱苦丁茶总黄酮的最佳提取工艺提取苦丁茶总黄酮，其得率可达10.61%，说明五棱苦丁茶总黄酮的最佳提取工艺对苦丁茶总黄酮的提取也是最优的，并确定此提取工艺条件为五棱苦丁茶和苦丁茶的总黄酮的最优提取工艺。相对于张枝等^[17]研究苦丁茶超声提取黄酮工艺(提取时间1.5 h，提取率2.34%)而言，本工艺提取黄酮的时间更快(提取时间35.2 min)，含量更高(提取率10.61%)，显著地优化和提升了超声波提取苦丁茶总黄酮的工艺水平。延永等^[18]采用5种黄酮提取方法对苦丁茶中黄酮类物质的提取效率进行比较，研究发现乙醇回流提取法(12.43%)>超声波提取法(9.16%)>微波提取法(8.68%)>热水提取法(6.42%)>碱液提取法(4.63%)；其研究结果表明乙醇回流提取法提取的含量最高，但是其乙醇回流时间需要2.5 h，时间较长，不利于黄酮的大量提取。本提取工艺较为简单，易于操作，提取黄酮的时间和含量的效益值较高。研究并未验证是否为异叶梁王茶的最佳提取工艺，总黄酮结果仅为异叶梁王茶的开发研究提供基础的黄酮数据，对于异叶梁王茶的提取工艺后期可以深入研究。

4 结论

本试验对五棱苦丁茶总黄酮提取工艺进行响应面法优化，并对五棱苦丁茶、异叶梁王茶与苦丁茶的总黄酮和抗氧化活性进行提取、对比试验。试验结果表明3种茶叶均具有较好的总还原力，抗氧化活性较好，其中以异叶梁王茶对·OH、·O₂^-和DPPH·的清除率最高，分别为53.02%、49.84%和73.96%。研究结果为五棱苦丁茶、异叶梁王茶资源开发奠定一定的科学基础。