0 引言

自由基的存在和活动是人体代谢紊乱的重要诱因之一^[1]，大部分自由基容易与细胞成分反应，引起细胞损伤，从而引发生物体内各种疾病并导致衰老^[2]。外源性抗氧化剂可以修复自由基导致的重要生物大分子的损伤，适当补充外源性抗氧化剂可以平衡体内自由基，预防疾病，延缓衰老^[3-4]。黄酮类化合物广泛存在于植物皮、根、叶、果实中，是天然有机化合物，具有广泛的生物活性，可抗氧化、抗肿瘤、抑菌、抗炎、抗过敏等^[5-6]。

芸香科植物化州柚(Citrus grandis 'Tomentosa')或柚(Citrus grandis (L.) Osbeck)的花量大，产量高，其药用化学成分具有抗菌、抗寄生虫、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等生物活性^[7]；其未成熟或近成熟的干燥外层果皮——化橘红^[8]含有黄酮类化合物、挥发油、香豆素类化合物、多糖等有效成分^[9]。郑亚美等^[10]通过正交实验所得最佳提取工艺提取的蜜柚叶黄酮得率为12.4 mg/g。一般柑橘属植物花量越大其落花落果越严重，坐果率越低^[11]，超过95%的花果会脱落，造成严重浪费，疏花、疏果和整枝修剪是克服果树大小年和提高果品质的重要手段。目前对化州柚落花、落果和叶进行开发利用的研究报道相对较少。本文对化州柚的叶片以及生理性落花、落果中的总黄酮含量及其抗氧化活性进行研究，为化州柚落花、落果和叶的开发利用提供依据，变废为宝。

1 材料与方法 1.1 材料

样品：化州柚落花(2018年3月11日采集)，化州柚落果(第一次生理落果)及成熟叶(2018年3月25日采集)，采样地点为广西玉林市陆川县清湖镇天然润宝公司化州柚基地。

试剂：芦丁标准品，三氯化铝(结晶，分析纯)，甲醇(分析纯)，无水乙醇(分析纯)，九水合硝酸铝(分析纯)，抗坏血酸(分析纯)，1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(分析纯)，水杨酸(分析纯)，七水合硫酸亚铁(分析纯)，过氧化氢(分析纯)，浓硫酸(分析纯)，高锰酸钾(分析纯)。

1.2 仪器

UV-1800紫外-可见分光光度计(岛津)，循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)，HH-S恒温水浴锅(常州市金坛友联仪器研究所)，KQ-500 DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，纯水制造系统(成都优越科技有限公司)，多功能粉碎机(拜杰)，电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械厂)。

1.3 方法 1.3.1 样品处理

将采集的花、果、叶分拣整理，用超纯水冲洗，置于鼓风干燥器中105℃杀青30 min，70℃烘干，磨粉，过40目筛。

1.3.2 化州柚不同部位总黄酮类的提取及测定 1.3.2.1 标准曲线的绘制

参考任顺成等^[12]的方法，稍作改进：精确称取10 mg芦丁标准品，用甲醇溶解，转移到100 mL容量瓶中，定容，得到浓度为0.1 mg/mL的芦丁标准溶液。精确吸取0 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL芦丁标准溶液分别置于10 mL比色管中，分别加入5 mL 0.1 mol/L三氯化铝甲醇溶液，定容，摇匀，显色10 min后在385 nm处测定吸光度(A)，以A为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.3.2.2 回归方程的测定

精密量取化州柚待测样液1 mL置于比色管中，加入浓度10%Al(NO₃)₃·9H₂O溶液1 mL，甲醇定容至10 mL，摇匀，放置20 min，另取1 mL 10% Al(NO₃)₃·9H₂O溶液置10 mL比色管中，加甲醇至刻度，作为空白对照溶液于385 nm处测定波长(3个平行)，依据绘制的标准曲线求得总黄酮含量回归方程。

1.3.2.3 化州柚不同部位提取液的制备

沸水浸提^[12]：准确称取打磨好的样品各1.00 g，置于锥形瓶中，按照1:40固液比，加入刚煮沸的纯水中，置于90℃恒温水浴锅中浸提30 min，浸提结束后趁热用真空泵抽滤，提取两次，合并提取液后移入100 mL容量瓶中，定容备用。

60%乙醇超声浸提^[13]：准确称取打磨好的样品各1.00 g，置于锥形瓶中，按照1:40固液比，加入60%乙醇溶液(纯水:无水乙醇=4:6，V:V)，在60℃、60%功率下，超声30 min，用真空泵抽滤，提取两次，合并提取液后移入100 mL容量瓶中，定容备用。

Vc(抗坏血酸)对照液的制备^[14]：准确称取25 mg抗坏血酸，用60%乙醇溶液溶解，定容于500 mL棕色容量瓶，得到0.05 mg/mL抗坏血酸溶液，摇匀备用(现配现用)。

1.3.2.4 化州柚不同部位提取液中总黄酮得率的测定

用移液枪移取0.5 mL提取液于10 mL比色管中，加5 mL 0.1 mol/L三氯化铝甲醇溶液，纯水定容，摇匀，静置10 min后，在385 nm处测定吸光度，由标准曲线求得样品中总黄酮含量。总黄酮得率＝[(Y×20V)/(M×1000×1000)]×100%，式中：Y 为测定的浓度，μg/mL；V为提取液总体积，mL；M为样品质量，g。

1.3.3 抗氧化时间测定

量取各待测液，超纯水(空白对照)与60%无水乙醇(空白对照)各1 mL，分别置于50 mL量瓶中，加水定容至刻度，摇匀；精密量取10 mL，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数20% H₂SO₄ 2 mL，振摇1 min；精密加入0.02 mol/L KMnO₄ 0.05 mL，同时开始秒表计时；当溶液的紫红色完全消退时，停止秒表，记录的时间即为供试品的氧化时间(平行测定3次)^[15-16]。

1.3.4 DPPH自由基清除能力测定

准确称取19.7 mg DPPH用少量无水乙醇溶解，再以无水乙醇定容至250 mL，配成200 μmol/L的储备溶液，置棕色瓶中于冰箱内备用。移取5 mL DPPH储备液置于比色管中，分别加入1 mL、2 mL、3 mL、4 mL提取液，醇提液用无水乙醇定容，水提液用超纯水定容至10 mL，摇匀，置于阴暗处，分别于0.5 h、1.0 h、1.5 h测定吸光度^[17]。以无水乙醇为空白，测定反应体系在517 nm处的吸光度A_i；同时测定5 mL DPPH溶液加5 mL无水乙醇混合液的吸光度A_c；平行测定3次不同体积(1 mL，2 mL、3 mL、4 mL)提取液加入无水乙醇定容至10 mL的混合液的吸光度A_j。清除率(%)=[1— (A_i—A_j)/A_c]×100%。

1.3.5 羟基自由基(·OH)清除能力测定

在比色管中加入1 mL、2 mL、3 mL、4 mL的提取液，依次加入1 mL 6 mmol/L的硫酸亚铁溶液，1 mL 6 mmol/L水杨酸-乙醇溶液，然后加入0.1% H₂O₂ 1 mL启动反应，定容总体积10 mL，以超纯水补足体积^[18]。其中对照管不加样液，样底管不加H₂O₂，摇匀后在37℃水中温育0.5 h、1.0 h、1.5 h，在510 nm处测定吸光度，平行测3次。清除率(%)=[A_对照—(A_样品—A_样底)]/A_对照×100%。

1.4 数据分析

总黄酮标准曲线的回归方程由Excel作图得到，黄酮含量及抗氧化性的数据用SPSS软件处理，选用单因素ANOVA检验比较平均值分析，邓肯Alpha=0.01齐子集事后检验。

2 结果与分析 2.1 两种提取条件下化州柚不同部位总黄酮含量

总黄酮含量的回归方程：Y=0.025X+0.0099，R²=0.999 3，其中：Y为吸光度，X为黄酮浓度(mg/L)。

如表 1所示，化州柚各部位60%乙醇提取液的总黄酮含量大于水提液，说明化州柚3个不同部位中所含的黄酮类物质在有机溶剂中的溶解度大于水中，不同部位总黄酮得率差异明显，且落果>落花>叶。

2.2 化州柚不同部位抗氧化性研究 2.2.1 化州柚不同部位抗氧化时间

由表 2可知，不同浸提条件下化州柚各部位提取液抗氧化时间差异显著，60%乙醇提取液的抗氧化能力远大于水提液，落果和落花的抗氧化能力相近，高于化州柚叶片提取液。

2.2.2 DPPH自由基清除能力

由表 3可知，各部位提取液对DPPH自由基有很强的清除率，不同提取方法下的清除率存在差异。各部位提取液对DPPH自由基的清除率与提取液浓度以及反应时间有关，在一定时间与浓度范围内呈正相关关系；在提取液浓度为40 mg/mL，反应时间为90 min时，水提液花、果、叶清除率(93.4%，96.2%，91.0%)高于60%乙醇提取液(90.1%，88.6%，88.5%)。实验中Vc的浓度为50 mg/L，Vc对DPPH自由基的清除率随浓度的增加而增加，当达到一定浓度后清除率基本不变，Vc对DPPH自由基的清除率与反应时间关系不大。

2.2.3 羟基自由基(·OH)清除能力

由表 4可以看到，Vc溶液和化州柚不同部位提取液对羟基自由基的清除率随着提取液浓度的增大而增大，不同提取液浓度间清除率差异显著，与反应时间关系不大。在提取液浓度为40 mg/mL，反应时间为60 min时，化州柚花的60%乙醇提取液对羟基自由基的清除率达70.3%，高于水提液清除率(49.7%)，同时也高于相同提取条件下的落果(45.1%)以及成熟叶(29.3%)。

3 讨论

实验中化州柚第一次生理落果的黄酮含量最高，其提取液的抗氧化性好，可考虑开发其药用价值。

化州柚落花的黄酮得率与任顺成等^[12]研究的市售19种花茶相比，黄酮得率高于其中17种花茶，实验过程中发现化州柚落花乙醇提取液和水提液均有独特浓郁芳香，且香味相对持久。化州柚投产树株产鲜花量大，正常管理的果树，一般都开花过量，使树体消耗过多养分，造成严重的大小年结果现象，疏花、疏果和整枝修剪果树高产高质栽培中不可缺少的环节，因此用化州柚花开发花茶饮品和化妆品前景广阔。

实验中化州柚叶片提取液对羟基自由基的最高清除率为32%。郑亚美等^[10]研究发现在蜜柚叶黄酮含量为0.2 mg/mL时对羟基自由基的清除率约为20%，当蜜柚叶黄酮含量达到2.5 mg/mL时对羟基自由基的清除率达97%，本实验浓度范围内化州柚叶提取液对羟基自由基的最高清除率为32%和29.3%，其原因是实验浓度内化州柚叶黄酮含量较低，最大浓度仅为0.083 2 mg/mL。实验中化州柚叶片黄酮得率较为可观，化州柚成熟叶既可以考虑其药用价值，也可以考虑在动物饲料方面的应用，如田刚等^[19-20]研究不同柚叶含量饲粮对肉兔生理机能的影响，认为饲粮中添加一定水平的柚叶对生长肉兔的屠宰性能有改善作用，表明化州柚叶在动物饲料方面的开发应用，可形成立体循环农业(树产饲料，林下养殖，粪便养树)。

4 结论

化州柚不同部位总黄酮含量相差很大，其含量变化为落果>落花>叶片。化州柚落果、落花及叶片的60%乙醇提取液总黄酮得率高于水提液，但化州柚各部位水提取液对DPPH自由基清除率高于60%乙醇提取液；各部位提取液对DPPH自由基的清除率与提取液浓度以及反应时间有关。化州柚落花60%乙醇提取液对羟基自由基的清除率远高于落果和叶片，可达到70.3%，清除效果良好。因此，可开发化州柚落果的药用价值，将化州柚花研发为花茶饮品和化妆品，同时利用化州柚叶为动物饲料。