2. 山东省海水健康养殖工程技术研究中心, 山东青岛 266104;
3. 山东省海水养殖病害防治重点实验室, 山东青岛 266104
2. Healthy Mariculture Engineering Research Center of Shandong Province, Qingdao, Shandong, 266104, China;
3. Shandong Key Laboratory of Disease Control in Mariculture, Qingdao, Shandong, 266104, China
重金属在生物体内的浓度受到周围环境中重金属浓度、蓄积能力及其他因素的影响，如生物利用度、盐度及食物摄取程度[1]。随着我国沿海地区经济的迅速发展，大量重金属元素进入到附近水体，对养殖水域特别是水产动物的污染越来越严重，即使在较低浓度下，重金属也可以进入水生生物体内，并通过食物链进入人体，危害人体健康。其中，镉是毒性较大的重金属之一，能够诱发人类患癌症[2-3]。
牡蛎是我国主要的海水贝类养殖品种之一，具有营养丰富、味道鲜美、生长速度快、经济效益高等优点，现已成为世界上最重要的经济贝类之一。牡蛎由于其滤食特性和移动性差极易富集重金属[4-5]，而重金属超标已对我国牡蛎养殖及相关产业发展产生严重的影响。生物体对重金属的吸收，主要取决于有效的金属离子浓度，而有效的金属离子浓度又受到盐度的影响[2-3]。因此，盐度是影响重金属离子分配的控制因素之一。河口是牡蛎的主产区之一，盐度随着潮汐和季节变化而波动，潜在地影响水环境中重金属的吸收率。有研究表明盐度对水生生物吸收重金属离子具有重要作用，且对不同的重金属作用不同[1-8]。如：铬的吸收不受盐度的影响[6]；镉受盐度影响最大且呈负相关的关系[6]；在盐度为0~25 psu时，砷、二价汞、甲基汞的吸收率随盐度的增加而增加[8]。
基因表达有助于从分子水平上阐明贝类对于重金属离子的吸收与排出机制。海洋生物受到污染物作用时会对其损伤效应产生综合反应，通过检查分子水平的损伤程度可进行污染早期预警预报。现有研究表明，热休克蛋白70(Hsp70)是受到热激、重金属、干旱、疾病、寄生虫感染等多种环境污染条件胁迫后产生的诱导蛋白[9]，在贝类不同组织中均有表达，其表达量随水环境和季节的变化而变化，具有广泛的反应性和较高反应灵敏度，可作为一种潜在的生物标记来检测环境污染。通过研究太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)Hsp70基因对镉的响应规律和特点，以期评价Hsp70作为污染物镉早期污染综合预警指示分子的可行性。
1 材料与方法 1.1 材料实验生物及饵料：太平洋牡蛎采自山东日照贝类养殖区，实验前暂养2周，每天投喂小新月菱形藻。牡蛎平均壳长91.56 mm，壳高33.73 mm。挑选体格健壮、活力旺盛、贝壳无破损、个体差异小的太平洋牡蛎为实验动物。
试剂：CdCl2(CAS:7790-78-5)。
1.2 镉的富集和排出富集和排出两个阶段在200 L聚乙烯桶中进行，实验过程中水体溶解氧含量≥6.5 mg/L。实验中盐度梯度分别为13 psu、20 psu、27 psu、34 psu，每24 h调盐度1次，先将自然海水加海盐调至盐度35 psu，再添加淡水调至实验所需浓度，盐度波动范围控制在±0.5 psu。
1.2.1 富集阶段向PVC桶内实验海水直接添加配好的含镉贮备液，加入镉贮备液后实验海水中镉的终浓度为0.01 mg/L。每个盐度梯度设置3个平行组，每组放入牡蛎70粒，水体为150 L。实验期间每个桶内放两个气石进行连续充氧，以保持实验期间水体中溶解氧含量充足和水体重金属的浓度分布均匀。实验过程中每日8:00投喂小新月菱形藻，投喂前先将实验桶内的海水排尽并更换上新配置的相同浓度实验海水，以保证试验期间海水中重金属浓度的恒定。每个盐度梯度设未添加镉的组作为相应的空白对照组。
富集实验持续28 d，期间平均水温为(24±2)℃，pH值为8.0±0.5。分别于0.083 d、7 d、14 d、28 d取牡蛎样品，每次取3个牡蛎，用不锈钢刀去壳，分别取0.1 g外套膜、消化腺及闭壳肌转入RNA保护液中，置于-20℃冰箱中，用于测定相关基因表达量。
1.2.2 排出阶段富集阶段结束后，将每个水桶中的实验溶液全部排掉，在干净的海水中进行贝体内富集重金属的排出实验。实验过程中每日8:00投喂小新月菱形藻。排出实验从第29天开始，持续35 d，期间平均水温为(24±2)℃，pH值为8.0±0.5。分别于35 d、42 d、49 d、56 d、63 d取牡蛎样品进行基因表达含量测定。取样方法与富集阶段相同。
1.3 荧光定量法检测不同组织中Hsp70基因表达水平 1.3.1 总RNA提取称取0.1 g组织(外套膜、消化腺)置于1.5 mL离心管中，加入1 mL TriPure Isolation Reagent，振荡混匀，在冰上裂解5 min后，4℃，12 000 r/min离心10 min，取上清850 μL置于新离心管中，加入200 μL三氯甲烷，剧烈震荡15 s，冰上静置2 min，于4℃，12 000 r/min离心15 min，取上清350 μL置于新离心管中，再次加入200 μL三氯甲烷，震荡混匀，冰上静置5 min后，4℃，12 000 r/min离心15 min，取上清250 μL置于新离心管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10 min(出现絮状沉淀)。4℃，12 000 r/min离心15 min，倒掉上清，加入1 mL 75%乙醇洗沉淀后，4℃，7 500 r/min离心5 min，倒掉上清。室温风干去除乙醇，然后加入100 μL DEPC处理水溶解RNA，-80℃保存。
1.3.2 RNA质量检测采用Nanodrop 2000检测RNA的纯度。Real-time qPCR参照SYBR© Premix Ex TaqTM(TaKaRa)的说明，内参基因使用太平洋牡蛎actin rRNA基因。20 μL扩增体系：SYBR© Premix Ex TaqTM 10 μL，PCR Forward Primer(10 μmol/L) 0.8 μL，PCR Reverse Primer (10 μmol/L) 0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL，cDNA模板2.0 μL，DEPC水6.0 μL。反应程序：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40个循环；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。荧光定量所用引物见表 1。
| 基因名称 Name of gene |
引物序列(5′-3′) Sequence of primer (5′-3′) |
扩增片段大小 Size of amplicon (bp) |
| Hsp70 | F:CTTGCTCCTGTTGGATGTCAC R:AAGGTCTGCGTCTGTTTGGT |
114 |
| Actin | F:CCCATCTACGAAGGTTACGC R:TCGGCTGTGGTGGTGAAA |
125 |
1.3.3 数据统计分析
根据2-ΔΔCт法计算目标基因的相对表达量[10]。数据间的显著性差异分析使用SPSS 17.0软件的one-way ANOVA方法，P < 0.05认为有显著差异。
2 结果与分析 2.1 不同盐度作用下海水中镉的浓度在镉中暴露后，盐度13 psu、20 psu、27 psu、34 psu组中太平洋牡蛎的平均死亡率分别为2.85%、7.14%、8.57%和4.28%。整个实验期间，各个处理组盐度波动成功保持在±0.3 psu范围内，水体中镉浓度接近10 μg/L，整个实验期间镉浓度未见显著性变化(图 1)。
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| 图 1 水体中镉的浓度 Fig.1 Cadmium concentration in water |
2.2 不同盐度作用下太平洋牡蛎Hsp70基因的表达
4个盐度作用下，外套膜中Hsp70基因的mRNA表达趋势大体相同。盐度13组，Hsp70基因在富集和排出阶段均被抑制(图 2a)。富集阶段，0.083~28 d，抑制作用增强，净化阶段开始后，抑制作用于前2周减弱，随后增强。盐度20 psu组，Hsp70基因于0.083 d先被诱导，随后抑制作用逐渐增强，排出阶段开始后，抑制作用于35~42 d减弱，随后增强。盐度27 psu组，Hsp70基因于0.083 d被诱导，随后诱导作用减弱，恢复至对照组水平，排出阶段开始后，抑制作用增强。盐度34 psu组，Hsp70基因于14 d被轻微诱导，21~35 d被抑制，抑制作用随着时间的延长而增强，42 d时被诱导，随后至实验结束均被抑制。按盐度由低到高，外套膜中Hsp70基因表达峰值分别为0.804±0.085，1.558±0.071，1.339±0.059，1.518±0.237。
|
| 以盐度27 psu未暴露镉组为空白对照；0时间点的样品未暴露镉；数值代表平均值±标准误(n=3);箭头代表富集阶段末期及排出阶段的开始; 不同小写字母表示差异显著(P < 0.05) The samples acclimated in salinity of 27 without Cd exposure are the reference samples.The samples at 0 d were out of Cd exposure.Vertical bars represent the mean ± S.E.(n=3).Arrows represent the end of the contamination phase and the beginning of the decontamination phase.Data with different lowercase letters indicate significant differences (P < 0.05) 图 2 不同盐度下镉对牡蛎外套膜(a)和消化腺(b)Hsp70基因表达的影响 Fig.2 Effects of Cd on Hsp70 gene expression in different tissues (a.mantle; b.digestive gland) of C.gigas under different salinities |
消化腺Hsp70基因表达大部分受到抑制，盐度20 psu组于42 d受到诱导，盐度27 psu组于28 d受到诱导，盐度34 psu组于7 d、21 d和42 d受到诱导(图 2b)。盐度13 psu组，镉对Hsp70基因的抑制作用呈波动性变化，Hsp70基因的表达于第7 d开始被抑制，于21~28 d抑制作用减弱，并恢复至对照组水平，排出阶段开始后，前2周抑制作用减弱，随后增强。盐度20 psu组，Hsp70基因于0.083~14 d，抑制作用增强，随后抑制作用呈波动性变化，排出阶段开始后，Hsp70基因先被诱导，随后被抑制。盐度27 psu组，Hsp70基因富集阶段被轻微抑制，于28 d被轻微诱导，随后被抑制。盐度34 psu组，Hsp70基因于0.083 d被抑制，于第7 d被诱导，随后除了第21 d和42 d，于其他时间点均被抑制。按盐度由低到高，内脏团中Hsp70基因表达峰值分别为0.952±0.059，1.522±0.087，1.082±0.099，1.734±0.210。
3 讨论海水及海洋生物体内重金属镉的浓度已经被多次报道过，如Wan等[11]2008年调查了锦州湾海水中溶解态重金属的时空分布，发现镉的浓度为1.65~2.01 μg/g；Gao等[12]统计了1996—2008年渤海溶解的微量元素量，发现镉的浓度为0.007~5.000 μg/L；Liang等[13]调查了渤海沿海岸线的3种生物，结果表明贻贝、大连湾牡蛎、菲律宾蛤仔体内镉的浓度分别为0.34~1.96 μg/g、0.51~3.29 μg/g、0.14~0.63 μg/g。Sun等[14]对日照海域太平洋牡蛎不同组织中镉的浓度进行了分析，发现镉在外套膜、消化腺、闭壳肌中的背景值分别为(0.75±0.07)μg/g、(1.5±0.26) μg/g和(0.45±0.06) μg/g。本研究结果表明，10 μg/L镉暴露下，Hsp70基因的表达受到了影响，大部分时间点被抑制。Taylor等[15]于2013年指出：低浓度的重金属可以诱导双壳贝类体内Hsp70基因的表达。Hsp70基因受到抑制的情况也同样存在。Boutet等[16]于2003年发现当太平洋牡蛎同时受到铜和镉的胁迫时，Hsp70的表达受到抑制。Thompson等[17]于2011年也发现，当受到Cd、Pb、Zn胁迫时，Hsp70的表达受到抑制。
热休克蛋白也称应激蛋白，是一组在结构上高度保守的多肽类蛋白质家族分子，在正常情况和应激条件下都发挥重要生理功能。Hsp70s是广泛存在于原核和真核生物细胞中的70 kDa热休克蛋白家族成员之一。Hsp70是一种诱导型表达蛋白，是细胞损伤时最早出现的保护分子，帮助变性蛋白复性和清除永久性变性蛋白，在污染物的刺激下，其表达量会显著增加。Eckwer等[18]研究发现，壁潮虫(Oniscus asellus)受到重金属胁迫后，机体中Hsp70基因的表达大致划分为3种情况：第一种情况是自我平衡阶段，此时重金属浓度较低，细胞可自我平衡，应激反应开始后，Hsp70基因表达水平变化不明显；第二种情况是补偿作用阶段，随着重金属浓度升高，细胞应激反应亦提高，Hsp70表达水平逐步提高，并最终达到最大值；第三种情况是非补偿作用阶段，重金属浓度继续升高，导致细胞蛋白质合成的病理损伤，从而导致Hsp70基因表达水平出现下降。本研究中，太平洋牡蛎外套膜和消化腺中Hsp70基因表达水平表现出类似的情况，镉暴露初期，机体遇到重金属胁迫时，Hsp70可通过防止蛋白的凝聚及变性，维持细胞内环境稳定，增强机体抗刺激及生存能力，表达被诱导；当浓度超过阈值时，机体细胞的生物合成能力遭到破坏，如转录和翻译过程，Hsp70基因的表达受到显著性抑制，呈现出补偿作用，说明热休克蛋白的表达对细胞的保护是有一定范围的，它并不会无限制地持续增加。
4 结论4个盐度作用下，用10 μg/L镉处理太平洋牡蛎，其外套膜和消化腺中Hsp70基因的表达均受到影响，对镉的响应较灵敏，且持续时间达60 d。因此，Hsp70基因可作为镉污染的早期预警分子，而外套膜和消化腺都是适宜的材料。
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