2. 广西中医药大学, 广西南宁 530200;
3. 广西中药质量标准研究重点实验室, 广西南宁 530022
2. Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning, Guangxi, 530200, China;
3. Guangxi Quality Standard of Chinese Medicine Research Laboratory, Nanning, Guangxi, 530022, China
左旋多巴(Levodopa)是治疗帕金森综合征(Parkinson's Disease，PD)的经典药物，历经100多年的研究发展依然是治疗PD的首选药物之一，主要用于帕金森病和肝昏迷，也可用于治疗心力衰竭、消化性溃疡病、溢乳症、某些脑梗死后精神症状、促进小儿生长发育、增强性功能、神经性疼痛等[1-3]病症。长期服用左旋多巴会引起一些不良反应，如剂量终止恶化、胃肠道反应、开关现象和服务器异常非自主运动(AIM)等[4-6]。生产左旋多巴的工艺主要有化学合成法、植物提取法、微生物转化法以及新兴的代谢转化法等[7-13]方法。目前，国内生产左旋多巴以从猫豆中提取为主，生产过程中存在大量的废水，处理起来极其麻烦，大大增加了成本，一旦处理不当就会对环境带来严重污染；另外，从猫豆中提取天然左旋多巴的纯化工艺复杂，成本大，且杂质含量高难以控制质量。综合分析，左旋多巴生产中亟待解决的关键问题就是其结晶母液的富集。目前，暂无左旋多巴结晶母液的萃取物活性研究的相关报道。因此，本文对左旋多巴结晶母液的萃取物进行活性研究，拟为左旋多巴生产工艺废水的处理及再利用提供参考依据，进一步有利于天然左旋多巴的质量控制，增加经济效益。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 精制母液左旋多巴结晶母液由广西邦尔药业有限公司提供，是以猫豆为原料生产左旋多巴的精制工艺过程中的生产废水。
1.1.2 试剂DMEM培养基(MULTICELL，批号: 319006015)，无菌PBS (BOSTER，批号：03C02A21)，胎牛血清(FBS, Biological Industries，批号：1729601)，胰蛋白酶-EDTA消化液(Solarbio，批号：20170306)，青链霉素混合液(Solarbio，批号：20171025)，MTT(Sigma，批号：298-93-1)；95%乙醇、石油醚(60~90℃)、乙酸乙酯、正丁醇、DMSO等试剂均为分析纯; HAT:5 mmol/L次黄嘌呤钠，20 μmol/L氨蝶呤，0.8 mmol/L胸腺嘧啶的混合物(Sigma, 批号：1212508)。
1.1.3 肿瘤细胞NG108-15肿瘤细胞购于上海细胞生物研究所细胞库，是小鼠神经细胞瘤与大鼠神经胶质细胞杂交瘤细胞。
1.1.4 实验仪器超净工作台(SW-CJ-1FD)，CO2细胞培养箱(MCO-18AIC，SAYO)，全波长酶标仪(TECAN1510，INFINITE 200 PRO德国)，高速离心机(Thermo SCIENTIFIC)，倒置显微镜(DMI3000B，Leica)，冰箱(BCD-268WBCS，Haier)，高压蒸气灭菌锅(HV-50，HIRAYAMA)；Research plus系列可调微量移液器(德国Eppendorf公司)。
1.2 方法 1.2.1 供试品萃取物的制备左旋多巴精制工序的结晶母液，用NaOH水溶液调节至pH值为6.0，减压浓缩成稠膏，60℃真空烘干，得干膏5.28 kg。然后粉碎，用10倍量95%乙醇回流提取4次，每次提取时间2 h，过滤，合并提取液，减压回收乙醇，得醇提物150.81 g。醇提物用600 mL蒸馏水混悬，先后用石油醚(60~90℃)(萃取5次)、乙酸乙酯(萃取5次)和正丁醇(萃取5次)进行萃取，回收溶剂，得到不同极性萃取物，分别为石油醚萃取物5.88 g、乙酸乙酯萃取物3.95 g、正丁醇萃取物57.82 g。3个不同极性部位萃取物即为供试品原料。
1.2.2 细胞培养参照文献[14]的做法，有修改。NG108-15的细胞培养液为10% FBS+1% HAT+ DMEM，置于37℃、5% CO2培养箱中培养，1~2 d更换1次培养液，每天观察细胞状态，保证细胞状态良好。
1.2.3 MTT法直接给药参照文献[14]的做法，有修改。取对数生长期的NG-108细胞，倒置显微镜下观察状态良好，消化混悬均匀并调整细胞浓度为3×105个/mL，接种于96孔培养板中，每孔加200 μL细胞混悬液，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养24 h。吸去培养液，分组加入药液，共分为5组：空白组、石油醚供试组、乙酸乙酯供试组、正丁醇供试组和对照组(纯度为98.8%左旋多巴配置成的不同浓度对照品溶液)。空白组设6个复孔，每孔加200 μL培养液；供试组和对照组均分别设7个不同浓度，分别为6.25 μg·mL-1、12.50 μg·mL-1、25 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1、400 μg·mL-1，每个浓度设6个复孔，每孔加200 μL供试品溶液；加药后在培养箱中继续培养48 h后离心吸去溶液，加PBS溶液，每孔200 μL，再加MTT溶液，每孔10 μL，继续培养4 h，弃上清液。每孔加200 μL二甲基亚砜，摇床轻轻振摇(转速为200 r·min-1)10 min，570 nm波长处测OD值，计算细胞抑制率(IR)和半数抑制浓度(IC50)，计算公式：IR=[1－(给药细胞OD值-板底OD值)/(空白细胞OD值-板底OD值)]×100%，lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4), 其中，Xm：lg最大剂量，I：lg(最大剂量/相邻剂量)，P：阳性反应率之和，Pm：最大阳性反应率，Pn：最小阳性反应率。
1.2.4 数据分析采用SPSS 20.0软件进行统计分析，结果以x±s表示，组间采用t检验进行比较，P＜0.05或P＜0.01表示有统计学显著性差异。
2 结果与分析如表 1所示，石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物体外对NG108-15细胞增殖均具有明显的抑制作用(P < 0.05或P < 0.01)，且随着浓度的增加抑制作用增强。给药浓度为6.25 μg·mL-1时，萃取物的抑制率均超过10%；给药浓度为200 μg·mL-1时，抑制率基本达到95%左右。3种萃取物体外对NG108-15细胞增殖的抑制作用IC50分别为37.14 μg·mL-1，44.89 μg·mL-1，49.03 μg·mL-1。通过对比IC50数值可以看出，石油醚萃取物体外对NG108-15细胞增殖的抑制作用最强，乙酸乙酯萃取物的抑制作用次之，正丁醇萃取物的抑制作用最弱。
| 组别 Group |
浓度 Concentration(μg·mL-1) |
OD值 OD value |
抑制率 Inhibition rate (%) |
IC50(μg·mL-1) |
| 空白组 Blank |
—— | 0.888±0.179 | —— | —— |
| 左旋多巴对照组 Levodopa control group |
6.25 | 0.780±0.022 | 3.2 | |
| 12.5 | 0.735±0.034 | 8.8 | ||
| 25 | 0.654±0.072** | 18.6 | ||
| 50 | 0.368±0.067** | 54.4 | ||
| 100 | 0.046±0.005** | 94.3 | ||
| 200 | 0.042±0.002** | 94.8 | ||
| 400 | 0.093±0.006** | 88.4 | 44.56 | |
| 石油醚组 Petroleum ether group |
6.25 | 0.885±0.065 | 17 | |
| 12.5 | 0.780±0.030## | 26.9 | ||
| 25 | 0.703±0.010**## | 34.0 | ||
| 50 | 0.474±0.034* | 55.6 | ||
| 100 | 0.294±0.021**## | 72.5 | ||
| 200 | 0.056±0.004** | 94.7 | ||
| 400 | 0.031±0.005**## | 97.1 | 37.14 | |
| 乙酸乙酯组 Ethl ace-tate group |
6.25 | 0.732±0.129*# | 15.3 | |
| 12.5 | 0.669±0.155** | 22.9 | ||
| 25 | 0.602±0.139** | 30.6 | ||
| 50 | 0.470±0.167** | 45.6 | ||
| 100 | 0.259±0.086**## | 70.1 | ||
| 200 | 0.015±0.002**## | 98.3 | ||
| 400 | 0.017±0.002**## | 98.0 | 44.89 | |
| 正丁醇组 N-butanol group |
6.25 | 0.717±0.020 | 12.0 | |
| 12.5 | 0.631±0.021*## | 22.6 | ||
| 25 | 0.570±0.031## | 29.9 | ||
| 50 | 0.477±0.085# | 41.3 | ||
| 100 | 0.262±0.024*## | 67.8 | ||
| 200 | 0.018±0.002**## | 97.9 | ||
| 400 | 0.015±0.010**## | 98.2 | 49.03 | |
| 注：与空白组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与左旋多巴组比较，#P < 0.05，##P < 0.01 Note:Compared with blank, *P < 0.05, **P < 0.01;compared with levodopa control group, #P < 0.05, ##P < 0.01 |
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3 讨论
本实验通过MTT法检测左旋多巴结晶母液(精制工序的废水)的石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物体外对NG108-15细胞增殖的抑制作用，提示左旋多巴结晶母液中含有某些具有抗肿瘤活性的化学成分。通过实验对比，可以发现废水不同极性萃取物随着极性的增强，其对NG108-15细胞增殖的抑制作用强度减弱，抗肿瘤活性同样具有此规律，这给今后开展深入研究提供方向。废水来自天然左旋多巴的生产过程中精制工艺，其化学成分极有可能包含天然左旋多巴的相关物质，即存在某种天然左旋多巴的相关物对NG108-15细胞增殖具有抑制作用，此信息对于天然左旋多巴的相关物研究具有重要意义。另有研究者发现，猫豆乙醇提取物不仅能有效刺激3T3-L1脂肪细胞消耗葡萄糖，改善胰岛素抵抗[15]，还能显著降低糖尿病小鼠体内的高血糖水平并同时改善伴随Ⅰ型糖尿病所导致的机体氧化应激[16]。左旋多巴结晶母液是以猫豆为原药材生产天然左旋多巴的精制工序废水，也就是说其结晶母液与猫豆提取物之间可能存在交叉，或许结晶母液中亦存在某种成分具有改善胰岛素抵抗等作用，有待进一步研究考证。
4 结论左旋多巴结晶母液的石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物体外对NG108-15细胞增殖具有明显的抑制作用，即具有一定的抗肿瘤活性，但具体的有效成分等信息仍需要进一步深入研究。
| [1] |
HAN L, XIE Y H, WU R, et al. Traditional Chinese medicine for modern treatment of Parkinson's Disease[J]. Chinese Journal of Integrative Medicine, 2017, 23(8): 635-640. |
| [2] |
MENDELSOHN A M, JOHNSON C E, BROWN C E, et al. Hemodynamic and clinical effects of oral levodopa in children with congestive heart failure[J]. Journal of the American College of Cardiology, 1997, 30(1): 237-242. |
| [3] |
陈吉成, 张翠平. 左旋多巴的临床新用途[J]. 中国社区医师:医学专业, 2012, 14(25): 18-19. |
| [4] |
CAIX X, KONG Y, ZHAO H, et al. Effects of levodopa on dopaminergic neurons and induced dyskinesia[J]. Neural Regeneration Research, 2010, 5(2): 92-97. |
| [5] |
EGGERT K, SCHRADER C, HAHN M, et al. Continuous jejunal levodopa infusion in patients with advanced parkinson disease:Practical aspects and outcome of motor and non-motor complications[J]. Clinical Neuropharmacolgy, 2008, 31(3): 151-166. |
| [6] |
左旋多巴的药理作用和不良反应[N].上海中医药报: 中医·问药, 2009-05-19(3).
|
| [7] |
罗栋源.从猫豆中提取左旋多巴的清洁生产工艺研究[D].武汉: 湖北工业大学, 2011. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10500-1011091863.htm
|
| [8] |
蒋伟哲.猫豆产业链支撑技术研究[D].南宁: 广西医科大学, 2008. http://kns.cnki.net/KCMS/detail/detail.aspx?dbcode=CDFD&filename=1011088964.nh
|
| [9] |
蒋宇, 余从田, 吴正钧. 猫豆与左旋多巴的检测及生产工艺研究进展[J]. 食品工业, 2014, 35(4): 145-149. |
| [10] |
罗栋源, 魏璇, 龚琴, 等. 膜工艺提取猫豆左旋多巴的研究[J]. 化学与生物工程, 2011, 28(1): 26-32. |
| [11] |
MISRA L, WAGNER H. Extraction of bioactive principles from Mucuna pruriens seeds[J]. Indian Journal of Biochemistry and Biology, 2007, 44(1): 56-60. |
| [12] |
汪桂芳, 李传润, 曹政, 等. 从猫豆中提取左旋多巴的膜分离工艺探索[J]. 安徽化工, 2014, 40(1): 17-20. |
| [13] |
徐晓俞, 李爱萍, 吴凌云, 等. 蚕豆花左旋多巴提取工艺优化[J]. 中国农学通报, 2014, 30(34): 56-60. |
| [14] |
吴燕春, 钟振国, 谢金鲜, 等. 绞股蓝提取物体外对NG-108细胞增殖影响的实验研究[J]. 时珍国医国药, 2013, 24(6): 1362-1363. |
| [15] |
宋家乐, 钱波, 桂中玉, 等. 猫豆乙醇提取物对3T3-L1脂肪细胞糖脂代谢的影响[J]. 现代食品科技, 2017, 33(10): 7-12. |
| [16] |
宋家乐, 李佳星, 黄泖禹, 等. 猫豆乙醇提取物对糖尿病小鼠血糖和抗氧化能力的影响[J]. 食品科技, 2017, 42(5): 213-218. |