0 引言

广西产中华芦荟(Aloe vera L.var.chinensis)^[1]属于单子叶植物百合科(Liliaceae)芦荟属多年生常绿肉质植物，又称油葱。芦荟属植物具有杀菌、抑制或延缓人体衰老等作用，使用价值高，广泛应用于医药、化妆品、保健食品等方面。目前对芦荟的研究主要集中在芦荟的抑菌作用、药理作用和活性成分方面^[1-12]，未见有广西产中华芦荟指纹图谱研究的公开报道。而指纹图谱在中药材应用，笔者曾有一定的研究^[13-14]，因此本文以广西产中华芦荟为研究对象，采用HPLC指纹图谱分析法进行研究，为今后中华芦荟的质量标准研究提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 材料

仪器：高效液相色谱仪(Alliance e2695，美国沃特世)；色谱柱(Phenomenon C₁₈，5 μm，4.6 mm×250 mm)；超声波清洗器(昆山市超声仪有限公司)；Millipore Simplicity-185超纯水仪(美国密里博公司)。

试剂：乙腈，冰乙酸(色谱纯)，水(超纯水)，其余试剂均为分析纯。芦荟大黄素(批号：110795—201007，供含量测定用，中国食品药品检定研究院)。

样品：本实验所用中华芦荟药材为10批，经广西一心药业马利飞副主任药师鉴定，均为百合科芦荟属中华芦荟Aloe vera L.var.chinesis的叶，样品药材来源见表 1。样品于60℃以下烘干，粉碎成粗粉备用。

1.2 方法 1.2.1 色谱柱的选择

为得到分离效能更好的图谱，本实验分别考察Thermo C₁₈(5 μm，250 mm×4.6 mm)色谱柱，Agilent WondaSil C₁₈-WR (5 μm，250 mm×4.6 mm)色谱柱和Phenomenon C₁₈(5 μm，250 mm×4.6 mm)色谱柱。结果如图 1~3所示，Phenomenon C₁₈(5 μm，250 mm×4.6 mm)色谱柱分离出来的色谱峰比较丰富，且分离效果比较好。

1.2.2 流动相的选择

分别以甲醇-水、甲醇-0.1%冰醋酸、乙腈-水和乙腈-0.1%冰醋酸为流动相，对中华芦荟叶进行HPLC图谱考察，分析不同流动相系统的分离图谱。结果显示，以甲醇-水、甲醇-0.1%冰醋酸为流动相所得的色谱信息较少，甲醇-水流动相色谱图整体峰形不均匀，甲醇-0.1%冰醋酸流动相色谱图几乎无峰，未能分离开有关物质。而乙腈-水流动相与乙腈-0.1%冰醋酸流动相的色谱图各有特点，但乙腈-0.1%冰醋酸流动相提供的峰相对集中。因此，确定流动相系统为乙腈-0.1%冰醋酸(图 4~7)。

1.2.3 洗脱程序

采用乙腈-0.1%冰醋酸流动相，按不同时间和比例进行梯度洗脱。梯度洗脱流动相组成如表 2所示。

1.2.4 检测波长的选择

本实验使用二极管阵列检测器(DAD)，对样品进行190~400 nm全波长扫描，获得3D图(图 8)，并重点考查250 nm、260 nm、280 nm、300 nm、310 nm波长处色谱图。结果显示色谱峰波长为260 nm和280 nm，其分离度和对照品(56 min的峰)出峰相对较好，但280 nm对照品的峰相对高点，最终确定280 nm为本指纹图谱实验的检查波长(图 9)。

1.2.5 柱温和流速的选择

柱温25℃与柱温30℃条件下的色谱图总体相差不大，但25℃条件下的色谱图峰形整体好于30℃条件下的色谱图，且基于对色谱柱和仪器的保护，所以选择25℃为检测温度。另外，在其他色谱条件相同情况下，1.0 mL/min流速的色谱图较0.8 mL/min流速的分离效果差，因此选用0.8 mL/min流速。

1.2.6 指纹图谱条件的确定

根据上述考察，确定指纹图谱条件：色谱柱为Phenomenon C₁₈(5 μm，250 mm×4.6 mm)，流动相系统如表 2所示，检测波长为280 nm，柱温25℃，进样量20 μL，流速0.8 mL/min，理论塔板数大于5 000，分离度大于1.5。

1.3 供试品分析 1.3.1 供试品溶液的制备

取中华芦荟药材粉末约2 g，精密称定，置50 mL锤形瓶中，加入30 mL乙酸乙酯溶液，摇匀，于超声波清洗器中超声提取45 min，冷却，过滤，置于水浴(98~100℃)挥干溶剂，加5 mL甲醇溶解，过0.22 μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

1.3.2 对照品溶液的配制

精密称定中华芦荟对照品5 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，摇匀。

1.3.3 精密度试验

按1.3.1节供试品溶液制备方法配制供试品溶液，按1.2.6节的色谱条件下连续进样6针，记录色谱图。计算样品保留时间和峰面积的精密度。计算结果相对标准偏差(RSD)符合要求(RSD =0.111%~0.827%，n=8)。

1.3.4 重复性试验

取同一产地中华芦荟样品粉末6份，各约2 g，精密称定，按1.3.1节方法制备供试品溶液，并按1.2.6节的色谱条件测定，结果保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)值均符合要求(RSD为0.122%~0.881%，n=8)。

1.3.5 稳定性试验

取中华芦荟1份，约5 g，按1.3.1节下供试品溶液制配方法制配，并按1.2.6节的色谱条件测定，记录图谱。分别在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h检测图谱，考察样品的稳定性。结果，各色谱峰的相对保留时间RSD为0.023%~0.51%，相对峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.84%~4.6%，说明稳定性符合要求。

1.3.6 空白试验

按1.2.6节的色谱条件测定，以提取溶液为供试品，记录图谱。结果表明提取溶剂及流动相中没有杂质干扰(图 10)。

1.3.7 参照色谱峰的建立

依照中国药典和指纹图谱研究的有关规定，制定指纹图谱必须设立参照物。主要根据供试品中所含化学成分的性质，选择合适的对照品作为参照物。按1.2.6节的色谱条件取对照品溶液和供试品溶液分别进样，结果如图 11~12所示，其中S为参照色谱峰，表明4号峰为芦荟大黄素。

1.4 各批广西产中华芦荟的指纹图谱的采集

取10批芦荟按1.3.1节供试品溶液制备方法配制供试品溶液，按1.2.6节的色谱条件测定，分别记录各色谱图。采用中国药典颁布的指纹图谱相似度评价(2012.1版本)软件对中华芦荟10批不同产地进行匹配(以平均数，设定时间宽度为0.1 min，系统自动匹配)，以1号药材样品作为参照图谱，4号峰作为参照色谱峰，进行共有指纹峰的标定。

2 结果与分析

根据采集得到的10批中华芦荟叠加色谱图(图 13)，以1号样品为参照图谱，采用国家药典颁布的指纹图谱相似度评价(2012.1版本)软件，对中华芦荟10批不同产地进行自动匹配，建立中华芦荟药材共有模式的对照指纹色谱图(图 14), 10批药材与对照品指纹图谱相似度经数理统计，平均值达0.9以上，与对照图谱有良好的相似性。匹配结果共标定数目8个共有指纹峰(图 13~14)。10批中华芦荟的相对保留时间RSD为0.246%~0.471%；相对峰面积RSD为16.84%~47.36%。指纹图谱非共有峰面积

占比4.03%~8.84%；共有峰的面积占比为91.16%~95.97 %，说明实验方法重现性较好。

3 结论

本实验以实验所得的条件(色谱柱为Phenomenon C₁₈(5 μm，250 mm×4.6 mm)，表3的流动相，检测波长为280 nm，柱温为25℃，进样量20 μL，流速0.8 mL/min，理论塔板数大于5 000，分离度大于1.5)为指纹图谱色谱条件。采用《中国药典》颁布的指纹图谱相似度评价(2012.1版本)软件对中华芦荟10批不同产地进行匹配，以1号药材样品作为参照图谱，4号峰作为参照色谱峰，建立中华芦荟药材HPLC指纹图谱，其相似度较好，各批药材指纹图谱间的相似度平均在0.9以上。HPLC指纹图谱标定8个共有峰。本法HPLC指纹图谱的建立，可为今后广西产中华芦荟的质量标准制定提供参考。但本研究的芦荟仅仅是广西产的，如要建立中华芦荟指纹图谱的质量标准，尚需采集全国各产地的中华芦荟并进行研究，这为进一步的研究提够参考。