引用本文
覃仙玲, 陈宪云, 刘明珠, 余庆, 牙韩争, 朱冬琳, 王一兵, 陈波, 李鹏飞. 基于18S rDNA序列鉴定北部湾养殖区引发藻华的一株原甲藻[J]. 广西科学院学报, 2019, 35(3): 225-231.    DOI: 10.13657/j.cnki.gxkxyxb.20190903.006
QIN Xianling, CHEN Xianyun, LIU Mingzhu, YU Qing, YA Hanzheng, ZHU Donglin, WANG Yibing, CHEN Bo, LI Pengfei. Identification of a Prorocentrum Species from an Aquaculture Area in Beibu Gulf of Guangxi during a Harmful Algal Bloom: Base on 18S rDNA Sequence[J]. Journal of Guangxi Academy of Sciences, 2019, 35(3): 225-231.    DOI: 10.13657/j.cnki.gxkxyxb.20190903.006
基于18S rDNA序列鉴定北部湾养殖区引发藻华的一株原甲藻
覃仙玲1, 陈宪云1, 刘明珠2, 余庆1, 牙韩争1, 朱冬琳1, 王一兵3, 陈波1, 李鹏飞1,2     
1. 广西科学院, 广西近海海洋环境科学重点实验室, 广西南宁 530007;
2. 广西壮族自治区海洋研究所, 广西海洋生物技术重点实验室, 广西北海 536000;
3. 广西民族大学海洋与生物技术学院, 广西南宁 530006
*广西重点研发计划项目（2018AB52003，AB16380282），广西自然科学基金项目（2018GXNSFBA281011），广西科技人才专项（2018AD19367）和广西科学院基本科研业务费项目（2018YJJ903，2018YJJ902）资助
作者简介: 覃仙玲(1989-), 女, 硕士, 助理研究员, 主要从事藻类生理生态学研究.
通信作者: 陈波(1954-), 男, 研究员, 主要从事海洋动力学研究, E-mail:cbgxkxy@163.com;
李鹏飞(1988-), 男, 博士, 副研究员, 硕士生导师, 主要从事水产重大疫病防控与生态养殖技术的研究, E-mail:pfli2014@126.com.
摘要: 高度保守的核糖体18S rDNA序列可用于经济快捷且精确地鉴定浮游植物的种类。2018年夏季，广西北部湾近海的对虾养殖区内发生了原甲藻引起的藻华，藻华的优势种密度为5.5×105 cells·L-1，本文采用形态学观察法结合序列分析鉴定的方法来鉴定该藻的种类。结果表明，在形态上，这株分离培养获得的原甲藻（编号BBGA-9003），其大部分细胞类似心形或卵形，少部分细胞近似三角形，鞭毛2条，细胞长和宽分别为（16.55±1.42）μm和（13.84±1.86）μm。该原甲藻经18S rDNA基因序列测定并进行BLAST分析，结果表明该原甲藻序列和GenBank中56株不同种原甲藻具有很高的同源性，在系统进化树上与不同来源的微小原甲藻聚在一大分支上，且与各微小原甲藻间的遗传距离均小于与其他种间的遗传距离。因此，从分子生物学的角度鉴定该株原甲藻属于微小原甲藻，此种藻华的发生意味着北部湾养殖区有害藻华种类多样性的增加。本研究为18S rDNA序列测定用于海洋浮游植物种类鉴定提供了实验依据，也为广西北部湾养殖区有害藻华的防治提供基础资料。
关键词: 北部湾    养殖区    微小原甲藻    18S rDNA    分子鉴定    
Identification of a Prorocentrum Species from an Aquaculture Area in Beibu Gulf of Guangxi during a Harmful Algal Bloom: Base on 18S rDNA Sequence
QIN Xianling1, CHEN Xianyun1, LIU Mingzhu2, YU Qing1, YA Hanzheng1, ZHU Donglin1, WANG Yibing3, CHEN Bo1, LI Pengfei1,2     
1. Guangxi Key Laboratory of Marine Environmental Science, Guangxi Academy of Sciences, Nanning, Guangxi, 530007, China;
2. Guangxi Key Laboratory for Marine Biotechnology, Guangxi Institute of Oceanography, Beihai, Guangxi, 536000, China;
3. School of Marine Sciences and Biotechnology, Guangxi University for Nationalities, Nanning, Guangxi, 530006, China
Abstract: The highly conserved ribosomal 18S rDNA sequence can be used to identify phytoplankton species quickly, economically and accurately.In the summer of 2018, the algal bloom caused by Prorocentrum (Pyrrophyta) happened in a prawn cultivation area in the Beibu Gulf of Guangxi, and the dominant species density of algal bloom was 5.5×105 cells·L-1.To identify the species of this alga, morphological observation and sequence analysis and identification method were used.The ribosome 18S rDNA sequences of this Prorocentrum were cloned and then sequenced for further identification.The results showed that, in the morphological aspect, most of Prorocentrum (No.BBGA-9003) cells obtained by the isolation and culture resembled a heart shape or an ovate shape, and a small number of cells were approximately triangular, with two flagella, and the cell length and width were respectively (16.55±1.42) μm and (13.84±1.86) μm.This Prorocentrum was sequenced by 18S rDNA gene and analyzed by BLAST, the result showed the Prorocentrum series had high homology with 56 strains of different Prorocentrum species in GenBank, and clustered on a large branch of the phylogenetic tree with different sources of P.minimum.The genetic distance from each Prorocentrum minimum was smaller than the genetic distance between other species.Therefore, from the perspective of molecular biology, the species belonged to P.minimum, and the occurrence of such algal blooms meant an increase in the diversity of harmful algal blooms in the Beibu Gulf aquaculture area.This study provides an experimental basis for the identification of marine phytoplankton species by 18S rDNA sequencing, and also provides basic data for the prevention and control of harmful algal blooms in aquaculture areas in Beibu Gulf.
Key words: Beibu Gulf    aquaculture area    Prorocentrum minimum    18S rDNA    molecular identification    
0 引言

广西是我国重要的海水养殖省份之一，其长达1 600 km的海岸线及优质的水环境为广西沿海水产增养殖业的发展奠定了坚实的基础[1-3]。“十二五”期间，广西北部湾海域的海水养殖业迅猛发展，海水养殖面积达到550 km2[1, 4]。然而自2008年以来，广西北部湾经济区上升为国家战略，随着周边社会经济的发展，以及城市化、工业化进程加快，给优越的广西海域生态环境带来了前所未有的巨大压力[5]。在工业污染及人类活动的影响下，广西近岸海域富营养化趋势明显，有害藻华频繁暴发，发生的次数、规模、持续时间和有害藻种类均呈现明显上升趋势，对广西海水养殖业造成巨大的破坏，严重影响着广西海水养殖业的健康可持续发展[6]。例如，2014年和2015年冬季，广西近岸海域的棕囊藻赤潮暴发，影响区覆盖了防城港附近海域、钦州湾和北海附近海域，严重破坏了海洋生态环境[7]。

形成有害藻华的微藻种类多种多样，它们对海洋生物产生危害的途径大致有几种，主要包括改变水体理化环境导致水体恶化，或分泌黏液附着在海水动物的鳃组织造成严重损伤、造成水体缺氧等。部分有害藻华会产生毒素，这些毒素不仅导致海产品的污染及死亡，还可能通过食物链危及人类健康[7-8]。相对于珠江口及长江口等海域，广西近海的赤潮发生次数较少，其规模与危害也较小，然而广西北部湾海域有害藻华的研究工作却相对滞后，尤其是关于广西海水养殖区域的有害藻华种类及其危害，尚缺乏系统的研究。由于不同的藻类引起的藻华危害养殖生物的途径有差异，故对养殖区有害藻华的种类进行准确地分类学鉴定是藻华防控的基础工作。传统的海洋微藻鉴定工作主要借助显微镜观察，不仅繁琐耗时，还需要较高的专业水平。近年来，随着分子生物学的发展，分子生物学技术成为物种鉴定的经济快捷精确的手段。尤其是18S rDNA和ITS基因已被广泛应用于分子系统学研究，解决了许多疑难海洋藻类的分类鉴定问题[9]。

为了对北部湾养殖区有害藻华的种类进行精准鉴定。本研究在北部湾对虾养殖区的藻华水样中分离得到一株原甲藻并进行单克隆培养，采用传统的显微镜观察法结合18S rDNA序列分析对其进行种类鉴定，拟为了解该原甲藻的分类学地位及其与其他种或株系间的亲缘关系，并为今后北部湾海水养殖区域有害藻华的监控和防治提供基础资料。

1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器

试剂：鲁格氏碘液，福尔马林溶液，乙醇，丙酮，植物DNA提取试剂盒(康为)，琼脂糖，TEB缓冲溶液。

仪器：倒置显微镜(型号：Ts2, Nikon)，扫描电子显微镜(型号：S-3400 N，Hitachi)，离心机(型号：3-18KS，Sigma)，PCR仪(型号：BOEN-25697B，上海伯恩)，电泳仪(型号：170-3940，Bio-Rad)。

1.2 采样和藻种分离培养

2018年5月在广西钦州的北部湾对虾养殖区采集藻华水样，其中一瓶加入鲁格试剂固定，用于藻密度计数以及形态观察。另一瓶不加固定剂，用于分离藻种：在倒置显微镜下，用毛细管分离法从水样中挑选活力较好的细胞于96孔板中进行单克隆培养。待细胞分裂到一定数量后，转移到具塞玻璃管中，用f/2培养基在22 ℃、光暗比为12 h:12 h的条件下培养。分离获得的藻种保存于广西科学院，编号为BBGA-9003。

1.3 藻体形态观察 1.3.1 光学显微镜观察

吸取适量用鲁格试剂固定的水样滴于载玻片上，在倒置显微镜下观察藻体形态并拍照。

1.3.2 扫描电子显微镜观察

取20 mL处于指数生长期的藻液，用体积分数为1%的鲁格氏碘液和体积分数为4%的福尔马林固定1 h，用10 μm筛绢过滤浓缩，用超纯水洗涤3~4次，再依次用体积分数分别为15%、30%、50%、70%、80%、90%及100%的乙醇梯度脱水，每个浓度脱水10 min，最后1个梯度重复脱水2次，最后以体积分数100%丙酮置换30 min。在扫描电子显微镜下观察并拍照。

1.4 基因组DNA的提取及18S rDNA的克隆

取约50 mL新鲜藻体于4 ℃、5 000 r/min下离心5 min，弃上清，收集藻体用于提取DNA。总DNA提取按照植物DNA提取试剂盒(康为)的使用说明进行，以提取的总DNA为模板进行PCR克隆核糖体18S rDNA片段。PCR引物为18S-F:5′-GCTTGTCTCAAAGATTAAGCCATGC-3′和18S-R:5′- CACCTACGGAAACCTTGTTACGAC-3′，由华大基因公司合成。PCR条件：94 ℃预变性3 min；然后94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min。

1.5 PCR产物电泳分析

采用琼脂糖凝胶电泳法对PCR产物进行检测，缓冲液为TBE。PCR产物切胶回收并交由华大基因公司测序。

1.6 数据分析

使用NCBI对18S rDNA基因序列进行比对。在MEGA7软件中运用邻接法(Neighbor-Joining method)构建分子系统树并计算各序列间的遗传距离。

2 结果与分析 2.1 藻密度、藻体形态特征及种类鉴定

计数结果表明，广西北部湾对虾养殖区藻华水样中藻密度为5.5×105 cells·L-1，是水样中的唯一优势种。

分离水样获得编号为BBGA-9003的藻种，显微观察发现，该藻细胞形态多变，大多细胞类似心形或卵形，少数近似三角形，细胞顶端较宽，后部较窄，长和宽分别为(16.55±1.42) μm和(13.84±1.86) μm，顶端有2条鞭毛(图 1a)。在相差显微镜下，可以看到该藻壳面上分布有稀疏的刺丝胞孔，细胞前端中央的鞭毛孔周围呈“V”字形，具有约1 μm长的顶刺(图 1b)。以上特征与原甲藻属(Prorocentrum)形态特征符合，故可初步判断BBGA-9003为原甲藻属。

(a)明视野观察; (b)相差显微镜观察 (a)Observed by bright-field microscope; (b)Observed by phase-contrast microscopy 图 1 BBGA-9003在显微镜下的结构 Fig.1 BBGA-9003 structure under the microscope
图选项

电镜观察发现细胞正面观也呈心形或卵形(图 2a)，腹面观为凸透镜或椭圆形(图 2b)。藻体由左右两壳板组成，壳面覆盖许多小刺，刺丝胞孔稀疏，细胞表面呈现微小原甲藻典型的规则花纹，因此可以确认该藻为微小原甲藻(Prorocentrum minimum)。

(a)正面观Anterior view; (b)腹面观Side view 图 2 BBGA-9003藻种的扫描电镜结果(图中白色箭头所指处为刺丝胞孔) Fig.2 Scanning electron microscopy results of BBGA-9003 algae species (The white arrows shows the position of thorn holes)
图选项

2.2 18S rDNA序列的克隆与测序

琼脂糖凝胶电泳显示，PCR产物大小约1 800 bp。经测定，BBGA-9003藻株18S rDNA部分序列的长度为1 220 bp。

2.3 序列比对

将BBGA-9003藻株18S rDNA序列在NCBI中进行BLAST同源性分析，结果显示该序列与GenBank中56条原甲藻属的序列具有很高的同源性(96%~100%)，这些序列来源包括微小原甲藻(P.minimum)、心形原甲藻(P.cordatum)、东海原甲藻(P.donghaiense)、具齿原甲藻(P.dentatum)、P.shikokuense、海洋原甲藻(P.micans)。纤细原甲藻(P.gracile)、三角棘原甲藻(P.triestinum)、墨西哥原甲藻(P.mexicanum)、慢原甲藻(P.rhathymum)和P.koreanum等。

采用邻接法，将从GenBank下载同源性靠前的16条序列(表 1)与本研究的序列一起构建系统发育树，结果见图 3。结果表明，BBGA-9003和来自不同海域的9个不同株系的微小原甲藻以及2株心形原甲藻聚在同一大分支上，但是又进化为独立的一小分支。而原甲藻属的其他种，包括东海原甲藻(DQ336054.1)、P.shikokuense(AB781324.1)和具齿原甲藻(AY803742.1)则在另一大分支上。

图 3 用邻接法基于原甲藻属基因序列构建的系统发育树 Fig.3 Phylogenetic tree based on DNA sequences of Prorocentrum species using adjacency method
图选项

表 1 基因库中下载的高同源性序列 Table 1 The highly homologous sequences downloaded from GenBank
种名
Species		 株系
Strains		 来源地
Origins		 GenBank登录号
Accesstion No.		 覆盖率
Query cover (%)		 相似度
Ident (%)
P.cordatum D5 Chesapeake Bay, USA MH976700.1 100 99.39
P.cordatum PmK The Adriatic Sea, Italy MH976699.1 100 99.39
P.minimum D-127 Tongyeong, Korea JX402086.1 100 99.39
P.minimum CCMP 1392 Long Island Sound, USA DQ336060.1 100 99.39
P.minimum — — AY803740.1 100 99.39
P.minimum PmiPrMu21 Geoje, Korea AY421791.1 100 99.39
P.minimum PMDH01 The East China sea DQ028763.1 100 99.39
P.minimum — — AJ415520.1 100 99.39
P.minimum PmS1 Mediterranean Sea, Sète Y16238.1 100 99.39
P.shikokuense — — AB781324.1 100 98.90
P.donghaiense — The East China sea DQ336054.1 100 98.90
P.dentatum CCMP 1517 — AY803742.1 100 98.90
P.minimum CCMP696 Long Island Sound, USA FJ587221.1 98 99.38
P.cordatum BAL The Baltic Sea MH976698.1 100 98.78
P.donghaiense - - AJ841810.1 100 98.78
P.donghaiense MABT-1 The East China sea KF032443.1 100 98.66
表选项

采用MEGA 7软件建立这17条序列间的遗传距离矩阵结果见表 2。结果表明，BBGA-9003与下载的所有9条微小原甲藻的序列亲缘关系最近，遗传距离均为0.002 8，这些微小原甲藻分别来自韩国统营湾(JX402086.1)及巨济海域(AY421791.1)、美国长岛湾(DQ336060.1和FJ587221.1)、中国东海株(DQ028763.1)以及地中海塞特港(Y16238.1)等海域，意味着北部湾BBDA-9003株极大可能属于微小原甲藻。此外，该藻与美国切萨皮克湾(MH976700.1)和意大利亚得里亚海(MH976699.1)的2株心形原甲藻遗传距离也为0.002 8，而与其他原甲藻属，如东海原甲藻、具齿原甲藻以及来自波罗的海的心形原甲藻(MH976698.1)的遗传距离较大。系统发育树上微小原甲藻以及东海原甲藻种内遗传距离均小于它们与其他种间的遗传距离，说明利用18S rDNA的序列分析也可确定BBGA-9003为微小原甲藻。

表 2 原甲藻属不同种和株系间的遗传距离矩阵 Table 2 Genetic distance matrix among different species and strains of Prorocentrum
No. 种名
Species		 登录号
Registration No.		 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
1 P.cordatum MH976700.1
2 P.cordatum MH976699.1 0.000 0
3 P.dentatum AY803742.1 0.005 6 0.005 6
4 P.donghaiense KF032443.1 0.007 0 0.007 0 0.001 4
5 P.donghaiense AJ841810.1 0.007 0 0.007 0 0.001 4 0.002 8
6 P.donghaiense DQ336054.1 0.005 6 0.005 6 0.000 0 0.001 4 0.001 4
7 P.minimum AJ415520.1 0.000 0 0.000 0 0.005 6 0.007 0 0.007 0 0.005 6
8 P.minimum Y16238.1 0.000 0 0.000 0 0.005 6 0.007 0 0.007 0 0.005 6 0.000 0
9 P.minimum AY803740.1 0.000 0 0.000 0 0.005 6 0.007 0 0.007 0 0.005 6 0.000 0 0.000 0
10 P.minimum AY421791.1 0.000 0 0.000 0 0.005 6 0.007 0 0.007 0 0.005 6 0.000 0 0.000 0 0.000 0
11 P.minimum FJ587221.1 0.000 0 0.000 0 0.005 6 0.007 0 0.007 0 0.005 6 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0
12 P.minimum DQ336060.1 0.000 0 0.000 0 0.005 6 0.007 0 0.007 0 0.005 6 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0
13 P.minimum JX402086.1 0.000 0 0.000 0 0.005 6 0.007 0 0.007 0 0.005 6 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0
14 P.minimum DQ028763.1 0.000 0 0.000 0 0.005 6 0.007 0 0.007 0 0.005 6 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0 0.000 0
15 P.shikokuense AB781324.1 0.005 6 0.005 6 0.000 0 0.001 4 0.001 4 0.000 0 0.005 6 0.005 6 0.005 6 0.005 6 0.005 6 0.005 6 0.005 6 0.005 6
16 BBGA-9003 — 0.002 8 0.002 8 0.008 4 0.009 8 0.009 8 0.008 4 0.002 8 0.002 8 0.002 8 0.002 8 0.002 8 0.002 8 0.002 8 0.002 8 0.008 4
17 P.cordatum MH976698.1 0.007 0 0.007 0 0.001 4 0.002 8 0.000 0 0.001 4 0.007 0 0.007 0 0.007 0 0.007 0 0.007 0 0.007 0 0.007 0 0.007 0 0.001 4 0.009 8
表选项

综上，形态学观察及18S rDNA序列分析结果均表明，广西钦州北部湾对虾养殖区藻华水样中分离获得的藻种BBGA-9003为微小原甲藻。

3 讨论

原甲藻属种类繁多且广泛分布于全球各海域，是有害藻华发生频率较高的藻类之一。目前，在我国能引起藻华的原甲藻主要有东海原甲藻、海洋原甲藻、微小原甲藻、尖叶原甲藻、利玛原甲藻以及反曲原甲藻等[10-11]。其中，东海原甲藻自2000年开始，常年在长江口及临近海域暴发大规模的藻华，成为我国近海有害藻华的第一优势种[12]。由于形态及生理上的相似，原甲藻与卵甲藻属(Exuviaella)被合并到一个属[13]。后来随着分子生物学的发展，人们发现了两者之间的区别，才再次恢复卵甲藻属的地位[14]。然而，由于原甲藻具有形态多变的特点，其种类鉴定存在较大的困难。近年来，分子生物学技术被成功应用于物种的精确便捷鉴定。例如，我国大亚湾的慢原甲藻曾被认为是墨西哥原甲藻，最终通过18S rDNA序列分析鉴定才被确定为慢原甲藻[15]；而海洋原甲藻与纤细原甲藻之间也极易混淆，龙超等[11]通过18S rDNA序列分析克服了北部湾海洋原甲藻种类鉴定中的困难。此外，微小原甲藻也曾被认为是微型卵甲藻(E.minima)、三角原甲藻(P.triangulatum)、E.mariaelebouriae、P.cordiformis及P.mariae-lebouriae的同种异名[16]。

对有害藻华的原因种进行准确的分类鉴定是开展相关防治工作的基础。随着分子生物学的发展，获取藻类的基因片段，利用NCBI的BLAST分析功能可以从遗传的角度去寻找物种的进化发生史，已成为越来越普遍的手段[17]。本研究中，虽然光学显微镜下观测到的BBGA-9003藻种的形态学特征符合原甲藻属的典型外观描述，但是仍不能准确鉴定其种类，需要电子显微镜观察才能确定其种类。然而使用电子显微镜鉴定海洋海洋微藻种类时，其样品处理不仅繁琐耗时，还需要较高的专业水平。通过分子手段分析，系统发育树和遗传距离矩阵均证实了BBGA-9003与微小原甲藻和心形原甲藻具有最近的亲缘关系，且这些株系来自世界各海域。1999年以前，微小原甲藻和心形原甲藻作为2种不同的种类存在，它们之间的唯一区别是心形原甲藻没有顶刺。直到在电子显微镜下发现了心形原甲藻顶刺的存在，两者才被证实是同种异名[18]。综上所述，18S rDNA能准确快速鉴定BBGA-9003藻种属于微小原甲藻。

微小原甲藻是一种能够产生腹泻性贝毒的藻类[19]，该藻藻华的发生对水产养殖业具有巨大的威胁。微小原甲藻曾在我国渤海湾和胶州湾引发赤潮，导致鱼虾和贝类的大量死亡，造成严重经济损失[10]。海水养殖是广西北部湾经济的重要支撑，其健康可持续发展对于对广西经济社会发展起着极其重要的作用，因此加强养殖区有害藻华的监测刻不容缓，而有害藻华原因种的鉴定是其监测与防治工作的基础和关键。目前有记录的、在广西北部湾海域曾引起藻华的种类主要有微囊藻、夜光藻、中肋骨条藻、束毛藻以及球形棕囊藻[5]。2018年5月在广西钦州的北部湾对虾养殖区的微小原甲藻藻华为首次记录。微小原甲藻藻华的出现意味着北部湾藻华种类多样性的增加。未来研究中，我们将利用鱼类细胞系和斑马鱼模式生物，分别在细胞和组织水平继续深入研究微小原甲藻对鱼类细胞的毒性作用和致毒致死机制，以期为微小原甲藻的高效防控技术提供数据支持、奠定理论基础[20-24]。

4 结论

本研究首先通过光学显微镜及电子显微镜，初步确定引起北部湾养殖区养殖区藻华的原因种为微小原甲藻，接着通过18S rDNA序列分析进一步确认该种为微小原甲藻。本研究不仅进一步证实了18S rDNA序列分析方法在海洋微藻种类鉴定中的可靠性，而且为广西北部湾养殖区有害藻华的赤潮预警与防治提供基础性数据。

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