鱼类免疫因子Prx 1和Prx 2的研究进展
郑琦, 邹子鸿, 蔡佳, 简纪常     
广东海洋大学水产学院, 广东湛江 524088
摘要: Peroxiredoxin 1(Prx 1)和Peroxiredoxin 2(Prx 2)是脊椎动物中一种保守的免疫因子,在鱼类的非特异性免疫中扮演重要角色,也叫作自然杀伤增强因子(Natural killer enhancing factor,NKEF A/B)。两类蛋白的N端和C端各含有一个活性半胱氨酸位点。Prx 1和Prx 2能清除机体活性氧(ROS)如H2O2,同时还参与鱼体的抗病免疫。本文对鱼类Prx 1和Prx 2的结构、抗氧化机制、生物学功能进行综述性介绍。
关键词: 鱼类    免疫因子    Prx 1    Prx 2    抗氧化蛋白    结构    功能    
Advance in Peroxiredoxin 1 and Peroxiredoxin 2 of Teleost Immune Factors
ZHENG Qi, ZOU Zihong, CAI Jia, JIAN Jichang     
College of Fishery, Guangdong Ocean University, Zhanjiang, Guangdong, 524088, China
Abstract: Peroxiredoxin 1 (Prx 1) and Peroxiredoxin 2 (Prx 2) are conserved immune factors in vertebrates and play an important role in teleost innate immunity, which are also known as Natural Killer Enhancing Factor (NKEF A/B).Both types of proteins contain an active cysteine site at the N-terminus and C-terminus, respectively.Prx 1 and Prx 2 can eliminate reactive oxygen species (ROS) such as H2O2 and also participate in anti-pathogeny immune responses.In this paper, the structure, antioxidant mechanism and biological function of fish Prx 1 and Prx 2 were reviewed.
Key words: fish    teleost    peroxiredoxin 1    peroxiredoxin 2    immunity    structure    function    
0 引言

近年来,我国水产养殖业发展迅猛,水产养殖产量持续、稳步增长。但是随着水产养殖规模扩大、养殖集约化程度提高,水产养殖中疫病频发,而传统的疾病防治手段会带来养殖环境恶化、致病菌耐药性产生等副作用,严重制约了我国水产养殖业的健康可持续发展。因此开展水生动物免疫学的研究将有助于了解水生动物的抗逆与抗病机制,为制定绿色、环保、高效的疫病防治策略提供理论依据。

Peroxiredoxin (Prxs)家族是一类广泛存在于真核生物中的抗氧化蛋白,最初在酵母中发现。在多种生理或病理过程中细胞会产生多种活性氧基团(Reactive oxygen species, ROS), 如H2O2,羟基自由基以及超氧阴离子等[1-2]。ROS的过量堆积会引起细胞甚至机体的死亡,并且H2O2还参与许多细胞表面受体的活化,以及作为胞内信使调节胞外信号在细胞内的传递[3]。Prxs主要的生物学功能就是清除细胞中多余的ROS[4]。此外,Prxs还参与了炎症调控与肿瘤发生等多种生理与病理的过程[5]。目前已发现6种过氧化物还原蛋白,分别是Prx 1~Prx 6[2]。根据结构以及作用机理Prxs可分为3个亚族,所有成员在N端均含有一个半胱氨酸残基,根据其在C端是否含有另一个半胱氨酸残基以及结构特征,分为典型2-Cys(Prx 1~Prx 4),非典型2-Cys(Prx 6),以及1-Cys(Prx 5)[6]。典型2-Cys Prxs在自身肽链的C端含有第二个Cys残基,但是如果要组成可以行使功能的二聚体,则需要其中一个亚基与另一个亚基的还原态半胱氨酸残基与之结合[6-7]

在真核生物中存在最广泛的是典型2-Cys组,其中研究较多的为Peroxiredoxin 1 (Prx 1)和Peroxiredoxin 2 (Prx 2)。本文通过对鱼类的Prx 1和Prx 2的功能研究进行综述,为深入了解该类蛋白在鱼类抗病免疫中的作用与机理提供参考。

1 Prx 1和Prx 2的结构特征

在还原状态下,典型的2-Cys组是二聚体组成的五聚体(十聚体),在氧化状态下为二聚体。尽管β链以头对尾排列的相互作用形成广泛的β折叠使单体与单体结合成的二聚体结构相对稳定,但十聚体结构的稳定却是依赖于二聚体与二聚体面对穿过的α-螺旋基序(主要是α2和α3)[8]。在催化反应过程中,蛋白发生构象变化,将十聚体的每个二聚体功能单元进行完全折叠,活性位点转化为局部展开的构象,以接近过氧化物和游离的半胱氨酸残基,分子间距离变远,其在完全折叠状态下为距离为14 Å,并形成二硫键[8]。而这种变化使二聚体分子能够稳定下来,并行使相关生物学功能[9]。然而,这种二聚体和十聚体之间的转变受到诸如浓度、离子强度、pH值、温度以及化学调节的影响[10-12]。负责这些运动的结构是α3之后的一段延伸C末端保守的YF区段和高度保守的GGLG基序[13],同时GGLG基序还是Prx 1、Prx 2与硫氧还蛋白组成复合物的关键位点,在已报导的物种中,尼罗罗非鱼、裸盖鱼、鮸鱼、斑点叉尾鮰、斑马鱼以及鲤鱼的Prx 1均发现这一基序的存在。此外,Prx 1与Prx 2蛋白的氨基酸序列中Pro44、Thr48、Arg127高度保守,使两者在空间结构上形成环-螺旋结构,有效保护Cys的活性[14]

2 Prx 1和Prx 2的抗氧化机制

Prx 1和Prx 2属于过氧还蛋白家族,在机体调控抗氧化过程中发挥着关键作用。其抗氧化机制的核心依赖于两个活性Cys位点,Cys的突变将导致Prx 1和Prx 2的失活[4]。2-Cys的Prx以同源二聚体形式存在,其中一个亚基的N端Cys和另一个亚基的C端Cys通过脱氢作用形成二硫键,其中氢离子的转移则是依赖还原性辅酶Ⅱ,从而调节2-Cys Prx状态的转换。在一些体外研究发现缺乏还原性辅酶Ⅱ时,DTT和巯基乙醇可以作为供氢体,但是这其中不包含谷胱甘肽[15]

Prx 1和Prx 2的抗氧化机制在人类中已经进行了比较透彻的研究,同时这两种抗氧化酶在大部分物种中都是高度保守的,于是借鉴人类中已有的研究方法对于鱼类Prx 1和Prx 2的深入研究具有重要意义。在人类中已知的、与这两种抗氧化酶互作的蛋白均含有以下氨基酸基序的一种或几种,即:CXXC,PXXP以及LXXLL。CXXC序列是硫氧还蛋白,谷氧还蛋白中发现的重要氧化还原基序,更常见于蛋白质二硫键异构酶[16]。LXXLL相较于CXXC则在功能上呈现多样性,如序列结合、释放以及转录调控[17]。PXXP则一般认为与SH3结构域互作[18]。在鱼类中,还未见与2-Cys Prx互作蛋白的相关报导,以特征基序为基础,借鉴免疫共沉淀等技术将可以更好地帮助鱼类2-Cys Prx及其相关互作蛋白的发掘以进行更深入的研究。

3 Prx 1与Prx 2的生物学功能

Prx 1在鱼类多种组织中均有表达,虹鳟、斑点叉尾鮰以及大菱鲆等鱼类中Prx 1主要高表达于肝脏、肾脏、鳃以及血液淋巴细胞中[19-22],Southern Blot实验显示虹鳟Prx 1为单拷贝[19]。在多种病原如细菌、病毒与寄生虫刺激后,多种鱼类的免疫器官如头肾、脾脏中的Prx 1表达显著上调[22-24]。在脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)刺激后,斑点叉尾鮰Prx 1还发现了二次上调的趋势;在青斑河豚中,LPS刺激能诱导脾脏中Prx 1的表达,但是肾脏、脑、鳃以及皮肤中的Prx 1则有不同程度的下调[23]。在鱼虱刺激后,鲑鱼的头肾淋巴细胞、脾脏、鳃和皮肤均检测到Prx 1蛋白的表达,免疫组化结果显示以上组织中存在大量阳性信号[25],患有阿米巴鳃病的大西洋鲑中Prx 1的表达则下调,表明针对不同病原鱼类Prx 1在免疫反应中可能具有正调控与负调控两种模式。与哺乳动物Prx 1功能相似,原核表达的鱼类Prx 1能介导抗氧化反应,增强大肠杆菌中Thioredoxin(Trx)介导的H2O2还原作用[26]。重组条石鲷Prx 1蛋白则能抑制H2O2对机体造成的氧化效果,促进头肾淋巴细胞的增殖[27]。金头鲷、欧洲海鲈、大菱鲆以及鲤鱼的Prx 1也具有类似的生物学功能[21, 24, 28]。此外,斑马鱼Prx 1对于其血管的生成具有重要作用[29]。大腹海马的Prx 1可减少超螺旋DNA受到的氧化损伤,且还具有清除ROS以及提高细胞存活率等生物学功能[22]。Prx 1除了参与鱼类机体的免疫调节,在斑马鱼中对于其血管的生成具有重要作用[29]

同一物种的Prx 2和Prx 1蛋白具有较高相似度,一般在70%以上[20],也含有2个活性Cys活性位点。目前关于鱼类Prx 2的功能报道较少,仅对不同鱼类在病原刺激后的表达模式进行了分析。组织分布结果显示鱼类Prx 2大量表达于肝脏、头肾与血液[30-31]。鲤春病毒血症病毒(Spring viremiao of carp virus, SVCV)刺激后,鲤鱼Prx 2在外周血淋巴细胞、鳃、脾脏以及肠中显著性上调,肾和头肾中显著性下调,但Prx 1仅在外周血淋巴细胞中显著上调,鳃中下调[31]。嗜水气单胞菌感染后,香鱼肝脏中的Prx 2表达量也呈上调趋势[30]。LPS刺激后,青斑河豚Prx 2的表达则仅在脾脏中上调,肝脏无明显变化,其余组织中的表达均显著性下调[23]

上述结果显示,尽管鱼类Prx 1和Prx 2具有较高的相似度,但是两者在组织分布及病原刺激后的表达模式均不一致,表明上述两种蛋白在鱼体中可能具有不同的生物学功能,并且人类Prx 1和Prx 2除了具有抗氧化功能,还具有增强NK细胞杀伤活性与抗病毒等作用[14]。这些功能在鱼类中均未见报道,因此鱼类Prx 1和Prx 2两类蛋白功能还有待进一步的发掘。

4 展望

Prx 1与Prx 2广泛存在于脊椎动物中,在生物免疫调控或维持机体稳态中发挥着重要作用。哺乳动物Prx 1与Prx 2主要的功能为抗氧化,清除生理或者病理过程中产生的ROS,保护DNA免受氧化损伤,还能增强NK细胞的杀伤活性,因此这两个基因又被称为Natural Killer Enhancing Factor(NKEF)。在研究人类Prx 1和Prx 2过程中,诸多体外实验通过添加氧化剂来验证该基因的功能,或利用抗原抗体特异性结合来封闭Prx 1和Prx 2的关键位点从而探究其功能。此外利用Co-IP或GST-Pulldown等体内外蛋白互作实验发现相关互作蛋白,将人源Prx 1的重组蛋白与NK细胞共培养后显著增强NK细胞对肿瘤或部分异源细胞的杀伤作用。而鱼类Prx 1与Prx 2的研究表明两类蛋白同样也参与了鱼体的抗病免疫,但是目前较多的研究方法是病原刺激后,通过qRT-PCR实验探究这两种基因转录水平的变化,或者探究重组蛋白与氧化剂的拮抗作用,蛋白互作及更深层次功能机制尚需进一步的解析,本文对已经报道的鱼类Prx 1与Prx 2进行了综述,将有助于深入了解鱼类Prx 1与Prx 2在鱼类抗病免疫中的作用机理,为制定水生动物疫病防控对策提供参考。

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