乙型肝炎病毒（HBV）感染仍然是影响人类健康最普遍的问题之一，全球约有2.4亿人长期感染，每年死亡人数超过60万（世界卫生组织，2015年）[1]。这使得研究新型的抗乙肝病毒药物显得尤其重要。然而，因为现有的抗乙肝病毒药物包括干扰素-α和抑制病毒逆转录酶的核苷酸类似物的副作用，耐药性以及治疗的高成本，导致许多HBV感染的患者尚未接受抗病毒药物治疗[2-3]。在中国，几千年来用于医药用途的中药始终是新的抗HBV候选物的有力来源[4]。
近几年，苎麻的药用价值引起了越来越多学者的关注。前人研究已确定苎麻含有三萜、多酚、黄酮、绿原酸、槲皮素、熊果酸等成分，其成分被证明具有抗肿瘤作用、抗病毒、抗菌、保肝、降血糖和抗氧化作用[5]。为此，笔者对苎麻叶绿原酸在HepG 2 2.2.15细胞中对乙型肝炎病毒HBsAg和HBeAg抑制作用进行了实验研究。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株HepG 2 2.2.15细胞由北京大学医学院第一附属医院病毒研究所提供，桂林医学院药理实验室定期用G418筛选。
1.1.2 药物与试剂苎麻绿原酸（武汉大学提供），替诺福韦（上海源叶），DMEM（Gibco），G418（Gibco），胰蛋白酶- EDTA消化酶（Solarbio），胎牛血清（浙江天杭），青霉素-链霉素混合液（NOVON），PBS（Solarbio），HBsAg，HBeAg试剂盒（上海科华）。
1.1.3 仪器与设备CO2培养箱（SANYO），倒置显微镜（上海蔡康），超净工作台（天津市尘埃净化设备厂），酶联免疫检测仪（BioTek），细胞培养瓶（Corning），96孔板（Corning）。
1.2 方法 1.2.1 苎麻绿原酸药液的制备与配置苎麻绿原酸溶于DMSO后加入DMEM培养液混匀，配制成1 000 μg/mL浓度（使其DMSO浓度为10%）。用含10%DMSO的DMEM培养液按梯度稀释法，稀释成500.0 μg/mL、250.0 μg/mL、125.0 μg/ mL、62.5 μg/mL 4种浓度。
1.2.2 细胞培养将HepG 2 2.2.15细胞以1×104个/mL接种于96孔板，置于37℃、5% CO2培养箱培养24 h后，细胞贴壁且状态良好，去除原有培养基，加入180 μL完全培养基，再加入20 μL上述苎麻绿原酸药液（终浓度为100.00 μg/mL、50.00 μg/mL、25.00 μg/mL、12.50 μg/mL、6.25 μg/mL），每3 d更换相同培养基和药液。同时设置替诺福韦阳性对照组（终浓度为100.00 μg/ mL、50.00 μg/mL、25.00 μg/mL、12.50 μg/mL、6.25 μg/mL），以及无药物的阴性对照组，收集上清液置-20℃保存待测定。
1.2.3 四甲基噻唑蓝（MTT）法检测细胞毒性96孔板中每孔加入完全培养基100 μL和MTT 20 μL，置培养箱培养4 h，去除上清，加入DMSO 100 μL，置摇床轻轻震荡10~15 min，用酶标仪在490 nm处读取OD值，根据以下公式计算细胞存活率。
| $ 细胞存活率\left( \% \right) = \left( {实验组平均OD值/对照组平\\ 均OD值} \right) \times 100\% 。$ |
将第3，6，9日的上清液按HBsAg和HBeAg试剂盒说明书操作，用酶标仪在450 nm读取OD值，根据以下公式计算HBsAg和HBeAg的抑制率。
| $ 抑制率\left( \% \right) = \left( {对照组平均 OD值 - 实验组平均OD值} \right) \div \left( {对照组平均OD 值/空白组平均OD 值} \right) \times \\ 100\% 。$ |
用SPSS 23.0统计学软件进行分析，OD值用均数±标准差（x±s）表示，实验数据采用重复测量方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果与分析 2.1 对HepG 2 2.2.15细胞毒性MTT结果显示：与阴性对照组相比，苎麻提取的绿原酸及阳性药物替诺福韦在所设浓度范围对HepG 2 2.2.15细胞毒性较低（表 1）。
| 组别 Groups |
浓度 Concentration（μg/mL） |
吸光度 OD |
存活率 Survival（%） |
| 阴性对照 Negative control |
— | 1.03±0.03 | — |
| 替诺福韦 Tenofovir |
6.25 | 0.98±0.06 | 95.45 |
| 12.50 | 1.27±0.18 | 123.39 | |
| 25.00 | 1.19±0.15 | 115.79 | |
| 50.00 | 1.14±0.11 | 111.18 | |
| 100.00 | 1.00±0.16 | 97.92 | |
| 苎麻绿原酸 Chlorogenic acid of ramie extracts |
6.25 | 1.08±0.17 | 105.72 |
| 12.50 | 1.05±0.12 | 102.14 | |
| 25.00 | 1.14±0.26 | 110.75 | |
| 50.00 | 1.25±0.07* | 121.38 | |
| 100.00 | 0.93±0.15 | 90.16 | |
| 注：与阴性对照组比较，*P＜0.05 Note：Compared with the negative control group，*P＜0.05 | |||
2.2 对HepG 2 2.2.15细胞HBsAg和HBeAg的抑制作用
通过检测HepG 2 2.2.15细胞第3，6，9日上清液的HBsAg和HBeAg，结果显示：与阴性对照组相比，苎麻提取物绿原酸对HepG 2 2.2.15细胞的HBsAg的表达呈现明显的时间依赖性和浓度依赖性抑制，且在第9日达到峰值，阳性药替诺福韦对HepG 2 2.2.15细胞的HBsAg的表达抑制率很低。苎麻提取物绿原酸和阳性药物替诺福韦对HepG 2 2.2.15细胞的HBeAg均无抑制作用（表 2~3）。
| 组别 Groups |
浓度 Concentration (μg/mL) |
吸光度 OD |
抑制率 Inhibition (%) |
|||||
| 3 d | 6 d | 9 d | 3 d | 6 d | 9 d | |||
| 阴性对照 Negative control |
— | 2.63±0.26 | 3.21±0.30 | 2.21±0.20 | — | — | — | |
| 替诺福韦 Tenofovir |
6.25 | 2.79±0.74 | 3.14±0.17 | 2.38±0.32 | -6.41 | 2.12 | -7.70 | |
| 12.50 | 2.83±0.25 | 3.09±0.22 | 2.12±0.16 | -7.78 | 3.61 | 3.77 | ||
| 25.00 | 2.46±0.20 | 2.88±0.15 | 1.76±0.28 | 6.13 | 10.23 | 20.46 | ||
| 50.00 | 2.30±0.48 | 2.74±0.23 | 1.75±0.15* | 12.42 | 14.43 | 20.96 | ||
| 100.00 | 2.28±0.20 | 3.03±0.36 | 1.81±0.34 | 13.14 | 5.60 | 17.98 | ||
| 苎麻绿原酸 Chlorogenic of ramie extracts |
6.25 | 2.89±0.94 | 2.70±0.25 | 1.73±0.30 | -9.97 | 15.86 | 21.47 | |
| 12.50 | 2.18±0.31 | 2.43±0.10* | 1.39±0.08* | 16.84 | 24.30 | 36.96 | ||
| 25.00 | 1.88±0.16* | 2.02±0.11* | 1.11±0.04* | 28.52 | 37.13 | 49.55 | ||
| 50.00 | 1.70±0.19* | 1.72±0.18* | 1.10±0.10* | 35.07 | 46.33 | 50.17 | ||
| 100.00 | 1.79±0.11* | 1.36±0.07* | 0.66±0.09* | 31.74 | 57.57 | 70.12 | ||
| 注：与阴性对照组比较，*P＜0.05 Note：Compared with the negative control group，*P＜0.05 | ||||||||
| 组别 Groups |
浓度 Concentration(μg/mL) |
吸光度 OD |
抑制率 Inhibition (%) |
|||||
| 3 d | 6 d | 9 d | 3 d | 6 d | 9 d | |||
| 阴性对照 Negative control |
— | 3.69±0.02 | 3.70±0.06 | 3.73±0.06 | — | — | — | |
| 替诺福韦 Tenofovir |
6.25 | 3.64±0.06 | 3.72±0.02 | 3.67±0.14 | 1.17 | -0.67 | 1.66 | |
| 12.50 | 3.72±0.05 | 3.65±0.05 | 3.80±0.17 | -0.79 | 1.21 | -1.76 | ||
| 25.00 | 3.79±0.13 | 3.68±0.04 | 3.51±0.42 | -2.78 | 0.50 | 6.01 | ||
| 50.00 | 3.71±0.07 | 3.79±0.04 | 3.80±0.08 | -0.61 | -2.40 | -1.93 | ||
| 100.00 | 3.66±0.05 | 3.73±0.09 | 3.68±0.14 | 0.63 | -0.96 | 1.36 | ||
| 苎麻绿原酸 Chlorogenic of ramie extracts |
6.25 | 3.67±0.10 | 3.65±0.04 | 3.81±0.07 | 0.48 | 1.19 | -1.97 | |
| 12.50 | 3.60±0.01* | 3.69±0.09 | 3.68±0.18 | 2.46 | 0.12 | 1.35 | ||
| 25.00 | 3.60±0.04* | 3.79±0.02 | 3.83±0.11 | 2.34 | -2.40 | -2.76 | ||
| 50.00 | 3.47±0.07* | 3.73±0.08 | 3.76±0.04 | 5.79 | -0.77 | -0.77 | ||
| 100.00 | 3.43±0.07* | 3.57±0.18 | 3.74±0.10 | 7.00 | 3.41 | -0.12 | ||
| 注：与阴性对照组比较，*P＜0.05 Note：Compared with the negative control group，*P＜0.05 | ||||||||
3 讨论
HepG 2 2.2.15细胞是由HBV-DNA体外转染人肝癌细胞HepG2后建立的细胞系，经实验室自行传代培养，细胞状态良好，它能长期、稳定分泌大量感染性病毒颗粒HBsAg和HBeAg，是目前各实验室广泛应用于筛选和评价体外抗HBV药物主要的细胞模型[6-7]。
替诺福韦是一种新型核苷酸类逆转录酶抑制剂，美国FDA于2008年批准其用于治疗成人的慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B，CHB）。2014年替诺福韦也被我国食品与药品监督管理局批准用于CHB患者的抗病毒治疗。替诺福韦以其前体药物富马酸替诺福韦酯的形式给药，可磷酸化转变为活性代谢产物二磷酸替诺福韦。二磷酸替诺福韦整合入DNA链后可终止DNA链，起到抑制病毒复制的作用[8-10]。在体外实验中，替诺福韦对HepG 2 2.2.15细胞分泌的HBsAg及HBeAg无明显抑制作用，与文献相符[11]，其通过抑制HBV-DNA的复制来治疗乙型肝炎。
在这项研究中，我们首次证明了苎麻提取物绿原酸在HepG 2 2.2.15细胞中明显抑制HBsAg的分泌，且呈时间依赖性和浓度依赖性。与阳性药物替诺福韦比较，苎麻提取物绿原酸抑制HBsAg效果更明显。苎麻提取物绿原酸对HBeAg无抑制作用。苎麻提取物绿原酸对细胞无毒性作用且抑制HBsAg效果佳，可能成为高效安全的新型抗HBV药物。
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