2. 福建农林大学作物科学学院, 福建福州 350002;
3. 广西科技大学鹿山学院, 广西柳州 545616
2. College of Crop Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian, 350002, China;
3. Lushan College of Guangxi University of Science and Technology, Liuzhou, Guangxi, 545616, China
金线莲Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl.属于兰科(Orchidaceae)开唇兰属(Anoectochilus)，为许多亚洲国家的珍贵植物，又名花叶开唇兰、金线兰、金线草，其性平、味甘，具有独特的药用特性，如清热凉血、祛湿、解毒等，享有“药王”的美称，广泛应用于观赏、烹饪和药用等方面[1-3]。最近研究表明金线莲还具有抗氧化、抗肝损伤、保护血管等功效[4-6]。目前金线莲的需求量极大，但由于民间长期采挖，生态环境遭到破坏，野生金线莲资源趋于枯竭。因此，金线莲的人工种植规模迅速壮大，金线莲的产业化发展前景巨大。但金线莲的种质资源较为混杂，各种质之间的性状表现各不相同，因而显微镜鉴别法、薄层色谱法及DNA条形码技术等方法已被应用于识别药用植物金线莲及其伪品上[7]。本课题组在研究不同种质资源金线莲的遗传进化关系的基础上发现，不同种质金线莲性状分化较明显[8]。前期课题组通过对金线莲进行组织培养，纯化扩繁后获得性状表现单一的优良种质福建小圆叶金线莲和福建黑叶金线莲，在此基础上对这两个不同种质金线莲的生理生化特性及内源激素含量进行比较，拟为后续的金线莲优良品种选育提供参考依据，为筛选优良金线莲株系，促进金线莲产业化生产奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料供试金线莲由福建农林大学提供，经广西药用植物园组培扩繁，纯化后获得性状表现单一的优良种质：福建小圆叶金线莲和福建黑叶金线莲。试验在广西药用植物园实验室及科研基地进行。
仪器：电热恒温鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司)、UV 5100型紫外-可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)、Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)、高速万能粉碎机(大德药机)、DK-8D型电热恒温水槽(上海一恒科技有限公司)、超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)、JJ500型电子天平(双杰测试仪器厂)、FA2004型电子天平(舜宇恒平科技仪器有限公司)、22331Hamburg型离心机(Eppendorf公司)、各型号移液枪(Eppendorf公司)。
试剂：三氯乙酸(国药集团化学试剂有限公司，批号：20141110)、盐酸(成都市科龙化工试剂厂，批号：20101118)、硫酸(廉江市爱廉化试剂有限公司，批号：20150113)、磷酸氢二钠(广州新建精细化工厂，批号：20141203)、葡萄糖(广东汕头市西陇化工厂，批号：0501311)、考马斯亮蓝G-250(北京天根生化科技有限公司，批号：03907)、磷酸、乙醇均为分析纯。所用水均为去离子水。
1.2 方法 1.2.1 试验设计试验设2个因子(福建小圆叶金线莲、福建黑叶金线莲)、3个处理(30 d扩繁丛生苗、30 d生根试管苗、30 d温室移栽苗)。试验开始后取整株植物完全展开叶片进行生理生化、内源激素测定试验。
1.2.2 测定项目与方法（1）主要生理生化特性测定
可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝比色法[9]；可溶性糖含量采用苯酚-硫酸法[9]；过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚比色法[10]；叶绿素含量测定采用李合生(2000)的方法进行[10]；丙二醛(MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸(TBA)反应法[9]。以上各项均用鲜样测定，每处理3次重复。
（2）内源激素测定
内源激素生长素(IAA)、赤霉素(GA)、脱落酸(ABA)和玉米素(ZR)含量测定均按照Elisa试剂盒使用说明进行操作，采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)。试剂盒使用时均在弱光下。
1.3 统计分析采用Excel 2007进行数据整理，用SPSS 17.0对数据进行统计分析，采用单因素(one-way ANOVA)和LSD法进行多重比较(α=0.05)，数据为平均值±标准差。
2 结果与分析 2.1 不同种质金线莲生理生化特性比较如表 1所示，整体上看，福建小圆叶金线莲在3个不同处理下的可溶性蛋白、可溶性总糖、MDA含量和POD活性均略高于福建黑叶金线莲，其中福建小圆叶金线莲和福建黑叶金线莲经扩繁、生根后其可溶性蛋白、可溶性总糖含量无显著差异(P＞0.05，下同)，而在移栽到温室大棚后可溶性蛋白、可溶性总糖均显著下降。与之相反，福建小圆叶金线莲和福建黑叶金线莲经扩繁、生根后叶绿素含量均有小幅下降，但无显著差异，而在移栽到温室大棚后叶绿素含量均显著上升(P＜0.05，下同)，其中黑叶金线莲的上升幅度较大。两个不同种质金线莲的不同处理中POD活性和MDA含量均无显著差异。
| 品种 Species |
处理 Treatment |
可溶性蛋白 Soluble protein (mg·g-1·FW) |
可溶性总糖 Soluble sugars(mg·g-1·FW) |
POD (U·g-1·FW·min-1) |
MDA (µmol·g-1·FW) |
叶绿素 Chlorophyl(mg·g-1·FW) |
| 福建小圆叶金线莲 A. roxburghii with small round leaves |
扩繁30 d丛生苗 30 d of propagation cluster seedlings |
18.55±0.19a | 46.11±0.89a | 8.46±0.23a | 0.156±0.003a | 1.26±0.02cd |
| 生根30 d试管苗 30 d of rooting tube seedlings |
18.62±0.36a | 45.74±1.46a | 8.37±0.24a | 0.156±0.008a | 1.24±0.01d | |
| 移栽30 d温室苗 30 d of greenhouse transplanting seedlings |
17.65±0.20b | 42.70±0.42b | 8.04±0.21ab | 0.157±0.009a | 1.45±0.12b | |
| 福建黑叶金线莲 A. roxburghii with black leaves |
扩繁30 d丛生苗 30 d of propagation cluster seedlings |
17.64±0.35b | 45.08±1.62a | 8.21±0.21ab | 0.153±0.002a | 1.39±0.05bc |
| 生根30 d试管苗 30 d of rooting tube seedlings |
17.71±0.27b | 45.27±1.08a | 8.15±0.31ab | 0.153±0.005a | 1.37±0.04bcd | |
| 移栽30 d温室苗 30 d of greenhouse transplanting seedlings |
16.63±0.24c | 42.16±0.68b | 7.90±0.28b | 0.154±0.002a | 1.67±0.16a | |
| 注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(P＜0.05) Note：Different small letters in the same column indicate the significant difference at 0.05 level | ||||||
2.2 不同种质金线莲内源激素含量比较
如表 2所示，整体上看，福建小圆叶金线莲在扩繁、生根、移栽处理下ABA和GA的含量均显著高于福建黑叶金线莲，而ZR和IAA含量在3个不同处理下与福建黑叶金线莲差异不显著，且移栽30 d后含量变化程度相同。福建小圆叶金线莲和福建黑叶金线莲在扩繁、生根、移栽温室大棚的处理中，扩繁30 d丛生苗ABA含量均略大于其他两个处理，但差异不显著；然而移栽30 d温室苗的ZR、GA和IAA含量均显著低于扩繁和生根苗。
| 品种 Species |
处理 Treatment |
ABA (µg·L-1·FW) |
ZR (ng·L-1·FW) |
GA (pg·mL-1·FW) |
IAA (ng·L-1·FW) |
| 福建小圆叶金线莲 A. roxburghii with small round leaves |
扩繁30 d丛生苗 30 d of propagation cluster seedlings |
2.77±0.05a | 1.54±0.09a | 4 374.17±64.13a | 4.63±0.24a |
| 生根30 d试管苗 30 d of rooting tube seedlings |
2.68±0.10ab | 1.56±0.02a | 4 291.58±127.62ab | 4.62±0.36a | |
| 移栽30 d温室苗 30 d of greenhouse transplanting seedlings |
2.71±0.17a | 1.20±0.04b | 3 285.30±70.40d | 4.14±0.10b | |
| 福建黑叶金线莲 A. roxburghii with black leaves |
扩繁30 d丛生苗 30 d of propagation cluster seedlings |
2.51±0.07bc | 1.58±0.04a | 4 184.66±74.63bc | 4.65±0.23a |
| 生根30 d试管苗 30 d of rooting tube seedlings |
2.44±0.05c | 1.60±0.02a | 4 033.03±116.17c | 4.68±0.07a | |
| 移栽30 d温室苗 30 d of greenhouse transplanting seedlings |
2.65±0.13ab | 1.18±0.08b | 2 921.02±59.30e | 3.88±0.15b | |
| 注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(P＜0.05) Note：Different small letters in the same column indicate the significant difference at 0.05 level | |||||
3 讨论
在长期的进化过程中，植物为保护自己免受或少受伤害而形成相应的清除活性氧自由基保护酶系统，在逆境条件下调动自身的防御系统，如POD活性的变化。在某些环境下，虽然POD酶系统的功能加强，但其调节能力有限，因而体内积累了过剩的氧自由基，导致膜脂过氧化作用，产生大量MDA，MDA含量上升[11]。福建小圆叶金线莲在扩繁、生根、移栽过程中POD活性和MDA含量略高于福建黑叶金线莲，但其叶绿素含量低于福建黑叶金线莲，且在移栽30 d后达显著水平。Yu等[12]研究结果表明，MDA含量升高意味着氧化应激增加，同时MDA可以促进叶绿素降解，从而减少光合作用。因此，福建小圆叶金线莲对环境变化的自身调节能力更强，适应性更好。另外，金线莲移栽到温室大棚后叶绿素含量升高，可能是自然光更有利于叶绿素的合成，从而利于光合作用，为植株积累更多的养分，与符真珠等[13]研究的牡丹大田苗叶绿素含量较试管苗高的结果类似。
可溶性蛋白和可溶性糖含量的高低可间接反映各种代谢活动的强弱[12]。福建小圆叶金线莲可溶性蛋白和可溶性总糖含量均高于福建黑叶金线莲，且福建小圆叶金线莲、福建黑叶金线莲扩繁和生根苗的可溶性蛋白、可溶性总糖含量均显著高于移栽苗，说明福建小圆叶金线莲体内代谢活动较福建黑叶金线莲活跃，福建小圆叶金线莲适应环境变化的能力更强；而扩繁、生根苗体内代谢活动较移栽苗活跃。
段娜等[14]的研究结果表明，植物生长发育与其体内的内源激素密切相关，内源激素含量变化在植物响应环境变化中发挥重要作用。其中，ABA是调控植物发育及对外界环境适应的重要信号分子，如干旱胁迫下苗期木薯中内源ABA的生物合成量增加[15]；弱光胁迫下甘蔗ABA含量增加以利于其适应弱光环境[16]。另外，低温下笃斯越橘幼苗GA3含量上调，有助于降低自由水的含量，延缓植物叶片枯黄衰老和维持细胞膜的稳定性，使其对低温环境表现出较强的适应性[17]。本研究中，在环境变化时福建小圆叶金线莲体内ABA和GA含量均显著高于福建黑叶金线莲，推测出福建小圆叶金线莲对环境的适应性可能强于福建黑叶金线莲。另外，两个不同种质金线莲的扩繁和生根苗的ZR、GA、IAA含量均显著高于移栽苗，可能是由于金线莲移栽到温室大棚后缓苗、昼夜温度变化、生存环境变化等导致植株健康受到威胁，ABA含量逐渐增加以适应外界环境，另一方面则抑制ZR、GA和IAA信号途径，使其含量下降。
4 结论本研究比较金线莲组织培养纯化育种中获得的两个不同金线莲的生理生化指标与内源激素含量变化，结果表明福建小圆叶金线莲可能更易于适应环境的变化。由于金线莲生长速度较慢，本研究仅对金线莲组培苗种植后30 d的生理生化活性及内源激素含量进行测定，在后续研究中，将针对持续不同时间的金线莲种植苗做进一步研究，或对野生金线莲进行同时期比较试验，并进行有效成分测定。
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