0 引言

【研究意义】胆固醇作为影响健康的重要物质^[1-3]，不仅是疾病控制领域的重要检测对象，也是计量领域液相色谱仪器检定的重要物质。标准物质作为一种计量器具，由于其量值准确可靠，溯源链清晰，对于准确检测胆固醇含量和保证仪器的计量准确具有重要意义。【前人研究进展】目前，常见的胆固醇测定方法有液相色谱法(紫外检测器、蒸发光检测器)和液相色谱-质谱联用法^[4-7]，运用液相色谱紫外检测法对胆固醇标准物质进行均匀性、稳定性检验和量值核验的文献较少。【本研究切入点】本研究根据相关技术规范^[8-12]，基于液相色谱紫外检测法对甲醇中胆固醇溶液标准物质进行研制。【拟解决的关键问题】通过重量-容量法制备甲醇中胆固醇溶液标准物质，并运用液相色谱法进行均匀性、短期稳定性、长期稳定性检验和量值核验，研制了甲醇中胆固醇溶液标准物质，标准值为200 μg/mL(U_rel=2%，k=2)，用于测量仪器校准、测量过程质量控制及分析方法确认和评价。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试剂

胆固醇：采用中昊光明化工研究设计院有限公司研制的二氧化硫纯度标准物质，其编号为GBW(E)060063，纯度标准值为99.99%，相对扩展不确定度为0.01%(k=2)。

甲醇：采用德国进口的Merck无水甲醇试剂。

1.1.2 仪器

气相色谱-质谱联用仪：GCMS-QP 2010 Ultra；色谱柱(Rtx-5MS，30 m×0.25 mm ID×0.25 μm)；液相色谱仪：LC-20AT泵，SPD-20A紫外检测器；色谱柱(C18色谱柱)；天平：电子天平(AE200，METTLER TOLEDO)；电子天平(CPA225D，Sartorius)；精密恒温水浴：YCC-1，宁波天恒；空盒气压表：DYM3，长春气象局；容量瓶：1 000 mL，A级合格；一等标准密度计：0.65~1.95 g/cm³，浙江余姚比重计厂。

1.2 方法 1.2.1 甲醇测试方法

测试条件：进样口温度280℃，分流比100:1，柱流量1.0 mL/min，载气为He；程序升温方式：在35℃保持4 min，然后以5℃/min速率升至100℃，再以10℃/min升至280℃。测试结果如图 1所示。

1.2.2 胆固醇测试方法

均匀性、短期稳定性和长期稳定性检验测量条件：流动相为100%甲醇，流速1.0 mL/min，检测波长207 nm，柱温40℃。

1.2.3 制备

用十万分之一天平准确称取0.200 60 g的胆固醇纯度标准物质，用色谱纯甲醇溶解并定容至1 000 mL容量瓶中，混匀。配制时，容量瓶和甲醇试剂放在20℃的恒温水浴中，保证容量瓶和甲醇试剂体积的准确。

将甲醇中胆固醇溶液标准物质转移至分装玻璃试剂瓶中，先放在冰箱里于4℃避光静置，然后运用瓶口分液器移取3 mL标准溶液至各5 mL棕色安瓿瓶中，迅速对安瓿瓶进行封口，分装时环境温度为(20±5)℃，环境湿度为(40±10)%。配制1 000 mL标准溶液共分装甲醇中胆固醇溶液标准物质200瓶。该标准物质需冷藏保存。

1.2.4 短期稳定性检验

为评估在短期运输条件下标准物质的稳定性，对研制的标准物质进行了短期稳定性试验。将甲醇中胆固醇溶液标准物质分别随机抽取样品，放在4℃、60℃贮存7 d，其中4℃通过放在冰箱中实现，60℃通过放在烘箱中实现。在这7 d内，分别在第0，1，2，3，4，5，6，7天放置随机抽取的样品，于第8天统一测试。

用液相色谱仪紫外检测器对所抽取的各个样品进行测定，重复测定3次。测量前，先将标准物质样品避光放置在室温条件下平衡一段时间。各样品胆固醇的浓度值基于峰面积由新配制的甲醇中胆固醇溶液标准物质作为标准，将各测试值换算为浓度值。

1.2.5 长期稳定性

为了评价标准物质的稳定性，在贮存期间必须定期对标准物质进行抽样测定(贮存条件为存放于阴凉避光的室温条件下)。在每一次抽样测量过程中，运用液相色谱法测试各样品中胆固醇的含量，并控制环境条件尽量一致，使测量结果之间的差异着重反映出物质变化所引起的差异。根据“一级标准物质技术规范”的要求，对研制的甲醇中胆固醇溶液标准物质，基于先密后疏的原则，进行16个月的稳定性检验。

基于色谱峰面积，采用新配制的200 μg/mL的甲醇中胆固醇溶液标准物质作为标准给测试的样品浓度进行赋值。

1.2.6 定值及不确定度计算

本标准物质采用配制值作为标准值。该标准物质以中国计量科学研究院研制的胆固醇纯度标准物质和高纯度甲醇为原料，在室温为(20±2)℃的洁净室中，采用重量-容量法配制。胆固醇纯度标准物质的纯度值采用标准物质证书中给定的纯度值(标准值99.7%，U_rel=0.1%(k=2))。另外，使用的经检定合格的单标线移液管、容量瓶、精密恒温水浴和十万分之一天平等配制该标准物质。

$ C = \frac{{m \times P \times {{10}^{ - 6}}}}{V}, $

(1)

配制的甲醇中胆固醇溶液标准物质的标准值满足式(1)。其中，C为甲醇中胆固醇溶液标准物质的标准值，μg/mL；m为胆固醇纯度标准物质的称量质量，g；V为容量瓶的定容体积，mL；P为胆固醇纯度标准物质的纯度值，%。由式(1)计算可得，配制的甲醇中胆固醇溶液标准物质的标准值C为200.0 μg/mL。

标准物质的合成标准确定度u_c包括其定值过程引入的不确定度u_c(C)、标准物质的不均匀性引入的不确定度u_bb和标准物质的稳定性引入的不确定度u_s，见式(2)。其中，由式(1)可得配制过程引入的不确定度u_c(C)的计算公式见式(3)；均匀性引起的不确定度见式(4)；稳定性引入的不确定度u_s由u_s长(式5)和u_s短(式6)合成而得。

$ {u_c} = \sqrt {u_c^2\left( C \right) + u_{bb}^2 + u_s^2} , $

(2)

$ \begin{array}{l} \;\;\;\;{\left\{ {\frac{{{u_c}\left( C \right)}}{C}} \right\}^2} = {\left\{ {\frac{{{u_c}\left( m \right)}}{m}} \right\}^2} + {\left\{ {\frac{{{u_c}\left( P \right)}}{P}} \right\}^2} + \\ {\left\{ {\frac{{{u_c}\left( V \right)}}{V}} \right\}^2}, \end{array} $

(3)

$ {u_{bb}} = {s_{bb}} = \sqrt {\frac{{s_1^2 - s_2^2}}{n}} , $

(4)

$ {u_{s{\rm{张}}}} = s\left( {{\beta _{1{\rm{长}}}}} \right) \cdot {x_{{\rm{长}}}}, $

(5)

$ {u_{s{\rm{短}}}} = s\left( {{\beta _{1{\rm{短}}}}} \right) \cdot {x_{{\rm{短}}}}。$

(6)

1.2.7 验证

该标准物质研制完成后，运用中国计量科学研究院研制的甲醇中胆固醇溶液标准物质(编号GBW(E)130405，标准值为200 μg/mL，U_rel=2.0%，k=2)对该标准物质样品进行验证。根据峰面积运用GBW(E)130405标准物质对研制的标准物质的量值进行核验。

2 结果与分析 2.1 均匀性和稳定性检验

如表 1所示，取显著水平α=0.05，由F_α数值表可知F_α(0.05, 14, 30)=2.04。各样品胆固醇的浓度值基于峰面积由新配制的200 μg/mL甲醇中胆固醇溶液标准物质作为标准换算为浓度值。由表 1中统计结果可知，统计量F小于F_α，因此可以判断所制备的标准物质是均匀的。

由表 2和图 2可知，胆固醇浓度没有显著变化。因此，研制的甲醇中胆固醇溶液标准物质在4℃、60℃贮存7 d内其特征量值是稳定的。由表 2可知，甲醇中胆固醇的浓度没有显著变化，因此其在16个月的时间内其特征量值是稳定的。

2.2 定值及验证

根据1.2.6节的方法计算可得u_c等于0.75 mg/L。甲醇中胆固醇溶液标准物质的浓度为200.0 μg/mL。取包含因子k=2，其扩展不确定度U_rel=2×u_c/C=2×0.75/100≈2%，见表 3。对研制的标准物质进行验证，测量色谱图见图 3和图 4。研制样品的测量浓度与偏差等于0.08%，小于其不确定度，故验证合格。

3 结论

本研究运用称量-容量法制备了甲醇中胆固醇溶液标准物质。研制的标准物质具有很好的瓶间和瓶内均匀性，在4℃和60℃条件贮存一周，其量值稳定，表明短期运输条件下的稳定性可靠；在16个月内，其浓度稳定，具有很好的长期稳定性。测出的甲醇中胆固醇溶液标准物质结果：标准值为200 mg/L，U_rel=2%，k=2。