2. 青岛农业大学,山东青岛 266109;
3. 山东省海水健康养殖工程技术研究中心,山东青岛 266104
2. Qingdao Agricultural University, Qingdao, Shandong, 266109, China;
3. Healthy Mariculture Engineering Research Center of Shandong Province, Qingdao, Shandong, 266104, China
【研究意义】 海水青鳉Oryzias melastigma隶属辐鳍亚纲Actinopterygii颌针鱼目Beloniformes怪颌鳉科Adrianichthyidae青鳉属Oryzias,是一种小型的热带鱼种。海水青鳉作为代表性的海洋模式生物鱼种,具有性别易区分、世代周期短、产卵率高、盐度适应范围广、易于大规模繁殖等特点,现被广泛应用于生态和毒理方面的研究[1-4]。充分了解海水青鳉早期发育过程,可为生态毒理研究提供生物学基础。【前人研究进展】关于鱼类的早期发育,国内外学者已经对不同鱼类的早期形态学作了相关报道。方家仲等[5]、洪孝友等[6]结合仔稚鱼自身规律的特点,分别对大黄鱼Larimichthys crocea和美洲鲥Alosa sapidissima提出了早期划分规律。李艳华等[7]对达氏鳇Huso dauricus胚后发育的报道,单秀娟等[8]对鮸鱼Miichthys miiuy仔稚鱼发育的研究,都以不同的观点阐述了形态发育对早期环境适应的意义。雷霁霖等[9]通过研究大菱鲆Scophthalmus maximus,马爱军等[10]通过研究半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis,分别阐述了鲆鲽类早期发育及其变态过程。于道德等[11]研究了黑棘鲷Acanyhopagrus schlegelii等色素细胞发育及体色变化。Mendiola等[12]研究发现大西洋鲭Scomber scombrus早期发育过程中,无论是内源营养时期还是外源营养时期,其发育和生长均受温度影响显著。Kupren等[13]报道了江鳕Lota lota的早期发育以及外部形态学参数的异速生长,还依据外部形态学特征对早期仔稚鱼进行划分。【本研究切入点】关于海水青鳉早期发育的报道极为鲜见,仅有陈漪等[14]对海水青鳉早期胚胎发育的研究报道, 以及作者先前对海水青鳉胚胎发育进行的研究。【拟解决的关键问题】详细研究海水青鳉从孵化期到幼鱼期外部形态特征发育,为海水清鳉能够被广泛研究应用提供参考。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 亲鱼来源及培养2016年1月9日,于山东省海洋生物研究院人工气候室玻璃水缸,培育30日龄海水青鳉亲鱼70条。水温26~28℃,盐度27‰,14 h:10 h的光照:黑暗。早晚2次投喂卤虫无节幼体,每天吸底换水一次,排除粪便残饵,换水量1/2,以此条件培育至产卵期。
1.1.2 仔稚鱼来源及培养收集自然受精卵,在水温26~28℃,盐度27‰,14 h:10 h的光照:黑暗,经过13~14 d孵化,收集孵化的仔鱼,于500 mL的烧杯进行培养。每个烧杯仔鱼数不超过15条,微充氧前期投喂经小球藻强化的褶皱臂尾轮虫,轮虫密度不低于10个/mL,从第10天投喂褶皱臂尾轮虫+卤虫无节幼体,5 d后停止投喂轮虫。每天吸底换水,保证水质清洁。
1.2 观察方法为了能够详细地观察,实验设定从0~4 d每天取样一次,5~12 d每2 d取样一次,15~40 d每5 d取样一次,每次从同一批仔鱼不同烧杯中平均取样10尾。使用Ms222(0.05 mg/mL)将仔鱼麻醉,于奥林巴斯SZ61解剖镜观察仔鱼外部形态,并进行生物学测量(全长、体长、体高、吻长、眼径),求其平均值,记录仔鱼发育各个时期的形态特征。使用CCD图像传感器和SONYH-50相机拍照,DN-2软件处理显微图像,并通过Excel 2003进行数据统计。
2 结果与分析 2.1 发育分期根据卵黄囊、油球的吸收,鳍的发育,以及鳞片等发育特征将海水青鳉早期发育阶段划分为仔鱼期、稚鱼期、幼鱼期。仔鱼期又分为早期仔鱼(卵黄囊仔鱼)和后期仔鱼两个阶段。各发育阶段的形态学参数见表 1。
0日龄(初孵仔鱼):卵黄囊长径0.78 mm,短径0.64 mm,油球直径0.23 mm。刚孵化的仔鱼具有两种形态:一种鱼体透明,侧卧水底;另一种破膜孵化的瞬间,便旋转式地快速游动到水面,间歇性地运动。仔鱼眼球浓黑,卵黄囊椭圆形,油球位于卵黄囊底部中间部位,卵黄表面血液循环清晰。心脏位于头部下方,清晰可见,血液微红色。仔鱼头部紧贴卵黄囊。此时仔鱼上下颌紧闭,但也有部分仔鱼已开口,上下颌微微颤动;肠道直线型,紧贴腹腔顶部,肛门未开通。鳃弓明显,共3对;耳石清晰,左右对称,每侧2个;体节26对。胸鳍发达,呈扇形,没有明显的鳍条,呈透明的薄膜状,不断地摆动。在16~17体节处,背鳍膜连接尾部延伸至肛门处,鳍膜上有放射线丝;尾鳍呈圆弧形,鳍条明显,约4~6条,透明且有少许的黑色素点分布在鳍条处,鳍膜边缘平滑。脊索直线型,在尾部向上弯曲。在头顶部、腹腔底部以及顶部分布有少量的黑褐色素斑点,脊索两侧线以及背线、腹线分布有黑色素点,呈线型,其中腹线有两条黑色素线,呈“虚线”状。(图 1-1A~B)。
1日龄:油球直径0.16 mm。胸鳍增大,不断颤动,仔鱼在水中或是停留在水层或是紧贴烧杯壁,偶尔间歇运动,或是巡游搜索饵料。头部略微抬起,已开口,上下颌不住颤动张合,鳃丝红色,卵黄囊透明,肠道隆起弯曲,开始蠕动,个别仔鱼开始摄食,进入混合营养阶段,肛门未开通,内脏团清晰,鳔已充气。背线、侧线明显,呈微黄色。尾部弯曲的脊索处,两块尾下骨出现,尾鳍条明显,4~6条分别附着在尾下骨上,中间2~3条鳍条开始分为2~3节;腹部的鳍褶变厚,肛门前鳍褶增大;腹部、头顶部黑色素增多,肌节数没有变化(图 1-2A~B)。
2日龄:油球直径0.14 mm。仔鱼头部抬起,上下颌不停地闭合,肠道横向右侧弯曲,缓慢蠕动,肠道充满食物,肛门开通。由于肠道充满食物,以及腹部黄色素的扩散,腹部开始浑浊,不透明。腹部的星芒状的黑色素细胞继续扩散,头顶部的色素点变大,成“菊花”状。黑褐色素在腹腔顶部、眼球后部出现,在光亮处,透明的仔鱼的躯干部呈现荧光蓝色。仔鱼尾下骨明显,尾鳍条数变为6~7条,中间部位的4~5条分为2~4节;腹部鳍褶射线消失(图 1-3)。
3日龄:卵黄囊消失殆尽,部分仔鱼还残留很小的油球。由于黄色素的扩散以及肠胃中的食物,已经无法清楚地观察腹腔内部,肛门开通,腹部上侧黑褐色素斑点进一步增多变大。仔鱼游动迅速,并停留在不同的水层寻找食物。瞳孔颜色加深明显,鳃盖处有黑色素点出现。臀鳍膜进一步加厚,仔鱼尾鳍条数增加至7~8条,中间4~6条分为2~4节;肛门前鳍褶变大,趋于完善。
2.2.2 后期仔鱼4日龄:卵黄囊油球全部消耗,仔鱼从混合营养转向外源营养。仔鱼肌节数27节,没有变化;头顶部、眼球后方色素斑变大,腹腔两侧的黑色素点增多。仔鱼游动迅速,在不同的水层寻找饵料。尾鳍条数为7~8条,中间5条分为2~4节(图 1-4)。
6日龄:体长有所减小,背部的黑褐色素斑点增大,腹腔两侧黑色素点不断地增多。仔鱼的躯干部透明,光亮处呈现“荧光蓝绿色”,部分仔鱼个体的前9肌节处,呈现“荧光黄”色。仔鱼尾鳍条数增至9~10条,中间6~7条分为2~5节;背部的鳍膜逐渐消退,腹部鳍褶增厚,靠近肛门处的鳍褶逐渐加宽(图 1-5)。
8日龄:体长增加,体节不变。鳃盖处有黑色素点出现,耳腔与鳃弓之间的两片黑褐色素斑颜色加深;头顶部的黑褐色斑点变大,将要连成一片;腹腔底部的色素斑点有所减少,腹线、背线处的色素点变大,侧线处的斑点变小。在眼球后下方围眶骨出现5~6个小泡。胸鳍长度没有太大变化,鳍条出现,不明显;尾鳍不断地延长,鳍条增至10~12条,中间6~8条分为3~6节。背部鳍膜逐渐消退,在21~22肌节处,背鳍褶略有凸起,背鳍原基形成。腹部的鳍褶不断地增厚,靠近肛门处鳍褶基部,出现了6~7条臀鳍条。此时仔鱼游动能力变强,能够在水中上下巡游,搜索食物。(图 1-6A~C)。
10日龄:胸鳍条明显且增多,约4~5条,支鳍骨处有黑色素点出现;尾鳍进一步拉长,鳍条增至12~15条,中间9条分节,最多分为8节。臀鳍条出现约9~13条;在20~22肌节处,背鳍原基出现,只有1个。腹腔两侧的黑色素继续增加;头顶部、腹腔底部的色素斑点逐渐消退;头部和腹部的黄色素细胞不断增加;上下颌边缘出现黑色素点,上下对称。眼球后下方围眶骨处的小泡数量增多,并且向着眼球的前缘生长。臀鳍与尾鳍之间的鳍膜未消退。背鳍芽明显,背鳍与尾鳍之间的鳍褶也未消退(图 1-7A~C)。
12日龄:胸鳍长度没有增加,但是胸鳍条增至8条,中间5~6条分为2~4节;臀鳍的宽度不断增加,臀鳍增至14~17条;尾鳍拉长,鳍条增至12~15条,中间鳍条最多分为8节;背鳍变大,背鳍膜消退至尾柄处。头、腹部的黄色素细胞增加;上下颌左右两侧的黑色素点增大,形成“雪花”状;腹腔底部仅剩心脏处的两片黑色素斑;眼球后下方的小泡变大,此时期鳃丝微红色,明显可见(图 2-1)。
15日龄:胸鳍的长度以及鳍条数没有明显的变化,臀鳍条数增至15~17条,尾鳍的长度进一步增加,鳍条数、节数并未增加;黑色素在臀鳍与尾鳍膜出现。背鳍增长不明显,鱼尾鳍间的鳍褶逐渐消失。眼球下侧的围眶骨日渐凸起,眼球周围的小泡变多;上下颌黑色素点变大;向上弯曲的尾椎分节融合成为尾下骨,此时尾下骨垂直于脊索。胸鳍长度相对于12日龄时无变化;尾下骨垂直于脊索,背鳍与尾鳍之间的鳍膜变低(图 2-2A~E)。
20日龄:仔鱼适应了卤虫无节幼体,生长迅速,长度、宽度增加明显。胸鳍长度增加明显,分化的胸鳍条数增加至10条,最多分节为8节;仔鱼背鳍与尾鳍之间的鳍褶消退,背鳍完全分化出来,尾鳍条数增加至14~17条,最多的分节数为10节,尾鳍基部和边缘出现黑色素,并不断地扩大;臀鳍条增至17~19条,臀鳍与尾鳍中间残留部分鳍褶,臀鳍的黑色素点不断扩散增大,黄色素在靠近肛门的臀鳍条上不断地增多;在腹腔的后部,靠近肛门处,腹鳍已出现。腹部的黑色素逐渐密集增加,彩虹色素在黑色素区的下部也逐渐变多;头部的黑色素逐渐消退,取而代之的黄色素逐渐增加。耳石清晰,直径变大为0.07 mm。至此时除了臀鳍与尾鳍间的鳍褶未完全退化,仔鱼所有的鳍均已发育、分化,标志仔鱼期已结束,接下来将进入稚鱼期(图 2-3)。
2.2.3 稚鱼期25日龄:仔鱼各个鳍逐渐发育完善,稚鱼快速游泳,能够更快地寻找食物。胸鳍条数增至9条,基部肩带处有黑色素点分布;尾鳍条数为18~19条,分为11节,尾鳍膜透明,在尾鳍膜之间的黑色素点逐渐向尾下骨处变为黑色素斑,面积逐渐变大,臀鳍条数为19条,分2~7节,黑色素点由臀鳍的边缘向基部增多且变大,红黄色素在“锯齿状”的边缘处出现,靠近肛门的臀鳍条中黄色素分布鳍条不断增加;背鳍条数为5条,有黑色素丝分布于鳍条两侧;腹鳍变化明显,出现鳍条5条。腹部两侧的黑色素继续增加,头顶部黑色素也在生长;靠近肛门处的臀鳍条出现黄色素点,上下颌出现红褐色素,并且色素点不断扩大。仔鱼躯体两侧有圆鳞出现,鳞片花纹螺旋,规律排布(图 2-4,3-1)。
30日龄:胸鳍条数为11条,中间9条分节,每个鳍条处、鳍基部有少量的黑色素丝;尾鳍条18~20条,分14节,此时最重要的特征即尾鳍中间6条鳍条开始分枝,鳍条间有鳍膜连接,有大量的黑色素分布,由鳍的边缘到基部,黑色素由“雪花”状到黑色素点模式分布;背鳍、臀鳍的支鳍骨较明显,臀鳍条数为19~21条,靠近肛门的几条黄色素、黑色素分布模式与尾鳍色素分布相似,靠近尾鳍的两鳍条开始分枝,前7条鳍条出现黄色素;背鳍7条,第1条与其他分离,较短,鳍条上分布黑色素点;腹鳍条数为5条,分5节,同样有少量的黑色素丝分布于鳍条之上。头顶部的黑色素与背侧线连接,成“三角形”色素斑;上下颌有红色素斑出现,原有的黑色素扩散,形成雪花状;整个尾部依旧透明,强光处,整体呈现荧光蓝色,背部两侧有黑色素点出现,脊索两侧黄色素分布明显。仔鱼外形已接近成鱼,各个鳍已发育完善,仔鱼游动迅速,摄食、躲避敌害强(图 3-2A~C)。
35日龄:仔鱼各个鳍条发育完善,鱼体披鳞,雌雄分化明显。胸鳍条数为9~10条,中间8~9条分节,最多分为8~9节;臀鳍条数为18~19条,1~2条分枝,最多分为9节;尾鳍薄而透明,分布黑黄色素点,鳍条有18~20条;背鳍鳍条7条;腹鳍较小,有5~6条鳍条。尾鳍、臀鳍黑色素似“雪花”状,在鳍膜之间分布范围较广;臀鳍的前6~7鳍条处以及边缘处,黑色素分布明显,且在背鳍、臀鳍边缘有红色素出现。背鳍和腹鳍主要分布黄色素和黑色素丝,胸鳍主要是鳍条处有黑色素丝分布。鱼体的头部以黄色素和红色素为主,躯干部以黄色素为主,体表荧光蓝色,依然为透明状态。腹部表面完全黑色,鳔透明隐约可见;头盖骨凸起,分布有几十个大小不一的黑色素点;上下颌呈黄色,边缘分布25~30个大小不一的黑色素点;背侧线的黑色素点不再呈直线,而是零星分布于背面,鱼体形态近似于成鱼(图 3-3A~E)。
3 讨论 3.1 海水青鳉早期发育阶段的划分为了能更好地了解不同鱼类早期仔稚发育的过程,何永亮等[15]根据卵黄囊、油球有无,尾椎弯曲、鳍和鳞片等发育特征将卵形鲳鲹Trachinotus ovatus早期发育阶段划分为仔鱼期(卵黄囊仔鱼、前弯曲仔鱼、弯曲仔鱼、后弯曲仔鱼)、稚鱼期、幼鱼期。施兆鸿等[16]把消化器官的发生发育也作为仔稚鱼划分的标志,根据消化系统对内、外营养的吸收,将银鲳Pampus argentus划分为前期仔鱼期、后期仔鱼期、稚鱼期和幼鱼期。周庆杰等[17]依据卵黄囊的变化、长鳍棘的生长与收缩、鳞片的出现,将七带石斑Epinephelus septemfasciatus划分为仔鱼期(前期仔鱼、后期仔鱼)、稚鱼期、幼鱼期,并且将仔鱼长鳍棘绝对长度最大作为后期仔鱼结束的标志。秦志清等[18]根据右眼的移位、冠状幼鳍的消长以及卵黄囊和体色的变化,将漠斑牙鲆Paralichthys lethostigma的胚后发育划分为仔鱼期(前期仔鱼和后期仔鱼)、稚鱼期和幼鱼期。Neira等[19]根据脊索的弯曲、头棘的顺序、鳍的形成来划分谐鱼Emmelichthys nitidus卵黄囊后期的仔鱼。本研究参考Kendall等[20]、殷名称[21]以及上述研究,根据卵黄囊、油球的吸收,鳍的发育,以及鳞片等发育特征将海水青鳉早期发育阶段划分为仔鱼期、稚鱼期、幼鱼期。仔鱼期又以卵黄囊的吸收为界线,分为早期仔鱼(卵黄囊仔鱼)和后期仔鱼两个阶段。以各鳍发育完成,鳞片出现,作为进入稚鱼期的标志。鱼体全身覆盖鳞片,体型体色接近成鱼作为幼鱼期的标志。
3.2 鳍的发育顺序鳍是幼鱼发育到一定阶段,按照一定的次序,通过鳍褶和鳍基分化,逐渐发育而成。鳍的发育是鱼类生活史的一部分,它与栖息条件、活动、食性和生活习性等有密切的关系[22]。海水青鳉的胸鳍、尾鳍形成于胚胎发育时期,至仔鱼孵化时期尾鳍条数为4~6条,有黑色素点分布。臀部鳍褶伴随着尾鳍膜的增长,逐渐出现变大,孵化后8日龄臀鳍条出现,并且逐渐变宽。背鳍的发育起始于8日龄,紧随着腹鳍原基15日龄开始发育,20日龄观察明显。海水青鳉各鳍开始发育和分化的顺序是胸鳍、尾鳍、臀鳍、背鳍、腹鳍。
胸鳍的主要功能是运动、转向和维持身体平衡,大多数鱼类的胸鳍都最先发育:青龙斑Epinephelus coioides ♀×E.lanceolatus ♂[23]、梭鱼Liza haematocheila[24]鳍的发育顺序为胸鳍、尾鳍、腹鳍、背鳍、臀鳍;日本鬼鲉Inimicus japonicus[25]鳍的发育顺次为胸鳍、尾鳍、背鳍、腹鳍、臀鳍;大黄鱼[5]、鲻鱼[26]鳍的发育顺序为胸鳍、尾鳍、臀鳍、背鳍、腹鳍,与海水青鳉鳍发育顺序相同;卵形鲳鲹Trachinotus ovatus[27]、条石鲷[22]鳍的发育顺序为胸鳍、尾鳍、背鳍、臀鳍、腹鳍;但是不同种属的鱼类,背鳍、臀鳍、腹鳍的发育顺序各不相同。有的种类尾鳍首先发育,如乌鳢Canna argus[28]各鳍的发育顺序为尾鳍、胸鳍、背鳍、臀鳍、腹鳍。无论各鳍的发育顺序如何,鱼类鳍的发育与营养的转换有密不可分的关系,海水青鳉孵化后就开口摄食,初孵仔鱼的胸鳍和尾鳍相对比较完善,为内源营养向外源营养的转化提供了基础的保证。
臀鳍位于鱼体后下方的肛门与尾鳍之间,是维持鱼体直立和平衡的器官[29]。而海水青鳉的臀鳍不仅具有一般鱼类的功能,对于雄性海水青鳉,臀鳍还是独特的交配器:达到性成熟的海水青鳉,雄鱼不断地用臀鳍包围雌鱼的泄殖腔,给雌鱼一定的刺激,雌鱼会产不同数量的卵,悬挂于泄殖腔处,雄鱼迅速用臀鳍包围泄殖腔以及悬挂的卵,排出精液,供卵子受精,受精过程大约会持续5 min左右,之后,雌鱼不再让雄鱼靠近。在没有外界干扰的情况下,这种以臀鳍作为交接器的方式,可提高受精率。海水青鳉8日龄臀鳍条出现,不断增多,靠近肛门处的臀鳍不断加宽;35日龄,臀鳍的形状分化明显,可以根据臀鳍辨别雌雄:雌鱼的臀鳍边缘呈“锯齿状”,靠近肛门处较宽,规则的依次向尾部倾斜;雄鱼的臀鳍由于特化为雄性交接器,边缘也呈现“锯齿状”,但是靠近肛门处的部分鳍条发育相对较长,不规格的依次向尾部倾斜(图 3-3B~C),这也是鳉形目鱼类独有的特征[29]。
3.3 海水青鳉仔稚鱼发育的特征海水青鳉初孵仔鱼的眼球浓黑,胸鳍成“扇形”,尾鳍鳍条已经出现,部分仔鱼具有游动能力;尾椎也已经向上弯曲,尾下骨已形成。与其他鱼类相比较,达氏鳇[7]孵化后胸鳍原基出现,1日龄脊索末端才开始上翘,4日龄尾鳍条出现;鮸鱼[8]仔鱼孵化后2日龄胸鳍芽出现,10日龄尾鳍的下半部分出现鳍条,14日龄尾下骨出现。不同鱼类的器官发育时间顺序可能由遗传机制决定,同时还受外界环境如:水温、盐度、光照等影响。各个器官的发育程度是鱼体对环境适应性的一种体现,海水青鳉具有较高的成活率,也正是各个器官发育成熟的原因。
海水青鳉初孵仔鱼孵化后有部分仔鱼已经开口,1日龄开始摄食,进入了混合营养阶段,3日龄卵黄囊消耗完毕,4日龄油球耗尽。在Farris[30]报道的4种海洋仔鱼的早期生长率的变化中,将仔鱼的生长划分为3个阶段:初孵时的快速生长期,卵黄囊消失前后的慢速生长期及外源摄食后的稳定生长期(不能建立外源摄食的负生长期)。大泷六线鱼Hexagrammos otakii[31]、军曹鱼Rachycentron canadum[32]、北海鲱Clupea harengus[33]、泥鳅Misgurnus anguillicaudatus[34]等多数种类的仔鱼生长均与之符合。海水青鳉初孵时生长较缓慢,卵黄囊消失前后生长较慢速,甚至出现负生长,外源营养摄食后,进入快速生长期。殷名称[35]在研究北海鲱的报道中指出,进入摄食期后,体内存贮的营养物质和能量主要用于提高活动水平,搜索并摄取饵料,建立外源性营养关系,而暂缓生长耗能。海水青鳉过早进入摄食期,以至0~4日龄的仔鱼生长缓慢,而之后出现负增长的现象。先前学者研究也表明不能建立外源营养会出现负增长,对于本实验,由于每日孵化仔鱼数量较少,实验的仔鱼分批次饲养,尽管养殖方法相同,但是产卵亲鱼不同,可能会导致孵化后仔鱼有微小差异。
外源营养的建立与仔鱼巡游模式的建立相关[35]。海水青鳉1日龄仔鱼巡游摄食明显,在整个营养转换的过程中,几乎无个体死亡。外源营养建立后,仔鱼以摄食褶皱臂尾轮虫为主,仔鱼的生长进入增长期。发育至10日龄起,仔鱼饵料由褶皱臂尾轮虫逐渐向轮虫无节幼体转变。5日之后,仔鱼已全部摄食卤虫无节幼体,然后仔鱼再次进入快速生长期。因此,较好地了解海水青鳉仔鱼的生长规律,及时投喂仔鱼及进行饵料转换,可以保证仔鱼快速生长。
4 结论本实验对海水清鳉卵黄囊、油球的吸收情况, 鳍的发育时序, 以及鳞片的发育特征等进行了系统的观察与综合分析,将海水青鳉早期发育阶段划分为仔鱼期、稚鱼期、幼鱼期。海水青鳉各个鳍的发育时序为胸鳍、尾鳍、臀鳍、背鳍、腹鳍。本研究详细阐述了海水青鳉从孵化期到幼鱼期外部形态特征发育,为丰富海水清鳉的早期发育史奠定了基础。
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