[研究意义]红树植物白骨壤Avicennia mavina (Forsk.) Vierh.，又名海榄雌^[1]，为马鞭草科Verbenaceae白骨壤属Avicennia。该属植物我国只有一种，主要分布于福建、广东、广西、海南4省及台湾、香港、澳门地区沿海有红树林生长的滩涂。白骨壤果实俗称“榄钱”、“海豆”，味甘、微苦、性凉，具有清热、利尿、凉血败火的功效，是降压通血管的民间食疗植物^[2]。白骨壤果实全国年产量在30万t以上，是一种尚未规模开发利用的食用、保健和药用新资源^[3]，具有较高的学术研究价值和开发利用价值。[前人研究进展]白骨壤果实含有丰富的营养成分^[4]，并含有酚苷类^[5-6]和生物碱类等^[7]化合物。7种溶剂的白骨壤果实提取液显示出一定的自由基清除能力^[3]。黄丽莎等^[1]对白骨壤果实精油化学成分进行了GC-MS分析。高秀梅等^[8]研究发现白骨壤果实的水提物属实际无毒级物质。熊拯等^[9]发现白骨壤种子总黄酮对大豆油有一定的抗氧化效果，且具有量效关系。[本研究切入点]目前国内外主要是对红树植物枝叶部分化学成分进行研究^{[2, 10-14]}，对白骨壤果实缺乏系统充分的药效物质基础研究。[拟解决的关键问题]对白骨壤果实的乙醇提物以及不同极性部位进行抗菌活性检测，研究白骨壤果实对6株致病菌的抑制活性，并应用GC-MS技术对活性部位石油醚相浸膏进行甲酯化后的化学成分分析，为进一步研究白骨壤果实药效物质奠定基础。

白骨壤果实样品于2014年8月采自广西北海，由海南东寨港国家级红树林自然保护区管理局钟荣才副教授鉴定。

5株人体致病菌(指示菌株)：大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、和藤黄八叠球菌(Micrococcus luteus)；1株海洋致病菌：副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)。菌株均为海南师范大学化学化工学院郑彩娟副教授赠送。

LB液体培养基和LB平板：根据文献[15]进行制备。

药品与仪器：甲醇、乙醇、正丁醇、石油醚、乙酸乙酯、二甲基亚砜(DMSO)、氢氧化钾、无水硫酸钠等均为国产分析纯；Thermo Trace GC ultra DSQ Ⅱ色质联用仪(Thermo公司)。

鲜白骨壤果实(1.5 kg)，经95%乙醇(V/V)超声波提取5次，每次30 min，浓缩提取液得浸膏69.0 g，浸膏用水混悬后，分别用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，减压浓缩后得到石油醚相(28.0 g)，乙酸乙酯相(13.0 g)，正丁醇相(17.0 g)，剩余水相蒸干得浸膏(5.5 g)。

初筛采用纸片扩散法(Disk-diffusion method)^[16-17]测试抑菌圈直径(Diameter of inhitition zone，DIZ，mm)。

采用试管稀释法(Tube dilution method)^[18-19]测定初筛有活性的样品的最小杀菌浓度(Minimum bactericidal concentration，MBC，mg/mL)。

取石油醚相浸膏1 g，置于50 mL具塞烧瓶中，加石油醚20 mL使其溶解，加0.4 mol/L KOH-CH₃OH溶液10 mL摇匀，置于40℃恒温水浴1 h，加入20 mL蒸馏水摇匀，静置待分层清晰后取上层清液，经无水硫酸钠脱水，过滤，滤液作为供试品溶液。

Thermo Trace GC ultra DSQ Ⅱ色质联用仪，色谱柱：VF-5MS (30 mm×0.25 mm×0.25 μm)；进样量1.0 μL，溶剂延迟2.00 min；分流比为50:1；载气为高纯He，流速为1.0 mL/min；石油醚相的升温程序：50℃保持2 min，以5℃/min升至130℃，保持5 min，再以5℃/min升至300℃，保持10 min。电离源EI；电子能量70 eV；操作系统：Xcalibur；谱库NIST02。

白骨壤果实5种提取物对指示菌株的抑菌作用表现不同(表 1和表 2)。白骨壤果实乙酸乙酯相对6株指示菌株表现出较好的抑菌活性；石油醚相对金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌和藤黄八叠球菌3株指示菌株表现出一定的抑菌活性；正丁醇相对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌3株指示菌株抑菌活性较弱；乙醇提取物对4株指示菌株表现出一定的抑菌活性；水相对指示菌株没有明显的抑菌活性。由此可见，白骨壤果实乙酸乙酯相的抑菌效果最好，其次是石油醚相。

表 1(Table 1)

表 1 不同提取物的抗菌活性 Table 1 The antimicrobial activity of different extracts against various bacteria 样品 Sample 指示菌株抑菌圈直径DIZ of indicator strain (mm) 金黄色葡萄球菌 S.aureus 副溶血弧菌 V.parahae- molyticus 大肠杆菌 E.coli 蜡状芽孢杆菌 B.cereus 枯草芽孢杆菌 B.subtilis 藤黄八叠球菌 M.luteus 乙醇提取物 Ethanolic extract 7 - 7 7 - 6.5 石油醚相 Petroleum ether fraction 8 - - 8 - 7 乙酸乙酯相 Ethyl acetate fraction 8 8 8 8 7 8 正丁醇相 n-Butanol fraction 7 7 8 - - - 水相Aqueous phase - - - - - - 注：抑菌圈直径以平均值表示，“-”表示无活性 Note:DIZ expresses in average，“-”means no activity

表 1 不同提取物的抗菌活性 Table 1 The antimicrobial activity of different extracts against various bacteria

表 2(Table 2)

表 2 白骨壤果实乙醇提取物及各相的最小杀菌浓度 Table 2 The MBC of different extracts against various bacteria 样品 Sample 指示菌株最小杀菌浓度(MBC, mg/mL) 金黄色葡萄球菌 S.aureus 副溶血弧菌 V.parahae- molyticus 大肠杆菌 E.coli 蜡状芽孢杆菌 B.cereus 枯草芽孢杆菌 B.subtilis 藤黄八叠球菌 M.luteus 乙醇提取物 Ethanolic extract >100 / >100 100 / 100 石油醚相 Petroleum ether fraction 50 / / 50 / 50 乙酸乙酯相 Ethyl acetate fraction 25 50 50 50 50 25 正丁醇相 n-Butanol fraction >100 >100 100 / / / 注：“>100”表示最小杀菌浓度大于100 mg/mL，“/ ”表示未测 Note:“>100” means MBC>100 mg/mL，“/”means not detect

表 2 白骨壤果实乙醇提取物及各相的最小杀菌浓度 Table 2 The MBC of different extracts against various bacteria

在本实验中，利用GC-MS技术探讨石油醚相中抗菌活性物质的组成。对经甲酯化处理后的石油醚相进行GC-MS分析，得到白骨壤果实石油醚相总离子流谱(图 1)，对各峰通过Xcalibur工作站NIST标准质谱图库进行检索，用峰面积归一化法计算出各组分的相对百分含量，共鉴定出19个化合物，占石油醚相总峰面积的77.22%(表 3)。石油醚相中主要为低级性化合物，其中脂肪酸类化合物占总比重的74.06%，主要成分有油酸甲酯(30.30%)、饱和的及不饱和的棕榈酸甲酯(共26.60%)、硬脂酸甲酯(9.30%)、十一酸甲酯(3.75%)和癸酸甲酯(3.06%)等。

图 1 (Fig. 1)

图 1 白骨壤果实石油醚相气质分析总离子流图 Fig.1 GC-MS total ion current figure of petroleum ether extract from the fruits of Avicennia mavina

表 3(Table 3)

表 3 白骨壤果实石油醚相中低极性化合物GC-MS分析 Table 3 GC-MS analysis of low-polar compounds in the petroleum ether fraction from the fruits of A.mavina 序号 No. 保留时间 (RT min) 化合物 Compound 相对质量分数 Relative content (%) 1 18.44 异十六烷2, 2, 4, 4, 6, 8, 8-heptamethyl-nonane 0.18 2 20.49 2-苯基丙烯酸甲酯Methyl 2-phenylprop-2-enoate 0.13 3 22.67 1, 1, 1-三氟-5-甲基-2, 4-二庚酮1, 1, 1-trifluoro-5-methyl-2, 4-henanedione 0.17 4 23.68 癸酸甲酯Decanoic acid methyl ester 3.06 5 24.28 壬二酸二甲酯Nonanedioic acid dimethyl ester 0.13 6 28.27 十一烷酸甲酯Undecanoic acid methyl ester 3.75 7 29.56 1-乙酰基-2, 7-萘二酚1-acetyl-2, 7-naphthalenediol 0.24 8 31.69 14-甲基十五烷酸甲酯14-methyl-pentadecanoic acid methyl ester 0.13 9 32.01 (Z)-十六烯酸甲酯Methyl palmitoleate 1.30 10 32.66 棕榈酸甲酯Methyl hexadecanoate 23.00 11 33.93 11-棕榈烯酸甲酯15-methyl-11-hexadecenoic acid methyl ester 1.30 12 35.03 2-甲基-4-三甲基硅基-1-丁烯-3-炔2-methyl-4-trimethylsilyl-1-buten-3-yne 0.32 13 35.96 反油酸甲酯Methyl trans-9-octadecenoate 30.30 14 36.35 硬脂酸甲酯Methyl stearate 9.30 15 37.30 棕榈酸丁酯Butyl hexadecanoate 1.20 16 38.08 癸酸甲酯Methyl n-caprate 1.50 17 40.67 硬脂酸丁酯Butyl stearate 0.28 18 41.71 三甲基苯氧基硅Trimethyl (phenoxy)-silane 0.82 19 47.34 10-甲基-月桂酸甲酯10-methyl-dodecanoic acid methyl ester 0.11

表 3 白骨壤果实石油醚相中低极性化合物GC-MS分析 Table 3 GC-MS analysis of low-polar compounds in the petroleum ether fraction from the fruits of A.mavina

抗菌实验结果显示，白骨壤果实石油醚相对其中3株菌都有一定的抑制活性，最小杀菌浓度为50 mg/mL。乙酸乙酯相浸膏抗菌活性也较好，有进一步对其做活性物质基础研究的必要性。油醚相甲酯化处理后进行GC-MS分析，共鉴定出19个化合物，为首次从白骨壤果实中鉴定出，其中油酸和棕榈酸占50%以上。石油醚相中鉴定出的油酸可以调节血脂、预防肿瘤、改善记忆等，棕榈酸可以抑制胰岛葡萄糖转运蛋白2、胰岛素、胰腺十二指肠同源异型盒因子1和rRNA的表达，显著改善对胰岛的脂毒性作用^[20]。研究白骨壤果实的营养价值和药理活性，对开发相关产品的高值化利用，提升红树林的经济价值具有重大的现实意义。