大型海藻泛指分布于潮间带及潮下带以下渐深带区域营固着或附着生活的藻类，它们以水体中的植物、建筑物或其他物体及水体底质作为基质，用附着器、基细胞或假根等营固着生活^[1]。大型海藻构成的海藻场的生态功能可与珊瑚礁、红树林、海草床和盐沼湿地等生境媲美，也是蓝碳的重要组成部分^[2]。大型海藻包括红藻门(Rhodophyta)、褐藻门(Phaeophyta)、绿藻门(Chlorophyta)和蓝藻门(Cyanophyta)。我国大型海藻物种数达1 277种，其中红藻门15目40科169属607种(含变种)，褐藻门11目24科62属298种(含变种), 绿藻门11目21科48属211种(含变种)，蓝藻门6目21科57属161种(含变种)^[3]。大型海藻含有丰富的营养成分，我国可供食用的大型海藻有60多种^[1]。大型海藻具有医用价值，多种大型海藻的医疗功能在我国的《神农本草经》《食疗本草》和《本草纲目》中均有记载^[4]。大型海藻在工业上可用于提取褐藻胶、甘露醇、碘、琼脂、卡拉胶等多种工业原料，还可用于纺织印染；在农业领域可作为牲畜及水产动物的优质饲料，如马尾藻科(Sargassaceae)生物被广泛用于喂养猪和鲍鱼，而螺旋藻属(Spirulina)生物则被添加到鱼虾饲料中，以提升其营养价值^[5-6]。大型海藻具有生态价值，海藻生态系统是众多海洋生物的栖息场所；大型海藻能从海水中吸收氮、磷等无机营养盐^[7-11]，对海水水质具有净化效果；此外，大型海藻具有高效的固碳能力，利用其固碳是实现海洋负排放的有效途径之一^[12-15]。蓝碳生态系统包括红树林、海草床、滨海盐沼和海藻场4个生态系统^[16]。在各生态系统的碳储量评估中，红树林的植物碳储量采用异速生长方程评估；海草床、滨海盐沼和海藻场的植物碳储量则是采用元素分析仪对植物含碳量进行分析，进而对碳储量进行评估。而在海藻场碳储量评估工作中发现，部分大型海藻含有无机碳(IC)，因此需要对大型海藻有机碳测定方法进行进一步的探讨。

大型海藻有机碳含量是海藻碳储量评估的重要指标，但国家和相关行业部门尚未出台大型海藻有机碳测定的标准方法。在海藻场碳储量评估工作中，大型海藻有机碳含量主要参考植物有机碳的测定方法。植物有机碳的测定方法主要包括重铬酸钾-硫酸氧化法^[17-19]、元素分析仪法^[20-22]、总有机碳仪法^[23-24]、基于重量计算有机碳的方法^[25-27]、基于分子式计算法以及高频红外碳硫仪法^[28]等。基于重量计算有机碳的方法需要测定植物的含水率、灰分、热值，实验过程比较烦琐。基于分子式计算法是根据纤维素、半纤维素、木质素的组成比例，以及纤维素、半纤维素和木质素中碳元素所占质量比例，从而得到不同树种的含碳量^[27]。重铬酸钾-硫酸氧化法的操作简单，也可达到一定的准确度，如王多伽等^[29]采用重铬酸钾-硫酸氧化法分析植物中有机碳测定过程中不确定的来源，评定该方法的合成不确定度为8.58 g/kg。元素分析仪法测定土壤有机碳时需先加入盐酸去除IC，这种方法与重铬酸钾-硫酸氧化法相比，准确度、精密度更高，但耗材较昂贵^[30-31]。高频红外碳硫仪法测定土壤有机碳时也需要加入盐酸进行前处理，再将有机碳高温氧化成CO₂后测定其含量，该方法稳定、方便、快捷，适合批量测定，但其仪器较为昂贵^[32-33]。李朝英等^[23]采用总有机碳仪摸索测定植物总有机碳的方法，结果表明，进样量在45—55 mg之间，总碳(TC) 含量的精密度与准确性较高, 植物IC含量为0，TC=TOC。TC回收率为101.24%；IC回收率为99.24%。赵旭等^[24]采用总有机碳分析仪测定浙江枸杞岛3门19种大型海藻，其有机碳含量在29.11%—36.85%之间。本研究在植物有机碳测定研究的基础上，探讨总有机碳分析仪法测定大型海藻有机碳含量的测定方法和不确定度的评定，旨在为大型海藻有机碳含量的评估提供技术支撑。

1 材料与方法 1.1 主要仪器设备

总有机碳分析仪(TOC-L-CPH，日本岛津公司)；固体样品模块(SSM-5000A，日本岛津公司)；电子天平[XS205，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]、电热鼓风干燥箱(DHG-9076A，上海精宏实验设备有限公司)。

1.2 实验试剂

有机碳标准物质：水生香蒲(Typha orientalis)中有机碳分析标准物质，编号RMH-D061，厂家为东莞市恒标准物计量研究院有限公司。

主要试剂：葡萄糖(C₆H₁₂O₆，优级纯，上海易恩化学技术有限公司)、无水碳酸钠(Na₂CO₃，基准试剂，天津市科密欧化学试剂有限公司)、磷酸(H₃PO₄，优级纯，西陇科学股份有限公司)、二氧化硅(SiO₂，分析纯，西陇科学股份有限公司)。

1.3 试验原理

样品分别放入高温燃烧腔和低温反应腔：样品在高温燃烧腔中经900 ℃高温燃烧，其中TC被氧化为CO₂；低温反应腔中加入磷酸后，于200 ℃条件下加速IC分解，同样生成CO₂。将两种工况产生的CO₂分别导入非色散红外线检测器(NDIR)，通过光谱定量测定TC含量与IC含量，再由TC减去IC即可得到有机碳含量^[34-36]。

1.4 样品及试剂处理

将采集并经鉴定的大型海藻样品置于白瓷盘中，用纯净水冲洗干净表面泥沙与附着物，随后将样品装入铝箔密封袋并编号，放入电热鼓风干燥箱中，60 ℃恒温烘干48 h至恒重。取出样品静置冷却后，采用研磨机粉碎，过100目筛，备用待测^[2]。

TC标准物葡萄糖经105 ℃烘干2 h后，置于干燥器中冷却保存；IC标准物无水碳酸钠经270 ℃烘干3 h后，放入干燥器中冷却存放^[23]。

1.5 方法 1.5.1 标准曲线

根据《SSM-5000A用户使用手册》要求，样品绝对碳含量不能超过30 mg。葡萄糖碳含量为40%，进样量不能超过75 mg；无水碳酸钠含量为11%，进样量不能超过265 mg。TC标准曲线：称取约5、10、20、40、60、70 mg(以实际称取量为准)的葡萄糖；IC标准曲线：称取约5、10、20、40、80、160 mg(以实际称取量为准)的无水碳酸钠，以绝对碳(mg)为x轴，峰面积为y轴绘制标准曲线。

1.5.2 方法检出限

依据《环境监测 分析方法标准制修订技术导则》(HJ 168—2020)^[37]，按照样品分析流程，精确称取SiO₂样品30—50 mg，依次开展7次TC和IC测定^[38]。

1.5.3 精密度

称取水生香蒲中有机碳分析标准物质[含量为(45±5)%]40—55 mg，连续开展15次重复性测定。

1.5.4 正确度

本研究选取仙掌藻(Halimeda opuntia)、叉节藻(Amphiroa ephedraea)和硬叶马尾藻(Sargassum aquifolium)作为加标对象，各进行3次TC和IC的加标回收实验。TC加标过程中，分别称取10—40 mg仙掌藻、叉节藻、硬叶叶马尾藻，以及10—30 mg葡萄糖，一同置于样品舟中；IC加标过程中，分别称取10—30 mg的仙掌藻、叉节藻、硬叶马尾藻，以及10—40 mg无水碳酸钠，同样置于样品舟中。

1.5.5 大型海藻样品测定

分别称取1.4节中的待测样品40—55 mg，置于样品舟中，记录实际称量质量。根据《SMM-5000A用户使用手册》要求设置仪器参数，依次测定TC和IC，每个样品测定3次，取平均值。

2 结果与分析 2.1 标准曲线及线性范围

由表 1的标准曲线测定结果，可以得到TC的标准曲线y=123.49x-25.829，r²=0.999 2，相对剩余偏差S_Y=0.028；IC的标准曲线y=116.09x-14.347，r²=0.999 8，相对剩余偏差S_Y=0.011，相对标准偏差小于5%，标准曲线合格。

2.2 方法检出限测定

大型海藻有机碳空白实验的标准偏差为0.04%，检出限为0.11%。以检出限的4倍作为分析的检出下限，本实验的检出下限为0.44%(表 2)。

2.3 精密度 2.3.1 实验室内相对标准偏差

经过15次测定水生香蒲有机碳分析标准物质[含量为(45±5)%]，其有机碳平均值为40.87%，标准偏差为0.46%，实验室内相对标准偏差计算结果为1.12%(表 3)。

2.3.2 实验室内95%置信区间

依据《环境监测分析方法标准制修订技术导则》(HJ 168—2020)^[37]所规定的实验室内95%置信区间计算公式$ \bar{x} \pm t_{a} / 2 \frac{s}{\sqrt{n}} $，结合表 3的测试数据进行分析。依据表 3中测试的数据，计算得出，样品测试结果对数的平均值为$\bar{x} $=1.61，自由度为14时的t分布临界值为t_a/2=2.145，样品测定结果对数值的标准偏差s为0.005，双侧95%置信水平下，样品测定次数n为15，$\sqrt{15}=3.873$。据此，实验室内95%置信区间可确定为1.61±0.003。

2.4 正确度 2.4.1 相对误差

依据表 3中测试的数据，对水生香蒲有机碳分析标准物质[含量为(45±5)%]进行15次重复测定。依据《环境监测 分析方法标准制修订技术导则》(HJ 168—2020)^[37]中规定的相对误差计算方法，第i个测试结果的相对误差$ R E_{i}=\frac{\left|\bar{x}_{i}-\mu\right|}{\mu} \times 100 \% $，$ \bar{x}_{i}=40.87, \mu $是15次测试标准物质的含量。$ \overline{R E} $是REi的平均值，计算得出$ \overline{R E}=0.009 $，相对误差的标准偏差$ S_{\overline{R E}}=\sqrt{\frac{\sum_{i=1}^{l}\left(R E_{i}-\overline{R E}\right)^{2}}{l-1}}=0.006 $，最终相对误差值$ \overline{R E} \pm 2 S_{\overline{R E}} $为0.009±0.012。

2.4.2 加标回收率

根据实验结果分析，依据《环境监测 分析方法标准制修订技术导则》(HJ 168—2020)^[37]中的加标回收率最终值$ \bar{P} \pm 2 \bar{S}(\bar{P} $：9次加标回收率的均值；$ \bar{S} $：9次加标回收的标准偏差), TC的回收率介于91.20%—107.89%之间，IC的回收率介于92.33%—102.06%之间，均符合加标回收率90%—110%的容许值标准^[39]。通过对3个样品进行9次加标回收实验，最终测得TC的加标回收率平均值为(97.69±11.88)%，IC的加标回收率平均值为(97.97±5.52)%(表 4)。

2.5 大型海藻样品测定结果

采用总有机碳分析仪法测定11种大型海藻的有机碳，结果见表 5。大型海藻的有机碳之间相差较大，具有钙化性质的大型海藻有机碳含量较低，褐藻门的大型海藻有机碳含量比绿藻门和红藻门高。褐藻门的圈扇藻(Zonaria diesingiana)有机碳含量高达40.43%；绿藻门的仙掌藻有机碳含量最低，仅为7.32%。具有钙化性质的大型海藻[仙掌藻、环蠕藻(Neomeris annulata)、叉节藻、宽珊藻(Mastophora rosea)]有机碳含量比未钙化的大型海藻低，其IC含量在7.60%—10.25%之间。

2.6 方法不确定度评定

总有机碳分析仪法测定大型海藻有机碳含量的公式^[40]如下:

$ P_{\mathrm{TOC}}=P_{\mathrm{TC}}-P_{\mathrm{IC}}, $

式中, P_TOC表示样品中总有机碳的含量，单位为%；P_TC表示样品中TC的含量，单位为%；P_IC表示样品中IC的含量，单位为%。

测定不确定度公式^[40]：

$ \begin{aligned} & \frac{u\left[P_{\mathrm{TOC}}\right]}{P_{\mathrm{TOC}}}= \\ & \sqrt{\left[\frac{u\left[P_{\mathrm{TC}}\right]}{P_{\mathrm{TC}}}\right]^{2}+\left[\frac{u\left[P_{\mathrm{IC}}\right]}{P_{\mathrm{IC}}}\right]^{2}}, \end{aligned} $

式中, u[P_TOC]表示总有机碳的标准测量不确定度；u[P_TC]表示TC的标准测量不确定度；u[P_IC]表示IC的标准测量不确定度。

选取叉节藻进行7次重复测定，测定结果见表 6。

2.6.1 TC不确定度分量评定

在测量不确定度的评定中，TC标准不确定度主要由以下几个部分组成：(1)样品在进行n次测量过程中产生的相对不确定度u₁；(2)TC工作曲线拟合过程中引入的相对不确定度u₂^[41]；(3)电子天平称量过程中产生的相对不确定度u₃；(4)仪器本身所引入的相对不确定度u₄。

(1) u₁。对红藻门的叉节藻进行了7次测定，分析结果的标准偏差S为1.017，所以叉节藻TC测定7次产生的不确定度：

$u=\frac{S}{\sqrt{n}}=\frac{1.017}{\sqrt{7}}=0.384, $

式中，S表示TC分析结果的标准偏差，n是测定次数，n=7。样品测量过程中产生的相对标准不确定度$u_{1}=\frac{u}{\bar{x}}=\frac{0.384}{28.11}=0.014$，其中$\bar{x} $表示TC测定7次的平均值28.11。

(2) u₂。TC拟合的二元一次方程为y=123.49x-25.829，b=123.49，r=0.999 5。标准曲线残差标准差：

$ S_{R}=\sqrt{\frac{\sum\limits_{i=1}^{n}\left[y_{i}-y_{i f}\right]^{2}}{n-2}}=41.25, $

式中，y_i表示不同浓度对应的峰面积；y_if表示回归曲线计算的峰面积；n是标准系列的点数，n=7；p是拟合曲线差数的个数，p=1。

工作曲线的相对标准不确定度：

$\quad \quad u(a)=\frac{S_{R}}{b} \sqrt{\frac{1}{p}+\frac{1}{n}+\frac{(\bar{c}-\bar{x})^{2}}{\sum\left(c_{i}-\bar{c}\right)^{2}}}= \\ 0.267 \%, $

式中，b是标准曲线的斜率，b=123.49；n是标准系列的点数，n=7；p是测定样品次数，p=7；$\bar{c}$是标准系列平均值，$\bar{c}$=11.944；c_i是标准系列各浓度值；$\bar{x}$是叉节藻TC测定7次的平均值，$\bar{x}$=28.11；则标准曲线拟合引入的相对不确定度$u_{2}=\frac{u(a)}{\bar{x}}=\frac{0.267}{28.11}= 0.009$%。

(3) u₃。电子天平引入的标准不确定度主要包括测量重复性u₃(p1)、电子天平的分辨率u₃(p2)和标准砝码的标准值导致的不确定度分量u₃(m)^[42]。①所使用电子天平经检定为Ⅰ级，测量重复性引起的标准不确定度u₃(p1)按照A级评定的方法，采用200 g的标准砝码进行7次测量得到的数值分别为199.999 6、199.999 5、199.999 7、199.999 8、199.999 7、199.999 8、199.999 8 g，其平均值为199.999 7 g。采用贝塞尔公式计算剩余标准偏差$S_{R}=\sqrt{\frac{\sum_{i=1}^{n}\left[x_{i}-\bar{x}\right]^{2}}{n-1}}=0.108 \mathrm{mg}(n=7) $，则测量重复性相对不确定度$u_{3}(p 1)=0.108 / \sqrt{7}=0.041 $mg。②电子天平的分辨率引起的标准不确定度u₃(p2)，属于B级评定, 该天平的实际分度值d=0.1 mg，取包含因子$ k=\sqrt{3}$, 则相对不确定度$u_{3}(p 2)=\frac{d / 2}{\sqrt{3}}= 0.029 $ mg，输入量p的相对标准度不确定度$u_{3}(p)= \sqrt{u_{3}(p 1)^{2}+u_{3}(p 2)^{2}}=\sqrt{0.041^{2}+0.029^{2}}=0.050 $mg。③标准砝码的标准值引入的标准不确定度u₃(m)，根据总有机碳分析仪《检定证书》给出的天平的最大允许误差MPE=±0.05 mg，属于B级评定，按矩形分布，包含因子$k=\sqrt{3} $，则输入量m的相对标准不确定度$u_{3}(m)=\frac{0.05}{\sqrt{3}}=0.029 $mg。电子天平合成不确定度$ u_{3}=\sqrt{u_{3}(p)^{2}+u_{3}(m)^{2}}= \sqrt{0.050^{2}+0.029^{2}}=0.058 \%$。

(4) u₄。根据总有机碳分析仪《检定证书》中给出的扩展不确定度U=3%，k=2，计算标准不确定度为u₄=3%/2=0.015。

TC各个分量的合成相对标准不确定度：

$\frac{u\left[P_{\mathrm{TC}}\right]}{p_{\mathrm{TC}}}=\sqrt{u_{1}^{2}+u_{2}^{2}+u_{3}^{2}+u_{4}^{2}}= \\ \sqrt{0.014^{2}+0.009^{2}+0.058^{2}+0.015^{2}}=0.062 \% 。$

2.6.2 IC不确定度分量评定

同理，IC标准不确定度分量由4个部分组成。

(1) u₁。对红藻门的叉节藻进行7次测定，分析结果的标准偏差为S=0.141，所以叉节藻IC测定7次产生的不确定度$u=\frac{S}{\sqrt{n}}=\frac{0.141}{\sqrt{7}}=0.053$，相对标准不确定度$u_{1}=\frac{u}{x}=\frac{0.053}{7.60}=0.007$。

(2) u₂。IC拟合的二元一次方程为y=115.96x-12.333，b=115.96，r=0.999 8。标准曲线残差标准差S_R=57.997。

工作曲线的相对标准不确定度：

$u=\frac{S_{R}}{b} \sqrt{\frac{1}{p}+\frac{1}{n}+\frac{(\bar{c}-\bar{x})^{2}}{\sum\left(c_{i}-\bar{c}\right)^{2}}}=0.303, $

式中，b是标准曲线的斜率，b=115.96；n是标准系列的点数, n=7；p是测定样品次数, p=7；$\bar{c}$是标准系列平均值, $\bar{c}$=5.322；c_i是标准系列各浓度值；$\bar{x}$是叉节藻7次测定IC的平均值, $\bar{x}$=7.596；则标准曲线拟合引入的相对不确定度$u_{2}=\frac{u(a)}{\bar{x}}=\frac{0.303}{7.596}= 0.040 \% $。

(3) u₃。电子天平合成不确定度$u_{3}= \sqrt{u_{3}(p)^{2}+u_{3}(m)^{2}}=\sqrt{0.050^{2}+0.029^{2}}= 0.058 \% $。

(4) u₄。根据总有机碳分析仪《检定证书》中给出的扩展不确定度U=3%，k=2，计算标准不确定度为u₄=3%/2=0.015%。

IC各个分量的合成相对标准不确定度：

$ \begin{array}{r} \frac{u\left[P_{\mathrm{IC}}\right]}{p_{\mathrm{IC}}}=\sqrt{u_{1}^{2}+u_{2}^{2}+u_{3}^{2}+u_{4}^{2}}= \\ \sqrt{0.007^{2}+0.040^{2}+0.058^{2}+0.015^{2}}=0.072 \% \end{array} $

2.6.3 TOC相对合成标准不确定度评定

$ \begin{aligned} & \quad \frac{u\left[P_{\mathrm{TOC}}\right]}{P_{\mathrm{TOC}}}= \\ & \sqrt{\left[\frac{u\left[P_{\mathrm{TC}}\right]}{P_{\mathrm{TC}}}\right]^{2}+\left[\frac{u\left[P_{\mathrm{IC}}\right]}{P_{\mathrm{IC}}}\right]^{2}}=\sqrt{0.062^{2}+0.072^{2}}= \end{aligned} $

0.095，则u[P_TOC]=0.095×20.52%=1.95%。

2.6.4 拓展不确定度分析评定

取包含因子k=2，置信区间为95%，则扩展不确定度U=k×u[P_TOC]=2×1.95%=3.90%。

3 讨论

基于重量计算TOC的方法、基于分子式计算法均不适用于大型海藻有机碳测定，重铬酸钾-硫酸氧化法测定植物有机碳的方法，误差一般为(±2%)-(±4%)^[28]，且重铬酸钾-硫酸氧化法不适用于样品有机碳含量大于15%的样品^[43]。元素分析仪法的重复性相对标准偏差不超过2.3%，再现性相对标准偏差不超过4.6%，但其测定含有IC的样品时，需要加入盐酸去除IC后进行测定，过程比较繁琐，且耗材较昂贵。高频红外碳硫仪法目前仅在土壤有机碳和金属碳含量测定中应用^[44-48]，尚未有采用该方法测定植物有机碳的研究，该方法是否适用于植物有机碳的测定有待进一步探讨。而本研究采用的总有机碳分析仪法测定大型海藻有机碳，可直接得到大型海藻TC与IC的含量，方法可行，具有较高的精密度和正确性，但仍存在一定的局限性。总有机碳分析仪法测定大型海藻TOC过程中，需要注意以下3点：(1)该方法对于样品的前处理要求较高，需要严格控制样品的清洗、干燥、研磨和称量等步骤，以避免泥沙、附着生物等对测定结果的影响。(2)由于大型海藻没有明显的根茎叶的分化，因此前处理时取整株大型海藻进行干燥研磨，样品需要过100目筛保证样品的均匀性。(3)耗时较长，上机测定一个样品需要15 min左右。

本研究测定的11种大型海藻样品有机碳含量在7.32%—40.43%之间，与赵旭等^[24]的研究中测定的19种大型海藻有机碳中褐藻门网地藻(Dictyota dichotoma)和铜藻(Sargassum horneri)的测定结果基本一致，与其大型海藻3门中褐藻门有机碳平均含量最高的结论一致。由于红藻门和绿藻门有部分海藻具有钙化性质，许红等^[49]论述了9属43种不同种群钙藻的化学埋藏学和造礁作用的特征、类型和模式。同时，钙化类的大型海藻是一种重要的沉积物生产者，是海洋环境碳酸盐沉积物的重要组成部分^[50]。总有机碳分析仪法测定大型海藻有机碳的优势在于该方法能同时测定大型海藻的TC和IC，而IC的含量是造礁藻类碳酸盐生产力估算的一个重要参数。

4 结论

(1) 本方法检出限为0.11%，检出下限为0.44%。总有机碳分析仪法测定大型海藻有机碳的实验室内相对标准偏差为1.12%，95%置信区间为1.61±0.003，相对误差最终值为0.009±0.012，TC的加标回收率最终值为(97.69±11.88)%，IC的加标回收率最终值为(97.97±5.52)%。

(2) 本方法TC的合成标准不确定度为0.062，IC的合成标准不确定度为0.072，TOC的测量不确定度为0.095。置信区间为95%，k=2，扩展不确定度为3.90%。