2. 南宁学院食品与质量工程学院，广西南宁 530200
2. College of Food and Quality Engineering, Nanning University, Nanning, Guangxi, 530200, China
氟在医药、农业和材料等领域不可或缺。氟的非极化性可形成强烈的静电相互作用，产生吸引或排斥效应[1]。此外，氟还可以改变邻基的pKa、亲和性、偶极矩、稳定性、亲脂性和生物利用度[2]。因此，掺杂氟的靶化合物活性更高、稳定性更强、半衰期更长和生物可吸收性更佳。含氟原子的药物已占到所有药物的1/4，然而，在估计超13万种具有结构特征的天然产物中，迄今为止仅发现5种独特的有机氟代谢物[3]，这极大地限制了含氟化合物的实际应用。虽然化学合成含氟化合物已成为现代社会的重要选择，但是通过亲核氟化反应形成的C-F键进展缓慢[4]。如何选择性地将氟引入结构多样的天然产物中，仍是代谢工程领域亟待解决的问题之一。
自然界中氟化酶极为罕见，目前发现的天然氟化酶主要来源于链霉菌属(Streptomyces)、诺卡氏菌属(Nocardia)、放线菌属(Actinomyces)、放线多孢菌属(Actinopolyspora)和芽孢杆菌属(Bacillus)等微生物[2, 5]。氟化酶的动力学性质已在体外完成表征，但其生物技术开发仍面临限制，主要是因为氟离子或部分有机氟在微生物宿主中具有毒性，以及氟化酶缓慢的动力学特性[6]。在海洋放线菌热带盐水孢菌(Salinispora tropica)中异源表达氟化酶基因，可合成抗癌药物氟盐孢酰胺，但重组菌株对氟离子高度敏感，即使在极低浓度下也仍会表现出强烈的生长抑制作用[7]。因此，筛选高耐氟菌株尤为重要。
红树林沉积物具有强酸性、强还原性、高营养和高盐度等特点[8]，其独特或极端的生态系统孕育着多样性丰富的微生物[8-9]。极端微生物的生理特性差异可形成独特的代谢途径，进而产生具有显著化学多样性和重要生物活性的次生代谢产物[10]。目前，红树林沉积物微生物来源的天然产物类型主要有生物碱、内酯、醌类、类黄酮、萜类、类固醇，其中70%的天然产物具有广泛的药理活性，包括细胞毒性、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎、抗寄生虫等[10-11]，说明红树林沉积物来源的微生物是天然产物多样性的丰富储存库，可用于开发新的抗生素或药物[12]。
我国海南、广西、广东和福建等地分布有丰富的红树林资源，前期研究表明，海南东寨港红树林植物和沉积物中蕴藏着种类丰富、活性多样且具有潜在药用价值的真菌资源[13]。而目前对该保护区沉积物中氟耐受细菌的研究鲜见报道。因此，本研究选取海南东寨港国家级自然保护区的沉积物作为研究对象，分析沉积物中氟耐受细菌的多样性并筛选出高耐氟细菌，为后续寻找具有生物合成氟化抗生素能力的工程菌株奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品采集在海南东寨港国家级自然保护区设置3个采样点，分别为保护区的入口(采样点1)、中间地带(采样点2)和尽头(采样点3)，距离间隔2—3 km，每个采样点设置3个采样深度，分别为0—5、5—10、10—15 cm，共9个沉积物样品。利用工具铲分别取50 g的沉积物，密封在干净的样品袋中，立即置于冰盒中4 ℃冷藏保存，带回实验室。所有的采样工具均严格消毒。
1.1.2 培养基高氏1号液体培养基：可溶性淀粉20.0 g，KNO3 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，H2O 1 000 mL，pH值7.0。高氏1号固体培养基则是在液体培养基的基础上多加2%的琼脂粉。
LB液体培养基：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 10.0 g，H2O 1 000 mL。
1.2 方法 1.2.1 氟耐受细菌的分离纯化将1.0 g沉积物加入9.0 mL无菌水制成样品原液，梯度稀释成10-2和10-3样液，分别吸取200 μL样液均匀涂布于含0.084 g NaF的高氏1号固体培养基上[14]，28 ℃培养14—21 d。挑取形态特征不同的单菌落进行三区划线纯化，并将已纯化菌株保存于含30%甘油的高氏1号液体培养基中，冻存管保藏于-80 ℃冰箱中。
1.2.2 16S rRNA基因测序和系统发育分析Chelex-100树脂用于提取细菌DNA[15]，参照李菲等[16]的方法使用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1522R(5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)对DNA进行PCR扩增。通过琼脂糖凝胶电泳检验PCR扩增片段，将扩增合格的产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。序列经过软件SeqMan拼接后，通过EzBioCloud数据库(https://wwwezbiocloud.net/)搜索，选择同源性最高菌株的16S rRNA基因序列作为参比对象，通过MEGA 7.0软件应用邻接法(Neighbor-Joining，N-J)构建系统发育进化树，自展值(Bootstrap value)为1 000次，检测各分支置信值，以分析各菌株的系统发育地位[17]。
1.2.3 高耐氟细菌的筛选初筛：将氟耐受细菌划线接种于含不同浓度NaF(50、100、150、200 mmol/L)的高氏1号固体培养基上，28 ℃恒温培养7 d，观察菌株是否能生长。
复筛：将初筛得到的菌株分别接种于含200 mmol/L NaF的LB液体培养基中，28 ℃恒温培养，连续7 d测定600 nm处的光密度(OD600)，并监测菌株的生长情况，以革兰氏阴性菌大肠杆菌(Escherichia coli)和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)作为对照。
1.2.4 crcB基因扩增以Agrobacterium salinitolerans CFBP5507菌株(GenBank登录号：CP109968.1)的crcB基因编码区(Coding Sequence, CDS)为模板设计特异性引物：crcB-F(5′-ATGATCAATATCGCCCTTGTCG-3′)和crcB-R(5′-TTAGAACAAACTGCGGCCCAA-3′)。利用该引物从高耐氟细菌中扩增crcB基因的CDS片段。PCR反应在基因扩增仪[Biometra TAdvanced 96 SG，耶拿分析仪器(北京)有限公司]中进行，PCR扩增条件如下：预变性95 ℃ 7 min；变性95 ℃ 30 s，退火50 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 1.5 min，共32个循环；终延伸72 ℃ 7 min。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离。
1.2.5 蛋白电泳按照Chouhan等[18]的方法稍作修改对菌株进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。将菌株分别接种于含0、150 mmol/L NaF的LB液体培养基中，28 ℃下振荡培养7 d。取菌液以10 000 r/min离心10 min收集菌体，将菌体悬浮于1.0 mL PBS缓冲液中。随后在冰浴条件下，使用VCD-500超声波细胞破碎仪对菌体进行超声破碎，获得蛋白样液。加上样缓冲液混匀后在水浴中煮沸10 min，制备蛋白质样品。将15 μL的样品连同蛋白Marker上样到12% SDS-PAGE凝胶上，先在90 V下进行电泳，直到样品穿过浓缩胶，然后将电压增加至110 V，直至染料前端到达12% SDS-PAGE凝胶的底部，将凝胶从板上取下，用考马斯亮蓝R250染色30 min，用脱色液(V醋酸∶V甲醇∶V水=10∶30∶60)脱色2—3次，直至染色条带清晰可见。
2 结果与分析 2.1 氟耐受细菌多样性分析从沉积物样品中共分离得到42株纯化氟耐受细菌。16S rRNA基因序列分析结果显示，共获得22种氟耐受细菌，隶属于3门5纲9目12科18属(图 1和表 1)。芽孢杆菌目(Bacillales)为优势菌目，包括芽孢杆菌科(Bacillaceae)和类芽孢杆菌科(Paenibacillaceae)，细菌种数为7种，占所获得细菌种数的31.8%；其次是伯克氏菌目(Burkholderiales)和根瘤菌目(Rhizobiales)，细菌种数均为3种，占所获得细菌种数的13.6%(表 1)。
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| 图 1 红树林沉积物氟耐受细菌的16S rRNA基因序列系统发育进化树 Fig. 1 Phylogenetic tree of fluoride-tolerant bacteria from mangrove sediments based on 16S rRNA gene sequences |
| 目 Order |
科 Family |
属 Genus |
种数 Number of species |
| Cellulomonadales | Promicromonosporaceae | Cellulosimicrobium | 2 |
| Microbacteriales | Microbacteriaceae | Agromyces | 1 |
| Mycobacteriales | Nocardiaceae | Rhodococcus | 1 |
| Bacillales | Bacillaceae | Ectobacillus | 1 |
| Robertmurraya | 1 | ||
| Priestia | 2 | ||
| Paenibacillaceae | Cohnella | 1 | |
| Paenibacillus | 2 | ||
| Rhodobacterales | Rhodobacteraceae | Paracoccus | 1 |
| Burkholderiales | Alcaligenaceae | Achromobacter | 1 |
| Comamonadaceae | Comamonas | 1 | |
| Delftia | 1 | ||
| Rhizobiales | Rhizobiaceae | Agrobacterium | 1 |
| Peteryoungia | 1 | ||
| Brucellaceae | Brucella | 1 | |
| Pseudomonadales | Pseudomonadaceae | Pseudomonas | 2 |
| Lysobacterales | Lysobacteraceae | Pseudoxanthomonas | 1 |
| Stenotrophomonas | 1 |
2.2 高耐氟细菌筛选
将获得的22株氟耐受细菌划线接种于含不同浓度NaF的高氏1号固体培养基上(图 2)，从中获得14株耐受50 mmol/L NaF的细菌。其中，有5株细菌耐受200 mmol/L NaF，分别为Agrobacterium salinitolerans 3-2-2 3、Pseudoxanthomonas japonensis 6-1-1 3、Stenotrophomonas maltophilia 7-1-2 1、Priestia aryabhattai 6-1-1 2和Priestia megaterium 6-1-2 3，除Stenotrophomonas maltophilia 7-1-2 1外，另外4株均来源于采样深度为10—15 cm的沉积物，其中有3株来源于采样点2(表 2)。
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| 图 2 氟耐受细菌在含50 mmol/L NaF的高氏1号固体培养基上的生长情况 Fig. 2 Growth status of fluoride-tolerant bacteria on Gauze′s No.1 solid medium with 50 mmol/L NaF |
| 采样点 Sampling point |
深度/cm Depth/cm |
菌株 Strain |
NaF浓度/(mmol/L) Concentration of NaF/(mmol/L) |
|||
| 50 | 100 | 150 | 200 | |||
| 1 | 0—5 | Paenibacillus sinensis 1-1-1 1 | - | - | - | - |
| Cellulosimicrobium cellulans 1-1-2 3 | + | - | - | - | ||
| Paracoccus versutus 1-1-2 1 | - | - | - | - | ||
| Ectobacillus funiculus 1-2-1 1 | - | - | - | - | ||
| Comamonas aquatica 1-2-1 4 | + | - | - | - | ||
| 5—10 | Achromobacter ruhlandii 2-1-1 1 | + | - | - | - | |
| Cellulosimicrobium funkei 2-2-2 1 | + | - | - | - | ||
| Paenibacillus typhae 2-2-2 2 | - | - | - | - | ||
| 10—15 | Delftia tsuruhatensis 3-2-2 1 | + | + | + | - | |
| Agrobacterium salinitolerans 3-2-2 3 | + | + | + | + | ||
| 2 | 0—5 | Pseudomonas mendocina 4-1-1 1 | - | - | - | - |
| Agromyces indicus 4-2-1 1 | - | - | - | - | ||
| 5—10 | Rhodococcus ruber 5-1-1 3 | + | - | - | - | |
| Robertmurraya beringensis 5-2-1 1 | - | - | - | - | ||
| 10—15 | Priestia aryabhattai 6-1-1 2 | + | w | w | w | |
| Pseudoxanthomonas japonensis 6-1-1 3 | + | + | + | + | ||
| Priestia megaterium 6-1-2 3 | + | w | w | w | ||
| 3 | 0—5 | Brucella intermedia 7-1-1 1 | + | + | - | - |
| Stenotrophomonas maltophilia 7-1-2 1 | + | + | + | + | ||
| 5—10 | Pseudomonas sediminis 8-1-1 1 | + | - | - | - | |
| 10—15 | Rhizobium rosettiformans 9-1-1 2 | - | - | - | - | |
| Cohnella ferri 9-2-1 1 | + | - | - | - | ||
| Note: + indicates good growth; w indicates weak growth; - indicates no growth. | ||||||
通过监测菌株的生长情况，对5株耐受200 mmol/L NaF的细菌进行复筛，结果如图 3所示。在含200 mmol/L NaF的LB液体培养基中，除菌株Agrobacterium salinitolerans 3-2-2 3生长良好且在第2天达到生长稳定期外，革兰氏阴性菌大肠杆菌、革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和另外4株细菌均生长缓慢。综上，成功获得一株生长良好的高耐氟细菌，用于后续实验研究。
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| 图 3 菌株在含200 mmol/L NaF的LB液体培养基中的生长曲线 Fig. 3 Growth curves of strains in LB liquid medium with 200 mmol/L NaF |
2.3 crcB基因验证及蛋白电泳
从菌株Agrobacterium salinitolerans 3-2-2 3中成功扩增出378 bp的PCR产物(图 4)。高耐氟菌株Agrobacterium salinitolerans 3-2-2 3在含150 mmol/L NaF的LB液体培养基中生长后，在32 kDa区域额外表达出两条蛋白条带，与不含氟条件下的单一蛋白条带形成显著对比(图 5)。
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| 图 4 利用基因特异性引物扩增氟耐受基因crcB Fig. 4 Fluoride resistance gene crcB amplification using gene specific primers |
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| 图 5 菌株Agrobacterium salinitolerans 3-2-2 3在含氟和不含氟培养基上生长的蛋白条带 Fig. 5 Protein band of strain Agrobacterium salinitolerans 3-2-2 3 grown on the medium with and without fluoride |
3 讨论
约25%的药物分子含有氟原子[6]。在药物开发过程中，氟原子通常通过化学修饰引入，以改善药代动力学特性，从而提高生物利用度。然而，氟对微生物宿主具有潜在毒性作用，目前将氟代谢物整合至活细胞的生物化学方法仍较为有限。因此，需筛选高耐氟菌株，以发掘能够生物合成含氟抗生素的微生物，从而拓展基于生物合成的有机氟生产途径。红树林沉积物衍生的微生物多样性丰富，可作为高耐氟菌株筛选的潜在资源库。
本研究从海南东寨港国家级自然保护区的沉积物中共分离得到22种氟耐受细菌，隶属于3门5纲9目12科18属。3门分别为放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)，这与已有红树林沉积物细菌多样性的研究结果一致。例如，Haldar等[19]采用16S rDNA扩增测序对Mandovi和Zuari红树林沉积物中细菌的多样性进行比较，发现这3个门均为两地红树林沉积物的优势类群。除假单胞菌属(Pseudomonas)同时存在于两个采样点外，其余菌属均仅从单个采样点分离获得，表明研究区沉积物中的氟耐受细菌多样性丰富，且不同样品之间存在明显差异。
经高耐氟细菌筛选，共获得5株耐受200 mmol/L NaF的细菌，分别来源于3个采样点。除Stenotrophomonas maltophilia 7-1-2 1外，Agrobacterium salinitolerans 3-2-2 3、Pseudoxanthomonas japonensis 6-1-1 3、Priestia aryabhattai 6-1-1 2和Priestia megaterium 6-1-2 3均分离自10—15 cm的沉积物，其中有3株细菌均来源于采样点2。这5株高耐氟细菌隶属于厚壁菌门和变形菌门，分属于农杆菌属(Agrobacterium)、普里斯特氏菌属(Priestia)、假黄色单胞菌属(Pseudoxanthomonas)和寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)，说明海南东寨港国家级自然保护区不同区域沉积物中的高耐氟细菌差异明显。
crcB模块是一种广泛分布于细菌和古细菌中的非编码RNA结构，其序列包含保守区段，已被鉴定为一类氟化物响应的核糖开关。crcB模块RNA位于编码多种功能蛋白质基因的上游，推测对这些基因具有调控作用。其中，一部分基因产物被注释为离子转运体(例如氯离子、钠离子、质子相关转运体)，另一部分则参与多种生理过程(如普遍应激适应、DNA修复)或代谢过程(如烯醇化酶、甲酸氢裂解酶相关反应)[20]。当菌体自然暴露于有毒的氟化物时，许多物种会通过氟化物响应的RNA调控蛋白质表达，以减轻氟离子的有害影响[21]。这种对氟离子特异性识别的能力得益于氟离子的半径小于其他卤族离子[22]。本研究通过监测细菌在200 mmol/L NaF胁迫下的生长曲线，筛选得到一株生长良好的高耐氟细菌Agrobacterium salinitolerans 3-2-2 3，并利用特异性引物扩增验证了其携带氟耐受基因crcB。已有研究表明，crcB基因对细菌氟耐受能力具有关键作用。Calero等[6]研究表明，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)在含75 mmol/L NaF的培养基中生长良好，但当ΔcrcB突变体在氟离子浓度从0.1 mmol/L微增至0.5 mmol/L时，生长即被完全抑制；而在同等浓度NaCl的情况下重复实验，未检测到生长抑制效应。这表明crcB基因是一种选择性的氟离子转运蛋白调控因子，对细菌在氟离子暴露条件下的存活至关重要。据此推测，本研究分离出的菌株Agrobacterium salinitolerans 3-2-2 3所携带的crcB基因可能在其高耐氟特性中发挥着类似的关键作用。
许多植物和细菌能够分泌一类被称为离子载体的高亲和力阴离子结合物，这些结合物可特异性结合环境中特定化学形态的阴离子[23]。在氟化物胁迫条件下，细菌可以通过分泌离子载体与特定形式的氟离子结合，并通过蛋白通道将其转运至细菌体内[24]。本研究中高耐氟细菌Agrobacterium salinitolerans 3-2-2 3在氟化物存在下能额外表达出两条蛋白条带，推测其可能作为离子载体参与氟离子的响应与转运。类似现象在已有研究中亦有报道。Chouhan等[18]研究发现，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)在氟化物诱导下额外表达了3条蛋白条带(分子量分别为20、22、25 kDa)，同时该菌株可将培养基中氟化物浓度降低22.1%，提示细胞内表达离子载体的细菌具备有效去除氟化物的能力。上述结果表明，氟化物胁迫可诱导细菌表达特定蛋白，进而调控其对氟离子的转运与积累。因此，深入解析氟化物对细菌生理功能的调控作用，不仅能揭示微生物解毒的多重机制，也为利用微生物工程实现氟元素向有机氟化合物的转化奠定了理论基础，在有机氟的生物合成与代谢工程中具有重要应用前景。然而，氟化物对Agrobacterium salinitolerans 3-2-2 3生理代谢的具体影响仍需进一步探究。
4 结论本研究结果显示，从海南东寨港国家级自然保护区的沉积物中共分离得到22种氟耐受细菌，并成功筛选出一株高耐氟细菌Agrobacterium salinitolerans 3-2-2 3，该菌株在200 mmol/L NaF条件下仍生长良好。基因特异性PCR分析证实了该菌株携带氟耐受基因crcB。蛋白电泳结果显示，该菌株在氟离子诱导下产生了新的蛋白电泳条带。综上，该菌株具有良好的高耐氟能力，可作为后续研究细菌氟耐受机制及含氟代谢产物的模式菌株。
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