2. 广西农业职业技术大学食品药品研究院，广西南宁 530007;
3. 广西大学机械工程学院，广西南宁 530004
2. Institute of Food & Pharmaceutical Science, Guangxi Vocational University of Agriculture, Nanning, Guangxi, 530007, China;
3. School of Mechanical Engineering, Guangxi University, Nanning, Guangxi, 530004, China
平陆运河是中国西部地区陆海新通道骨干工程，对全国水网建设、广西乃至西南地区的经济格局调整具有重大意义[1]。在开挖建设平陆运河的过程中产生大量工程渣土，据统计，运河全线的工程渣土开挖量约3.39×108 m3，如何快速消纳这些工程渣土且不影响生态环境是一个前所未有的挑战，抬填造地并进行复垦是对平陆运河工程渣土资源化利用的途径之一[1]。然而，平陆运河工程渣土主要是砂岩、砂卵砾石等岩石碎屑[1]，泥土较少且主要是贫瘠的黏土，工程渣土平整得到的土地仅在最上面覆盖一层薄薄的剥离表土，底部全是砂石，存在孔隙大、土壤贫瘠、肥水流失严重以及土壤易板结等问题，复垦种植作物难度大。
聚谷氨酸(Poly-γ-Glutamic Acid，γ-PGA)是一种由谷氨酸单体通过γ-酰胺键连接而成的天然高分子聚合物，具有优异的生物可降解性、超强的吸水性以及良好的吸附性，对土壤的物理、化学以及生物等特性均具有较好的调控作用[2-3]。γ-PGA通过调控土壤物理特性来增加水稳性大团聚体的数量和稳定性，促进土壤团粒结构的形成，有利于改进砂性土壤的蓬松度和黏性土壤的孔隙度[4-5]，减少土壤板结，而平陆运河的工程渣土正是具有这两种土壤性质。γ-PGA还可以作为土壤保水剂减缓土壤水分下渗，降低土壤入渗能力，提高土壤持水保水性能[6-7]，而平陆运河工程渣土所造之地特别需要提高持水保水的能力。γ-PGA对土壤化学特性的调控，可以螯合或吸附土壤和水环境中的重金属阳离子从而改善水土环境质量[8-9]，增强土壤对氮的吸附能力进而减少砂质土壤中的氮素流失[10]，这对改善平陆运河工程渣土所造之地的保肥能力是有利的。γ-PGA通过调控土壤生物特性，驱动根际细菌群落组成变化，从而富集有益微生物，提高作物对营养的吸收，促进作物生长[11]。此外，γ-PGA还可以诱导作物根系生长素的分泌和积累，促进生长素和生长素反应基因的合成和积累，从而促进作物的生长发育和养分吸收[12]。总而言之，γ-PGA具有改善土壤特性，提高土壤的持水保肥能力以及促进农作物生长等性能，在平陆运河工程渣土复垦中具有应用的潜力。
目前针对平陆运河工程渣土复垦应用的产γ-PGA菌株的研究较少。全基因组测序技术可以快速、深入地了解菌株的代谢机理和功能作用，更好地指导微生物的开发和应用，为农业功能菌株的发展贡献新的种质资源。本研究针对平陆运河工程渣土复垦的应用需求，筛选产γ-PGA菌株并对其进行鉴定，分析其对作物促生功能的潜力，探究其基因组的组成与功能，旨在为产γ-PGA菌株在平陆运河工程渣土复垦中进一步推广应用提供参考。
1 材料与方法 1.1 材料试验样品来自吉林省田野泉酿造有限公司的自然发酵大豆酱。
试验所用6种培养基配方如下。产γ-PGA菌株筛选培养基(亚甲基蓝培养基)：葡萄糖10 g/L、酵母粉5 g/L、谷氨酸钠5 g/L、磷酸氢二钾0.5 g/L、磷酸二氢钾0.5 g/L、七水硫酸镁0.1 g/L、亚甲基蓝0.04 g/L、琼脂15 g/L。LB培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化钠10 g/L，固体培养基再加入琼脂粉15 g/L。无氮固体培养基：甘露醇10 g/L、磷酸二氢钾0.2 g/L、七水硫酸镁0.2 g/L、氯化钠0.2 g/L、二水硫酸钙0.2 g/L、碳酸钙5 g/L、琼脂15 g/L。解磷培养基：葡萄糖10 g/L、硫酸铵0.5 g/L、酵母粉0.5 g/L、氯化钠0.3 g/L、氯化钾0.3 g/L、七水硫酸镁0.3 g/L、硫酸亚铁0.03 g/L、硫酸锰0.03 g/L、磷酸钙5 g/L、琼脂15 g/L。色氨酸培养基：甘油10 g/L、胰蛋白胨10 g/L、色氨酸10 g/L、磷酸氢二钾1.5 g/L、氯化钙1.5 g/L。摇瓶发酵培养基：葡萄糖10 g/L、酵母粉5 g/L、谷氨酸钠35 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、磷酸二氢钾2 g/L、七水硫酸镁0.1 g/L。
1.2 方法 1.2.1 产γ-PGA菌株的分离与鉴定称取2 g样品于装有8 mL无菌水的玻璃直行瓶中，置于85 ℃温度下水浴30 min，摇匀后静置1 min，取上层液体进行梯度稀释至10-4，选取10-3和10-4两个梯度的100 μL稀释液涂布至亚甲基蓝平板，37 ℃静置培养过夜，观察并挑取产透明圈的菌株。γ-PGA是一种阴离子聚合物，其分子链上富含羧基(-COOH)，能够与阳离子染料亚甲基蓝发生特异性吸附反应，菌株在亚甲基蓝平板上生长并分泌γ-PGA时，就会吸附培养基中的亚甲基蓝，导致染料沉淀或者颜色变浅，在菌落周围形成明显的透明圈或者色差区域，不产γ-PGA的菌株则无此现象。按1%的接种量将获得的菌株接种至摇瓶发酵培养基中，培养基装液量为50 mL/250 mL三角瓶，在37 ℃ 220 r/min的摇床中发酵培养48 h后，将发酵液10 000 r/min离心10 min后收集上清液，采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)比色法快速测定上清液中γ-PGA的产量。
采用划线法在LB平板上培养产γ-PGA菌株单菌落，并观察记录其形态特征。利用通用引物(27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R: 5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)进行PCR扩增菌株16S rRNA基因，扩增条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃ 7 min完全延伸。PCR完成及纯化后送样至测序公司进行测序。测序获得的序列上传NCBI数据库进行BLAST分析，并将菌株的序列与对比得出的同源性序列在MEGA 11软件上用邻近法构建系统发育树。菌株与芽孢杆菌属(Bacillus)菌株基因组的平均核苷酸一致性(Average Nucleotide Identity, ANI)采用JSpeciesWS在线工具[13]进行分析，计算方法为BLASTn运算法，ANI值大于95%则判断2个或多个菌株属于同一个种[14]。
1.2.2 产γ-PGA菌株对作物的促生功能分析固氮功能分析采用无氮培养法，能在无氮固体培养基上生长的菌株具有固氮能力。解磷功能分析采用溶磷圈法，能在以磷酸三钙为唯一磷源的固体培养基上生长并产生透明水解圈的菌株具有解磷功能。产吲哚乙酸(Indole-3-Acetic Acid，IAA)功能分析采用Salkowski显色法，将菌株接种到色氨酸培养基中，培养基装液量为50 mL/250 mL三角瓶，在37 ℃ 220 r/min的摇床中发酵培养48 h后，将发酵液10 000 r/min离心10 min收集上清液，获得的上清液与Salkowski试剂反应。由于Salkowski试剂与IAA反应后呈粉红色或红色，与色氨酸反应后呈橙黄色或黄色，因此上清液与Salkowski试剂的显色反应是红色与橙黄色的混合色，若反应后产生偏暗橙红色或偏棕色，则说明该菌株具有产IAA的能力。
1.2.3 产γ-PGA菌株基因组的测序、注释及生物信息学分析采用磁珠法提取产γ-PGA菌株基因组。采用Hieff NGS® MaxUp II DNA Library Prep Kit for Illumina®试剂盒和Hieff NGSTM DNA Selection Beads试剂盒[翌圣生物科技(上海)股份有限公司)]构建二代测序文库。通过2%琼脂糖凝胶电泳和Thermo Qubit 4.0荧光定量仪质控合格后，在Illumina NovaSeq 6000的测序平台进行测序。采用FastQC v0.11.7软件对Illumina NovaSeq 6000测序数据进行数据统计、质量评估以及质量剪切，获得高质量的有效数据。使用SPAdes v3.5.0软件拼接二代测序数据，利用Pilon v1.18软件进行序列校正，修正拼接过程中的剪辑错误及小片段的插入缺失。
采用Proksee工具[15]对菌株基因组的蛋白质编码序列(CDS)、转运RNA(tRNA)及核糖体RNA(rRNA)进行注释并绘制基因组圈图。采用NCBI Blast+ 2.2.28工具将基因组序列与COG、NR、PFAM、Swissprot、TrEMBL等多个数据库进行比对，得到其功能注释信息；根据基因与Swissprot、TrEMBL数据库的注释结果得到GO功能注释信息；利用KAAS软件得到基因KEGG注释信息；采用Blastp软件将菌株基因组蛋白序列与CAZy数据库进行比对获得碳水化合物活性酶注释信息。菌株基因组的次级代谢产物合成基因簇采用antiSMASH 8.0在线工具[16]分析。采用NCBI Blast+ 2.2.28工具将基因组序列分别与BacMet数据库、PHI-base数据库进行比对，分析菌株基因组的重金属抗性功能及其与畜禽病原菌的互相作用。
1.2.4 产γ-PGA菌株对大肠杆菌的抑菌作用平板抑菌试验以大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655作为指示菌，将100 mL的LB固体培养基加热熔化并冷却至55 ℃左右，加入100 μL大肠杆菌MG1655指示菌并迅速充分摇匀后倒平板，用牛津杯打孔，获得指示菌平板备用。取200 μL培养好的产γ-PGA菌株发酵液加入指示菌平板的孔中，在无菌超净工作台中吹干，置于37 ℃培养箱中静置培养，观察指示菌平板是否产生抑菌圈。
1.2.5 产γ-PGA菌株对重金属铜和锌的耐受作用分别配制含1 000 mg/L的硫酸铜和硫酸锌的重金属母液，并用LB液体培养基分别稀释浓度为900、800、700、600、500、400、300、200、100 mg/L，每个浓度取200 μL加入96孔板。按1%的接种量分别接种菌液至含不同浓度重金属铜和锌的培养基中，37 ℃过夜培养，利用酶标仪测定培养液的OD600，以不加重金属的培养液作为空白对照。每个浓度梯度设置3个平行试验，结果用平均值±标准差表示。
2 结果与分析 2.1 产γ-PGA菌株的分离与鉴定本研究从自然发酵的大豆酱中分离获得一株产γ-PGA的菌株，命名为DDJ22，该菌株可以在亚甲基蓝平板上生长，并使亚甲基蓝平板的颜色发生变化，产生较大的透明圈[图 1(a)]，在37 ℃、220 r/min条件下摇瓶发酵培养48 h可以产21.35 g/L的γ-PGA。在LB平板上，菌株DDJ22呈圆形、微黄色、表面半透明且光滑湿润、有光泽、中部略微凸起、比较黏稠且能拉丝、边缘整齐[图 1(b)]。基于16S rRNA测序分析结果表明，菌株DDJ22与索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis)的同源性(97.85%)最为接近(图 2)。进一步分析菌株DDJ22与芽孢杆菌属菌株基因组的ANI，结果显示菌株DDJ22与索诺拉沙漠芽孢杆菌的亲缘关系最近，ANI值大于95%(99.36%)(表 1)，故鉴定分离得到的产γ-PGA菌株DDJ22为索诺拉沙漠芽孢杆菌。
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| (a)Strain grows on a methylene blue agar plate and produces transparent hydrolysis rings; (b) Colony morphology of strain on a LB agar plate. 图 1 高产γ-PGA菌株的分离与鉴定 Fig. 1 Isolation and identification of a high-yield γ-PGA strain |
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| 图 2 基于16S rRNA基因序列构建的菌株DDJ22系统发育树 Fig. 2 Strain DDJ22′s phylogenetic tree constructed based on 16S rRNA gene sequence |
| 菌株名称Strain name | ANI值/% ANI value/% |
| B. sonorensis KCTC 13918 | 99.63 |
| B. glycinifermentans GO-13 | 85.18 |
| B. swezeyi NRRL B-41294 | 82.39 |
| B. licheniformis ATCC 14580 | 80.75 |
| B. haynesii NRRL B-41327 | 80.73 |
| B. inaquosorum KCTC 13429 | 72.23 |
| B. halotolerans ATCC 25096 | 72.14 |
| B. cabrialesii TE3 | 72.11 |
| B. rugosus SPB7 | 72.11 |
| B. mojavensis ATCC 51516 | 71.98 |
| B. stercoris D7XPN1 | 71.97 |
| B. atrophaeus NBRC 15539 | 71.94 |
| B. tequilensis ATCC BAA-819 | 71.86 |
| B. vallismortis DSM 11031 | 71.73 |
| B. spizizenii ATCC 6633 | 71.67 |
| B. nakamurai NRRL B-41091 | 71.63 |
| B. amyloliquefaciens DSM 7 | 71.61 |
| B. siamensis KCTC 13613 | 71.45 |
| B. subtilis ATCC 19217 | 71.43 |
| B. velezensis KCTC 13012 | 71.42 |
2.2 菌株DDJ22对作物的促生功能潜力
菌株DDJ22对作物的促生功能分析结果显示，菌株DDJ22可以在无氮固体培养基上生长并形成较大菌落，表明其具有较强的固氮能力；可以在以磷酸三钙为唯一磷源的固体培养基上生长但未产生明显的透明水解圈，表明其解磷功能较弱。在色氨酸培养基中培养获得的上清液与Salkowski试剂反应产生较深橙红色，表明其具有较强的产IAA的能力(图 3)。
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| (a) Nitrogen-fixing function; (b) Phosphorus-solubilizing function; (c) IAA production 图 3 菌株DDJ22对作物的促生功能分析 Fig. 3 Plant growth-promoting functions of strain DDJ22 |
2.3 菌株DDJ22基因组的测序与组装分析
菌株DDJ22的基因组经过二代测序共获得7 939 630条Raw reads，大小为1 190 944 500 bp，质控处理后获得7 926 124条Clean reads，大小为1 179 791 072 bp，Clean reads占Raw reads的99.83%，GC含量为46.03%。测序质量在99%以上的碱基所占比例为97.15%，测序质量在99.9%以上的碱基所占比例为92.17%，表明菌株DDJ22基因组的测序质量好。经拼接获得的菌株DDJ22完整基因组序列，全长为4 572 542 bp，GC含量为45.54%。菌株DDJ22基因组包含4 642个基因、4 551个CDS、80个tRNA、10个rRNA基因、1个non-coding RNA (ncRNA)(图 4)。
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| From outside to inside, the first and fourth circles refer to the positions of CDS, tRNA, tmRNA, and rRNA on the genome. The second circle refer to the GC content. The third circle refers to GC skew. The fifth circle refers to the position coordinates of the genome sequence. 图 4 菌株DDJ22的基因组圈图 Fig. 4 Genomic circle map of strain DDJ22 |
2.4 菌株DDJ22基因组的基础功能注释
在NR、COG、GO、KEGG等数据库中对菌株DDJ22的基因功能进行注释，其中在NR数据库注释到的功能基因数量最多，共4 542个基因得到注释，占总数的99.80%。
菌株DDJ22基因组在COG数据库注释到的基因为3 038个(占总数的66.75%)，被分到21个COG类别。除了general function prediction only类别和function unknown类别外，注释到基因丰度最大的类别是Amino acid transport and metabolism(321个基因)，其次是Transcription(311个基因)和Carbohydrate transport and metabolism(274个基因)。Inorganic ion transport and metabolism(208个基因)和Energy production and conversion(191个基因)等类别的基因丰度也较高[图 5(a)]。
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| Annotation results of strain DDJ22 genome in COG database (a), GO database (b), and KEGG database (c) 图 5 菌株DDJ22基因组在基本功能数据库的注释结果 Fig. 5 Annotation results of genome of strain DDJ22 in basic functional databases |
菌株DDJ22基因组在GO数据库注释到1 014个基因，占总数的22.28%，被分到3大类基因功能，包括18种Biological process、5种Cellular component和10种Molecular function，其中注释到Biological process的基因数量最多。Biological process大类中注释到的基因数目最多的子类是Cellular process(648个基因)，其次是Metabolic proces(561个基因)。Cellular component和Molecular function大类中注释到基因数目最多的子类分别是Membrane(220个基因)和Catalytic activity(488个基因)[图 5(b)]。
菌株DDJ22基因组在KEGG数据库注释到1 349个基因，占总数的29.64%，被分到5大类代谢通路，包括12种Metabolism类、7种Organismal systems类、4种Cellular processes类、4种Genetic information processing类和2种Environmental information processing类，其中Metabolism类注释到的基因数量最多。Metabolism类中又以Carbohydrate metabolism通路注释到的基因数最多(284个基因)，Amino acid metabolism通路注释到的基因数也较多(222个基因)。Membrane transport通路注释到的基因数也较多(215个基因)[图 5(c)]。
2.5 菌株DDJ22基因组的碳水化合物活性酶注释菌株DDJ22基因组在碳水化合物活性酶相关的CAZy数据库的注释结果显示(表 2)，菌株DDJ22的基因组中共有79个基因编码的蛋白质属于CAZy家族，主要包括氧化还原酶AA(1个基因)、碳水化合物酯酶CE(24个基因)、糖苷水解酶GH(36个基因)、糖基转移酶GT(14个基因)以及多糖裂解酶PL(4个基因)。在碳水化合物酯酶家族中，CE1、CE3、CE4、CE7、CE12具有乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)的活性, CE1还具有铁基酯酶(EC 3.1.1.73)、羧基酯酶(EC 3.1.1.1)、s-甲酰谷胱甘肽水解酶(EC 3.1.2.12)的活性, CE4还具有几丁质脱乙酰酶(EC 3.5.1.41)的活性; CE10具有羧酸酯酶(EC 3.1.1.3)、乙酰胆碱酯酶(EC 3.1.1.7)、胆碱酯酶(EC 3.1.1.8)、甾醇酯酶(EC 3.1.1.13)的活性。在糖苷水解酶家族中，GH1具有β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)、β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)、β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)、β-葡萄糖醛酸酶(EC 3.2.1.31)、β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)以及外切β-1, 4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.74)的活性；GH12具有内切β-1, 4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)、木葡聚糖水解酶(EC 3.2.1.151)的活性；GH13具有α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、普鲁兰酶(EC 3.2.1.41)、α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)、海藻糖合成酶(EC 5.4.99.16)的活性；GH18具有几丁质酶(EC 3.2.1.14)、溶菌酶(EC 3.2.1.17)的活性；GH43具有β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)、阿拉伯糖酶(EC 3.2.1.99)、木聚糖酶(EC 3.2.1.8)的活性；GH46具有壳聚糖酶(EC 3.2.1.132)的活性；GH48具有纤维素水解酶(EC 3.2.1.176)、内切β-1, 4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)、几丁质酶(EC 3.2.1.14)的活性。在糖基转移酶家族中，GT1具有UDP -葡萄糖醛酸基转移酶(EC 2.4.1.17)、葡萄糖基转移酶(EC 2.4.1.120)、吲哚-3-乙酸-β-葡萄糖基转移酶(EC 2.4.1.121)的活性。在多糖裂解酶家族中，PL1、PL3、PL9具有果胶裂解酶(EC 4.2.2.2)的活性。
| CAZy分类 CAZy class |
CAZy编号 CAzy No. |
CAZy酶活性 CAZy activities |
基因数 Genes |
| AA | AA6 | (EC.1.6.5.6) | 1 |
| CE | CE1, CE3, CE4, CE7, CE8, CE9, CE10, CE12, CE14, CE15 | (EC 3.1.1.72), (EC 3.1.1.73), (EC 3.1.1.1), (EC 3.1.2.12), (EC 3.5.1.41), (EC 3.1.1.3), (EC 3.1.1.7), (EC 3.1.1.8), (EC 3.1.1.13), etc. | 24 |
| GH | GH1, GH5, GH9，GH11, GH12, GH13, GH18, GH23, GH25, GH28, GH31, GH32, GH42, GH43, GH46, GH48, GH51, GH105 | (EC 3.2.1.21), (EC 3.2.1.23), (EC 3.2.1.25), (EC 3.2.1.31), (EC 3.2.1.37), (EC 3.2.1.74), (EC 3.2.1.4), (EC 3.2.1.151), (EC 3.2.1.1), (EC 3.2.1.41), (EC 3.2.1.20), (EC 5.4.99.16), (EC 3.2.1.14), (EC 3.2.1.17), (EC 3.2.1.37), (EC 3.2.1.99), (EC 3.2.1.8), (EC 3.2.1.132), (EC 3.2.1.176), (EC 3.2.1.4), etc. | 36 |
| GT | GT1, GT2, GT4, GT26, GT28 | (EC 2.4.1.17), (EC 2.4.1.120), (EC 2.4.1.121), etc. | 14 |
| PL | PL1, PL3, PL9, PL11 | (EC 4.2.2.2), (EC 4.2.2.9), (EC 4.2.2.10), etc. | 4 |
| Note: AA-Auxiliary Activities，CE-Carbohydrate Esterases，GH-Glycoside Hydrolases，GT-Glycosyl Transferases，PL-Polysaccharide Lyases. | |||
2.6 菌株DDJ22的次级代谢产物合成基因簇分析
菌株DDJ22基因组存在18个次级代谢产物合成基因簇，包括opine-like-metallophore、NRPS、terpene等类型(表 3)，其中NRPS基因簇的数量最多，占总基因簇的44.44%。Cluster1、Cluster5、Cluster10、Cluster16分别与已知的基因簇bacillopaline、bacitracin、bacillibactin、amyloliquecidin GF610高度相似(表 3)。菌株DDJ22预测到的次级代谢产物合成基因簇中，44.44%的基因簇与已知基因簇完全不相似。
| 基因簇 Cluster |
类型 Type |
开始 From |
结束 To |
最相似的基因簇 Most similar known cluster |
相似度 Similarity confidence |
| Cluster1 | opine-like-metallophore | 525 676 | 547 816 | bacillopaline | High |
| Cluster2 | NRPS | 560 324 | 599 140 | fengycin | Low |
| Cluster3 | terpene | 44 190 | 66 079 | - | - |
| Cluster4 | T3PKS | 112 913 | 154 016 | - | - |
| Cluster5 | NRPS | 288 973 | 371 988 | bacitracin | High |
| Cluster6 | azole-containing-RiPP | 142 936 | 164 870 | - | - |
| Cluster7 | NI-siderophore | 288 586 | 322 048 | schizokinen | Medium |
| Cluster8 | betalactone | 49 583 | 78 090 | fengycin | Medium |
| Cluster9 | NRPS | 277 459 | 341 188 | plipastatin | Low |
| Cluster10 | NRPS | 185 213 | 237 017 | bacillibactin | High |
| Cluster11 | terpene-precursor | 34 662 | 55 561 | - | - |
| Cluster12 | lassopeptide | 122 759 | 145 180 | - | - |
| Cluster13 | terpene-precursor | 287 676 | 308 566 | - | - |
| Cluster14 | NRPS | 1 | 27 616 | lichenysin | Low |
| Cluster15 | NRPS | 1 | 26 214 | surfactin | Low |
| Cluster16 | cyclic-lactone-autoinducer | 1 | 25 322 | amyloliquecidin GF610 | High |
| Cluster17 | NRPS | 1 | 9 533 | - | - |
| Cluster18 | NRPS | 1 | 9 356 | - | - |
| Note: “-” indicates that the gene cluster has not been annotated to similar known secondary metabolite gene clusters. | |||||
2.7 菌株DDJ22与畜禽病原菌的互相作用分析
菌株DDJ22与畜禽病原菌的互相作用分析，共注释到35个基因作用于9种牛、羊、猪等畜禽的病原菌(表 4)，表明菌株DDJ22具有广谱抑制畜禽病原菌的潜能。其中，作用于大肠杆菌的基因数最多，其次是假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)和猪链球菌(Streptococcus suis)。平板抑菌试验结果显示，菌株DDJ22在LB平板上形成透明抑菌圈，表明其可以有效抑制大肠杆菌MG1655的生长(图 6)。
| 病原菌 Pathogen |
疾病 Disease |
宿主 Host |
基因数 Genes |
| Campylobacter jejuni | Gastroenteritis | Gallus gallus | 1 |
| Enterococcus faecalis | Nosocomial infections | Oryctolagus cuniculus | 2 |
| Escherichia coli | Avian colisepticemia | Anas platyrhynchos, Gallus gallus | 3 |
| E. coli | Bovine mastitis | Bos taurus | 11 |
| Mycoplasma agalactiae | Contagious agalactia | Ovis aries | 1 |
| Salmonella enterica | Food poisoning | Sus scrofa | 1 |
| Staphylococcus aureus | Bovine mastitis | Bos taurus | 2 |
| Streptococcus suis | Meningitis | Sus scrofa | 5 |
| Vibrio cholerae | Cholera | Oryctolagus cuniculus | 3 |
| Yersinia pseudotuberculosis | Zoonotic infection | Ovis aries | 6 |
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| 图 6 菌株DDJ22对大肠杆菌MG1655的抑菌作用 Fig. 6 Inhibitory effect of strain DDJ22 on E. coli MG1655 |
2.8 菌株DDJ22的重金属抗性功能注释
菌株DDJ22基因组对重金属具有抗性的基因分析结果显示(表 5)，菌株DDJ22基因组存在54种重金属的抗性基因。其中，对重金属锌注释到的抗性基因种类最多，其次是重金属铜；对重金属镍注释到的基因数最多，其次是钴。此外，对农业种植中常见的重金属汞、镉、铅、铬及砷等也注释到抗性基因。进一步通过液体培养试验验证重金属铜和锌对菌株DDJ22生长的影响，结果显示菌株DDJ22对重金属铜和锌均具有一定程度的耐受性，菌株DDJ22在1 000 mg/L的铜浓度环境中仍可以缓慢生长，在400 mg/L以下的铜浓度环境中可以快速生长，在500 mg/L以下的锌浓度环境中可以缓慢生长(表 6)。
| 重金属 Heavy metal |
抗性基因种类 Resistance gene type |
基因数 Genes |
| Arsenic (As) | pstB, rsC, arsT, arsB, glpF | 8 |
| Cadmium (Cd) | yfeP, mntH, czcR, frnE | 3 |
| Cobalt (Co) | coaT, corT, yfeP, mntH, czcR, corC, fecD, fecE | 28 |
| Chromium (Cr) | chrR, ruvB, recG | 6 |
| Copper (Cu) | copA, corR, pcoR, yfmP, ycnJ, ycnK, csoR, copR, copZ, cueR, baeR | 14 |
| Iron (Fe) | yfeP, mntH, acn, ybtP, fbpC, sitC, yfeA, troB | 19 |
| Mercury (Hg) | merA | 2 |
| Lead (Pb) | zraS, hydG | 1 |
| Manganese (Mn) | yfeP, mntH, sitC, yfeA, troB, mntR | 9 |
| Nickel (Ni) | fecD, fecE, nikA, nikB, nikC, nikD, nikE | 47 |
| Antimony (Sb) | arsB, glpF | 2 |
| Tungsten (W) | modA, modB, wtpC, baeR, tupC | 22 |
| Zinc (Zn) | yfeP, mntH, czcR, zraS, hydG, troB, baeR, pitA, ziaR, smtB, ziaA, zitB, ybgR, yebM, znuC | 18 |
| 浓度/(mg/L) Concentration/ (mg/L) |
OD600 | |
| 铜Copper | 锌Zinc | |
| 1 000 | 0.257±0.005 | 0.060±0.003 |
| 900 | 0.279±0.002 | 0.065±0.007 |
| 800 | 0.297±0.003 | 0.074±0.007 |
| 700 | 0.302±0.001 | 0.083±0.005 |
| 600 | 0.336±0.011 | 0.089±0.005 |
| 500 | 0.358±0.002 | 0.124±0.006 |
| 400 | 0.553±0.025 | 0.173±0.001 |
| 300 | 0.685±0.020 | 0.191±0.001 |
| 200 | 0.882±0.031 | 0.193±0.001 |
| 100 | 0.932±0.022 | 0.257±0.018 |
| Blank control | 0.996±0.005 | |
3 讨论
本研究分离出一株产γ-PGA的菌株DDJ22，经鉴定为索诺拉沙漠芽孢杆菌。索诺拉沙漠芽孢杆菌最早从索诺拉沙漠土壤中被分离出来，与地衣芽孢杆菌(B. licheniformis)的亲缘关系最为密切，但其耐盐性、色素沉着、多位点酶电泳、基因组DNA重组、蛋白质编码基因以及16S rRNA的序列差异与地衣芽孢杆菌存在差异[17]。此外，Yuan等[18]的研究发现，索诺拉沙漠芽孢杆菌是酱香型白酒传统发酵中的优势菌株之一。对于γ-PGA的合成菌株，目前关于枯草芽孢杆菌(B. subtilis)、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)的研究相对较多[3]，关于索诺拉沙漠芽孢杆菌的研究相对较少。Chettri等[19]从印度发酵大豆食品中分离到产γ-PGA的索诺拉沙漠芽孢杆菌，这与本研究类似，但该研究未分析菌株的基因组功能。目前基于生物信息学分析产γ-PGA的索诺拉沙漠芽孢杆菌的研究较少，但在农业上已有研究报道索诺拉沙漠芽孢杆菌可以促进作物生长，具有作为作物强效生物肥料的潜力[20-21]。Saleem等[22]分离鉴定了一株产IAA且耐盐的索诺拉沙漠芽孢杆菌，该菌株可以促进棉花植株生长，缓解盐胁迫。本研究获得的菌株DDJ22也具有较强的产IAA能力，与前人研究类似。此外，菌株DDJ22还具有固氮功能，但解磷功能较弱，其促植物生长功能将有利于平陆运河工程渣土复垦种植作物的生长。
菌株DDJ22基因组全长为4 572 542 bp，GC含量为45.54%，比从苏丹自然发酵面包食品Gergoush中分离到的索诺拉沙漠芽孢杆菌L12的基因组(4 647 754 bp)[23]小，但二者的GC含量接近；菌株L12基因组有78个tRNA基因和4 236个CDS，均小于菌株DDJ22。
平陆运河工程渣土复垦的土地十分贫瘠、肥力极弱。施用由作物有益菌发酵畜禽粪便制作的微生物有机肥是目前提升土壤肥力的有效措施之一。菌株DDJ22的碳水化合物代谢通路丰富，存在大量的碳水化合物活性酶基因，有利于畜禽粪便发酵，制作微生物有机肥，进而促进平陆运河工程渣土复垦土地的碳循环与有机质补充。Mohandas等[24]分离到的索诺拉沙漠芽孢杆菌MPTD1可以产果胶酶，本研究与之类似，在菌株DDJ22基因组上注释到的PL1、PL3、PL9具有果胶裂解酶活性。Raza等[25]从水牛消化系统中分离的索诺拉沙漠芽孢杆菌BD92具有葡聚糖酶、木聚糖酶活性，本研究也注释到菌株DDJ22基因组存在类似的功能。畜禽粪便存在较多未被动物消化利用的纤维素、半纤维素和木质素等碳水化合物，菌株DDJ22丰富的碳水化合物活性酶基因有助于这部分物质的分解。
菌株DDJ22存在NRPS基因簇，具有与bacillopaline、bacitracin、bacillibactin、amyloliquecidin GF610等高度相似的基因簇，这些基因簇主要合成抗菌肽。Chopra等[26]从海洋土壤分离得到的索诺拉沙漠芽孢杆菌MT93可产sonorensin抗菌肽，对单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等细菌具有抗菌活性。Adimpong等[23]报道的索诺拉沙漠芽孢杆菌L12基因组具有合成fengycin、iturin和bacitracin的基因簇，与本研究有差异。菌株DDJ22基因组还注释到35个畜禽病原菌的抗性基因，对大肠杆菌等畜禽病原菌具有抑制作用，平板抑菌试验也证实菌株DDJ22可以抑制大肠杆菌MG1655。Wang等[27]研究表明从韩国传统发酵食品kimchi分离到的索诺拉沙漠芽孢杆菌MAHUQ-74介导合成的银纳米颗粒对大肠杆菌等9种食源性病原菌具有显著抗性，与本研究注释结果类似。Lee等[28]研究表明索诺拉沙漠芽孢杆菌PMC204具有强效抗结核特性，可显著减少巨噬细胞内结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)H37Rv和XDR菌株的数量。平陆运河工程渣土复垦土地需要的畜禽粪便发酵有机肥量巨大，往往采用的是不灭菌发酵，菌株DDJ22的抗菌功能有利于抑制畜禽粪便中的病原菌，同时产生的抗菌物质也可以提高复垦土地预防作物土壤真菌病害的能力。畜禽粪便中存在的重金属包括铜、锌、汞、镉、铅、铬及砷，其中铜和锌含量最高。菌株DDJ22基因组存在对锌、铜、汞、镉、铅、铬及砷等重金属的抗性基因，对重金属锌和铜注释到的抗性基因种类和数量均较多，液体培养试验也证实菌株DDJ22可以耐受重金属锌和铜，这有利于发酵处理含有锌和铜等重金属的畜禽粪便，制备用于平陆运河工程渣土复垦的微生物有机肥。Rabani等[29]从石油污染场所分离到的索诺拉沙漠芽孢杆菌RS2(3)对重金属镉、铬、铜和锌具有抗性，Khowal等[30]从印度Varanasi的土壤分离到的索诺拉沙漠芽孢杆菌3SSSS对重金属砷具有抗性，均与本研究类似。
综上所述，产γ-PGA的索诺拉沙漠芽孢杆菌DDJ22在平陆运河工程渣土复垦中具有较好的潜在应用前景。
4 结论本研究从自然发酵的大豆酱中分离得到一株产γ-PGA菌株DDJ22，经鉴定为索诺拉沙漠芽孢杆菌。菌株DDJ22具有固氮和产IAA的作物促生功能，解磷功能较弱。菌株DDJ22基因组的碳水化合物代谢通路丰富，存在丰富的碳水化合物活性酶基因和NRPS合成基因簇，还存在对牛、羊、猪等畜禽的病原菌和锌、铜、汞、镉、铅、铬及砷等重金属的抗性基因，特别是能够抑制大肠杆菌和耐受重金属铜和锌。菌株DDJ22在平陆运河工程渣土复垦中具有较好的潜在应用前景。
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