2. 广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所，广西植物功能物质与资源持续利用重点实验室，广西桂林 541006;
3. 广西师范大学化学与药学学院，广西桂林 541004
2. Key Laboratory of Functional Phytochemicals Research and Utilization, Guangxi Institute of Botany, Guangxi Zhuang Autonomous Region and Chinese Academy of Sciences, Guilin, Guangxi, 541006, China;
3. School of Chemistry and Pharmaceutical Sciences, Guangxi Normal University, Guilin, Guangxi, 541004, China
氧化应激是指机体内有害物质如H2O2、丙二醛(MDA)、自由基，其含量超过机体抗氧化系统清除能力引发的生理反应，会对脂质、蛋白质、核酸等生物大分子造成氧化损伤，进而加速衰老或诱导多种疾病如癌症、糖尿病、心血管疾病的产生[1]。抗氧化的主要机制是清除体内过多的自由基以调节氧化还原平衡[1]。研究发现表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、槲皮素等多酚与黄酮成分具有抗氧化活性，具有防治氧化应激相关疾病的作用[2-4]。
荔枝是无患子科(Sapindaceae)常绿乔木荔枝(Litchi chinensis Sonn.)的果实，是广东、广西、福建等地广泛分布的亚热带水果[5]。荔枝加工产生的大量果皮和种子通常被视为废弃物，造成资源浪费。研究发现，荔枝果皮含丰富的多酚和黄酮类化合物，表现出抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种生物活性[2, 6]，在防治糖尿病方面具有潜在应用价值。
中药网络药理学基于系统生物学、生物化学等多学科理论，通过建立成分、靶点、通路等网络，可以更全面地揭示中药复杂的作用机制，已成为高效的研究和预测工具，并被广泛应用于中药研究中[7]。荔枝皮成分复杂多样，与单一成分作用相比，其特点在于多成分、多靶点、多途径的系统调控。为进一步研究荔枝皮抗氧化作用，本研究采用网络药理学方法揭示荔枝皮抗氧化活性的物质基础和作用机制，为深入开发荔枝皮提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 主要材料、试剂和仪器材料和试剂：荔枝(购自广西桂林市雁山区农贸市场，由广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所许为斌研究员鉴定)，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，南京奥多福尼生物科技有限公司)，2,2-联氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS, 上海麦克林生化科技股份有限公司)，维生素C(西陇科学股份有限公司)，CH3COOH、Na2CO3、K2S2O8、乙醇(国药集团化学试剂有限公司)，槲皮素、山柰酚(合肥博美生物科技有限责任公司)，表没食子儿茶素没食子酸酯、异落叶松脂素(上海源叶生物科技有限公司)。
仪器：离心机(珠海黑马医学仪器有限公司)，OSB-2200旋转蒸发器(东京理化器械株式会社), 喷雾干燥机(上海贺帆仪器有限公司), Spark多功能酶标仪(瑞士帝肯公司)。
1.2 荔枝皮成分及对应靶点获取检索与荔枝皮相关的文献，获取其化学成分。从中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)中找到成分对应的靶点，从PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)和文献中获取成分的结构信息，将结构信息上传至SwissTargetPrediction(http://swisstargetprediction.ch/)，选择物种Homo sapiens预测靶点后去重整理。通过UniProt(https://www.uniprot.org/)将所得的靶点标准化为Gene symbol。
1.3 抗氧化相关基因获取在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和Gene Cards(https://www.genecards.org/)中以Homo sapiens为物种搜索“antioxidant”“antioxidative”“antioxidation”，收集抗氧化相关基因并去重整理。
1.4 构建荔枝皮潜在抗氧化成分与靶点网络在微生信平台(https://www.bioinformatics.com.cn/)绘制韦恩图，获取荔枝皮成分靶点与抗氧化相关基因的交集，即荔枝皮成分的潜在抗氧化靶点。将荔枝皮成分及潜在抗氧化靶点导入Cytoscape 3.9.1软件[8]，构建荔枝皮潜在抗氧化成分与靶点网络，并使用软件中的Analyze Network功能分析网络。
1.5 构建蛋白质相互作用(PPI)网络和获取核心靶点在STRING(https://cn.string-db.org/)中，输入潜在抗氧化靶点，选择物种Homo sapiens进行蛋白质相互作用分析，得到PPI网络并导入Cytoscape 3.9.1软件。使用软件的Analyze Network插件分析网络，运用MCODE插件筛选出核心子网络，最后利用cytoHubba插件筛选出前5的核心基因。
1.6 基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析对核心子网络进行GO富集分析并对结果可视化处理：通过DAVID(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)对核心子网络的基因进行GO和KEGG通路富集分析，获得生物过程(Biological Process，BP)、分子功能(Molecular Function，MF)、细胞组分(Cellular Component，CC)以及KEGG通路结果。将富集分析结果按照P从小到大进行排序，设定P＜0.05，随后绘制富集气泡图。最后构建荔枝皮-抗氧化活性成分-靶点-信号通路网络图。
1.7 分子对接验证选取排名靠前的蛋白基因和成分进行分子对接。对接所需的化合物3D结构从PubChem下载，蛋白结构从PDB(https://www.rcsb.org/)获取。应用AutoDock Vina 1.1.2软件[9]进行分子对接工作，对接前先通过PyMOL 2.5.5软件[10]对受体蛋白进行处理，包括去除水分子、盐离子以及其他小分子。使用ADFR 1.0软件[11]将所有处理后的小分子和受体蛋白转换为AutoDock Vina 1.1.2软件所需的PDBQT格式。选取获得最高分的构象，并在PyMOL 2.5.5软件中进行可视化分析，结合亲和力为负数表示存在结合可能性，数值越小表示结合可能性越大。
1.8 荔枝皮提取物制备将新鲜荔枝果皮和10倍体积的80%乙醇溶液在室温条件下浸泡7 d，过滤，滤液在3 500 r/min条件下离心10 min。收集上清液过XDAf-7大孔树脂，进行柱层析(条件：上样液质量浓度为3.5 mg/mL，pH值为4.5；洗脱液流速为6 BV/h)，用60%乙醇溶液洗脱得到提取物洗脱液，收集洗脱液减压浓缩(条件：真空度95 kPa，加热浴温度40 ℃，冷却水15 ℃)，喷雾干燥得到荔枝皮提取物(LPE)。
1.9 DPPH自由基清除率测定DPPH自由基是一种稳定的自由基，具有孤立的不成对电子，其乙醇或甲醇溶液呈紫色，在517 nm处有吸收峰，当存在自由基清除剂时，DPPH自由基会接受电子或氢原子，导致颜色逐渐褪色，可用于评估化合物的抗氧化功能[12]。用无水乙醇配制0.3 mmol/L的DPPH溶液，避光保存。根据第1.6节和第1.7节确定荔枝皮的主要抗氧化活性成分。通过预实验确定各药物的浓度范围后，分别称取并配制相应浓度的槲皮素、表没食子儿茶素没食子酸酯、山柰酚、异落叶松脂素、维生素C备用，下同。荔枝皮提取物用50%乙醇配制成浓度分别为1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00 μg/mL的溶液，维生素C作为阳性对照组。吸取100 μL药物溶液和100 μL的DPPH溶液加入96孔板中作为药物孔；吸取100 μL药物溶液和100 μL 50%乙醇加入96孔板中作为药物空白孔；吸取100 μL 50%乙醇和100 μL DPPH溶液加入96孔板中作为DPPH空白孔。涡旋混匀后，置于37 ℃下避光孵育30 min，采用酶标仪测量波长517 nm处的吸光度值，每孔平行测定3次。DPPH自由基清除率按如下公式计算：
| $ R_1=\left[1-\left(A_1-A_2\right) / A_{\mathrm{d}}\right] \times 100 \%, $ |
其中，R1为DPPH自由基清除率，A1为药物孔吸光度值，A2为药物空白孔吸光度值，Ad为DPPH空白孔吸光度值。
1.10 ABTS自由基清除率测定ABTS在K2S2O8的催化下氧化为蓝绿色的ABTS+，在734 nm处有吸收峰，当存在自由基清除剂时，ABTS+会被抑制，导致反应体系褪色，可用于评估化合物的抗氧化功能[13]。用蒸馏水配制140 mmol/L的K2S2O8及7 mmol/L的ABTS工作液，在27 ℃避光条件下保存12 h。稀释ABTS工作液，在734 nm波长条件下测试其吸光度值，结果为0.70-0.75时备用。荔枝皮提取物用50%乙醇配制成浓度分别为2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μg/mL的溶液，维生素C作为阳性对照组。吸取20 μL药物溶液和200 μL ABTS工作液加入96孔板中作为药物孔；吸取20 μL药物溶液和200 μL 50%乙醇加入96孔板中作为药物空白孔；吸取20 μL 50%乙醇和200 μL ABTS工作液加入96孔板中作为ABTS空白孔。涡旋混匀后，置于37 ℃下避光孵育30 min，设置酶标仪在波长734 nm处测量吸光度值。每孔平行测定3次。ABTS自由基清除率按如下公式计算：
| $ R_2=\left[1-\left(A_3-A_4\right) / A_{\mathrm{a}}\right] \times 100 \%, $ |
其中，R2为ABTS自由基清除率，A3为药物孔吸光度值，A4为药物空白孔吸光度值，Aa为ABTS空白孔吸光度值。
2 结果与分析 2.1 荔枝皮成分及靶点、抗氧化基因筛选剔除无靶点的成分，得到47个活性成分(表 1)和522个靶点，并在NCBI和Gene Cards中获取4 393个与抗氧化相关的蛋白基因。
| 序号 No. |
化合物 Compound |
序号 No. |
化合物 Compound |
|
| LZP1 | (-)-Epicatechin[14] | LZP25 | Quercetin-3-O-rutinoside-7-O-α-L-rhamnosidase[21] | |
| LZP2 | Proanthocyanidin B2[14] | LZP26 | Cyanidin-3-glucoside[22] | |
| LZP3 | Epicatechin-(4β→8, 2β→O→7)-epicatechin-(4β→8)-epicatechin[15] | LZP27 | Malvidin-3-glucoside[22] | |
| LZP4 | (+)-Catechin[16] | LZP28 | (-)-Epicatechin-8-C-β-D-glucopyranoside[23] | |
| LZP5 | Epicatechin gallate[17] | LZP29 | Naringenin-7-O-(2,6-di-O-α-L-rhamnopyranosyl)-β-D-glucopyranoside[23] | |
| LZP6 | Epigallocatechin gallate[17] | LZP30 | Chrysoeriol[24] | |
| LZP7 | Procyanidin B1[17] | LZP31 | Kaempferol-3-O-β-D-glucoside[24] | |
| LZP8 | Methyl 3,4-dihydroxybenzoate[18] | LZP32 | (+)-Gallocatechin[24] | |
| LZP9 | Stigmasterol[18] | LZP33 | Isolariciresinol-9-O-β-D-xyloside[24] | |
| LZP10 | Isolariciresinol[18] | LZP34 | (+)-5-methoxyisolariciresinol-9-O-β-D-xylopyranoside[24] | |
| LZP11 | Kaempferol[18] | LZP35 | Vanillic acid[24] | |
| LZP12 | 2-(2-Hydroxy-5-(methoxycarbonyl) phenoxy)-benzoic acid[18] | LZP36 | 3,4,3′,4′-Tetrahydroxy biphenyl[24] | |
| LZP13 | Methyl shikimate[18] | LZP37 | Tachioside[24] | |
| LZP14 | Butylated hydroxytoluene[18] | LZP38 | Isotachioside[24] | |
| LZP15 | Gallic acid[19] | LZP39 | (-)-Epigallocatechin[25] | |
| LZP16 | Rutin[19] | LZP40 | P-Hydroxybenzoic acid[26] | |
| LZP17 | Quercetin[19] | LZP41 | 3,4-Dihydroxybenzoic acid[26] | |
| LZP18 | (+)-Isolariciresinol-9-O-α-L-arabinopyranoside[20] | LZP42 | Aesculitannin A[26] | |
| LZP19 | Burselignan-9-O-α-L-arabinopyranoside[20] | LZP43 | Quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside[26] | |
| LZP20 | (-)-Secoisolariciresinol-9-O-α-L-arabinopyranoside[20] | LZP44 | Phlorizin[27] | |
| LZP21 | Sisymbrifolin[20] | LZP45 | Caffeic acid[28] | |
| LZP22 | 2α-Methoxychroman-3α, 5, 7-triol[20] | LZP46 | Isorhamnetin-3-O-rutinoside[25] | |
| LZP23 | Garcimangosone D[20] | LZP47 | Epiafzelechin[25] | |
| LZP24 | β-D-Glucopyranosyldihydrophaseate[20] |
2.2 荔枝皮潜在抗氧化成分与靶点网络、潜在抗氧化靶点PPI网络
通过韦恩图获得409个交集基因[图 1(a)]。荔枝皮潜在抗氧化成分与靶点网络图[图 1(b)]初步显示槲皮素(LZP17)、表没食子儿茶素没食子酸酯(LZP6)、山柰酚(LZP11)、异落叶松脂素(LZP10)等成分排名靠前。通过STRING和Cytoscape 3.9.1软件进行PPI分析，得到最强相关性子网络[图 1(c)]，从该网络进一步筛选确定排名前5且度值相等的核心抗氧化基因为STAT3、TP53、SRC、CASP3、JUN [图 1(d)]。
|
| In figure (b), circle represents the potential antioxidant compound of litchi peel, and diamond represents the potential antioxidant target.Darker color and larger size indicate the higher degree value. 图 1 荔枝皮潜在抗氧化成分与核心抗氧化基因筛选过程 Fig. 1 Procedure for analyzing potential antioxidant compounds in litchi peel and associated core antioxidant genes |
2.3 GO和KEGG通路富集分析
GO和KEGG通路富集分析[图 2(a)]显示生物过程富集到628个条目，其中显著性最高的是基因表达正调控(Positive regulation of gene expresion)、衰老(Aging)、平滑肌细胞增殖正调控(Positive regulation of smooth muscle cell proliferation)。细胞组分富集到50个条目，其中显著性最高的为细胞外间隙(Extracellular space)、大分子复合物(Macromolecular complex)、细胞外域(Extracellular region)。分子功能富集到91个条目，其中显著性最高的为酶结合(Enzyme binding)、相同蛋白结合(Identical protein binding)、蛋白激酶结合(Protein kinase binding)。KEGG通路富集到163个相关通路，其中癌症通路、糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路、脂质和动脉粥样硬化等显著性最高[图 2(b)]，两种富集结果提示荔枝皮可通过调节多种生物学过程和信号通路发挥抗氧化功效。基于前述结果，构建荔枝皮-抗氧化活性成分-靶点-信号通路网络图[图 2(c)]，揭示槲皮素、表没食子儿茶素没食子酸酯、山柰酚、异落叶松脂素为荔枝皮主要抗氧化成分，荔枝皮的抗氧化作用与PTGS2、MMP9、RELA、AKT1等基因密切相关。
|
| In figure (c), the diamond, triangle, rectangle, hexagon, and circle represent litchi peel, antioxidant compound, target, signaling pathway, and oxidative stress, respectively.Darker color and larger size indicate the higher degree value. 图 2 GO和KEGG通路富集分析结果及最终网络图 Fig. 2 GO and KEGG pathway enrichment results and final network |
2.4 分子对接结果
为验证图 2(c)的结果，取前4名的活性成分与前2名富集在抗氧化相关信号通路的核心基因表达产生的蛋白进行分子对接，对接结果和结合能评分如图 3、图 4和表 2所示。活性成分与核心基因蛋白上的氨基酸残基形成氢键(蓝色虚线)，而氢键的形成使蛋白与小分子之间结合更加紧密。8个对接组合中，有7个对接组合的结合能在-6 kcal/mol以下，表明它们具有较好的结合效果。
|
| 图 3 PTGS2与槲皮素(a)、山柰酚(b)、表没食子儿茶素没食子酸酯(c)、异落叶松脂素(d)的分子对接结果 Fig. 3 Results of PTGS2 docked with quercetin (a), kaempferol (b), epigallocatechin gallate (c), and isolariciresinol (d) |
|
| 图 4 MMP9与槲皮素(a)、山柰酚(b)、表没食子儿茶素没食子酸酯(c)、异落叶松脂素(d)的分子对接结果 Fig. 4 Results of MMP9 docked with quercetin (a), kaempferol (b), epigallocatechin gallate (c), and isolariciresinol (d) |
| 蛋白 Protein |
配体 Ligand |
对接评分/(kcal/mol) Docking score/(kcal/mol) |
| PTGS2 | Quercetin | -6.7 |
| Kaempferol | -7.4 | |
| Epigallocatechin gallate | -4.8 | |
| Isolariciresinol | -6.3 | |
| MMP9 | Quercetin | -10.1 |
| Kaempferol | -9.6 | |
| Epigallocatechin gallate | -9.0 | |
| Isolariciresinol | -8.0 |
2.5 荔枝皮提取物对DPPH自由基的清除能力
荔枝皮提取物及其主要抗氧化活性成分，包括槲皮素、表没食子儿茶素没食子酸酯、山柰酚、异落叶松脂素，对DPPH自由基的清除能力如图 5所示。4个化合物均能以剂量依赖性方式清除DPPH自由基，清除效果随样品浓度的增加而增加。荔枝皮提取物清除DPPH自由基的半抑制浓度(IC50)值为13.17 μg/mL，表明其具有较好的抗氧化能力。主要单体成分槲皮素与表没食子儿茶素没食子酸酯的IC50值均优于维生素C，山柰酚则与维生素C接近，表现出较好的抗氧化能力。
|
| 图 5 荔枝皮提取物及其主要抗氧化活性成分对DPPH自由基的清除能力 Fig. 5 DPPH free radical scavenging of LPE and its major antioxidant components |
2.6 荔枝皮提取物对ABTS自由基的清除能力
荔枝皮提取物及4个主要抗氧化活性成分对ABTS自由基的清除能力如图 6所示。它们均能以剂量依赖性方式清除ABTS自由基，清除效果随样品浓度的增加而增加。主要单体成分槲皮素、表没食子儿茶素没食子酸酯的IC50值低于维生素C，表现出较好的抗氧化能力。
|
| 图 6 荔枝皮提取物及其主要抗氧化活性成分对ABTS自由基的清除能力 Fig. 6 ABTS free radical scavenging of LPE and its major antioxidant components |
3 讨论
本研究通过网络药理学方法获得的核心靶点包括STAT3、TP53、SRC、CASP3、JUN。其中，STAT3作为信号转导和转录激活子，在活性氧(ROS)的作用下形成氧化还原复合物，维持细胞ROS水平和平衡细胞周期[29]。TP53是常见的突变基因，正常表达有助于维持低丙二醛(MDA)水平[30]。SRC是病毒癌基因，参与MAPK信号通路并促进ROS产生[31]。CASP3是半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶，作为细胞凋亡的生物标志物，其活性受过氧化物刺激[32]，因此在抗氧化治疗中，CASP3和SRC是被抑制的关键调节因子。JUN则调控细胞凋亡，其正常表达有助于平衡细胞的过氧化物[33]。
对KEGG通路富集分析进一步筛选[图 2(c)]，揭示荔枝皮的抗氧化作用主要通过调控癌症、炎症、应激等信号通路来实现。转录因子如TP53和HIF1A的活性受H2O2调节，其影响TP53编码转录因子的合成、稳定性、转运和结合，从而影响癌症通路[34]，导致细胞增殖、凋亡和侵袭。癌症通路与氧化应激密切相关，被认为是参与氧化应激的重要通路之一。动脉粥样硬化是心血管疾病的重要病理进程。当心血管功能障碍发生时，脂蛋白摄取增加引起内皮细胞发生氧化应激，导致黏附分子如VCAM1和ICAM1表达上升，形成粥样斑块。有研究显示，荔枝皮的抗氧化活性成分能够通过调节脂质和动脉粥样硬化通路，降低黏附分子的表达，降低氧化应激损伤，改善心血管疾病[35]。PI3K-Akt信号通路调控下游P53分子参与细胞凋亡过程，而磷酸化的Akt可以抑制P53的表达。因此，通过上调PI3K-Akt信号通路中Akt的磷酸化，抑制P53的表达，可以防止过度氧化损伤导致细胞凋亡[36]。此外，研究还指出PI3K/Akt信号通路的激活可以提高还原型谷胱甘肽(GSH)的合成水平，从而增强对氧化应激的抵抗能力[37]。
在分子对接中，MMP9是一种基质金属蛋白酶，其体内水平与抗氧化能力呈负相关[38]。PTGS2是一类脂质过氧化物合成关键蛋白[39]，参与脂质过氧化反应造成氧化损伤。分子对接显示网络药理学预测结果可靠，前4名成分可作为荔枝皮发挥抗氧化作用的有效成分。H2O2能够诱导胱天蛋白酶3/7(Caspase 3/7)的表达，进而增加细胞核和细胞器的降解，而槲皮素通过抑制Caspase 3/7的激活，从而减轻H2O2对细胞造成的损伤[40]。表没食子儿茶素没食子酸酯参与自由基清除，保护细胞免受自由基损伤[41]。有研究表明，表没食子儿茶素没食子酸酯具有强大的抗氧化能力，其效果远高于已知的异槲皮素、没食子酸、表没食子儿茶素[42]。山柰酚通过抑制ROS的产生，上调超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性，保护细胞免受氧化损伤[43]。据Durazzo等[44]的研究，异落叶松脂素作为一种木脂素，具有较好的自由基清除能力。综合分子对接和DPPH、ABTS自由基清除实验可以发现，槲皮素、表没食子儿茶素没食子酸酯、山柰酚、异落叶松脂素是荔枝皮抗氧化的主要有效成分，表明荔枝皮提取物及其活性成分具有良好的抗氧化效果。
4 结论本研究通过网络药理学初步预测荔枝皮的47个活性成分通过作用于409个靶点发挥抗氧化作用，核心靶点包括STAT3、TP53、SRC、CASP3、JUN。经过进一步筛选KEGG通路富集分析结果，揭示了荔枝皮可能通过调节癌症、脂质、动脉粥样硬化和PI3K-Akt等信号通路来对抗氧化应激。分子对接验证了活性成分与抗氧化通路核心基因之间的有效结合。DPPH和ABTS体外自由基清除实验进一步验证了荔枝皮的主要有效成分包括槲皮素、表没食子儿茶素没食子酸酯、山柰酚、异落叶松脂素。研究结果表明，荔枝皮以多成分、多靶点、多通路的特点发挥抗氧化作用，可为深入研究荔枝皮的抗氧化功能提供参考依据。
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