2. 融水苗族自治县元宝山国家级自然保护区管理中心, 广西柳州 545300
2. Rongshui Miao Autonomous County Yuanbaoshan National Nature Reserve Management Center, Liuzhou, Guangxi, 545300, China
元宝山冷杉(Abies yuanbaoshanensis)为松科(Pinaceae)冷杉属(Abies)常绿针叶乔木，是中国特有的古老濒危孑遗植物，仅分布于广西北部融水苗族自治县的元宝山，被列为我国一级重点保护野生植物[1]。由于分布范围狭窄、数量少、天然更新能力差、幼苗死亡率高等因素[2]，再加上全球气候持续变暖导致生境不断被压缩和破碎化，元宝山冷杉种群数量正不断减少。调查发现，元宝山冷杉种群数量不足900株，且多为百年以上老龄树[3]。目前，元宝山冷杉已处于极度濒危状态。
近年来关于元宝山冷杉的研究主要涉及群落[4-5]、种群[6-7]、濒危机制[2, 8]、遗传多样性[9-10]和种子生物学[11]等方面，而关于其土壤微生物多样性变化的研究较少。根际是土壤-植物-微生物三者紧密结合、相互影响的场所[12]，植物在生长过程中很容易将自身产生的次级代谢产物释放到土壤中，从而引起植物根际土壤理化性质的改变，导致根际微生物和土壤酶活性较非根际有更大的变化[13]。不同植物或者同一植物在不同的生长发育时期，其根系分泌物组成、分泌量和累积程度均存在较大的差异，从而使根际微生物结构发生改变[14-15]。土壤中微生物群落结构对土壤生物活性及土壤养分形成有重要影响，与植物生长密切相关[16]。根际土壤微生物可以影响土壤营养物质的分解和转化，以及植物对营养的吸收利用[17-19]；同时土壤微生物群落结构、种群多样性会随土壤质量发生改变，可以反映生态系统土壤质量受损程度或恢复潜力[20]，从而反映植物生长状况，预测植株生长发育趋势。因此，研究元宝山冷杉生长发育与土壤微环境的关系，对保护其自然种群资源意义重大。元宝山冷杉种群大小级结构呈现出老龄树比例最大、幼龄树和中龄树比例较小的现象，尤其是中龄树数量最少或缺失，这种不健康的种群结构极不利于元宝山冷杉种群的延续和扩展。元宝山冷杉幼龄树生长良好，但许多老龄树因空心和枯顶导致生长情况糟糕[21-22]。因此，本研究拟通过高通量测序技术对元宝山冷杉幼龄树、老龄树根际与非根际土壤微生物群落的结构和多样性进行分析，旨在揭示元宝山冷杉生长过程根际微生物种群的变化规律，以期从微生物层面探究不同发育阶段元宝山冷杉自然种群与土壤微环境之间的关系，为元宝山冷杉的保护实践提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 土壤样品采集与处理本研究选取的老龄树为树龄70 a左右、胸径约为35 cm的植株，成熟且能结果；幼龄树为树龄3 a左右、个体高度≥100 cm、地径0.5 cm的植株[6]。于2022年5月在广西融水苗族自治县元宝山冷杉野外自然生长区采样，按照S形线路采样法并遵循“随机”“多点混合”的原则，在每个采样点选取长势一致的元宝山冷杉老龄树和幼龄树各5株，每株树以主茎为中心，在半径为30-40 cm的范围取土，取0-30 cm土层深度具有完整根系的土体。采用抖土法收集根际土壤，先轻轻抖落不含根系的松散土作为非根际土样，随后用细毛刷将黏附在根上0-0.5 cm处的土壤扫下来作为根际土样[23-26]。将混匀的土壤放入无菌自封袋中，用标签记录采样信息，放入户外保鲜箱后立即带回实验室，每个采样点3次重复。采集的土壤置于-80 ℃下保存，用于土壤微生物DNA提取及后续的细菌16S rRNA和真菌ITS测序。不同树龄元宝山冷杉土壤样品及编号如下：老龄树非根际土壤(LSN)、老龄树根际土壤(LSR)、幼龄树非根际土壤(XSN)、幼龄树根际土壤(XSR)。
1.2 土壤微生物DNA的提取和扩增测序使用土壤基因组DNA快速抽提试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]提取土壤微生物总DNA，DNA样品用干冰保存并寄送到上海美吉生物医药科技有限公司，利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序[27]。整个上机流程包括PCR扩增，PCR产物的混样、纯化，文库的构建。对细菌799F-1193R区进行扩增，引物采用799F(5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′)和1193R(5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′)。扩增程序为95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，持续28个循环周期；最后72 ℃延伸10 min。对真菌ITS可变区进行扩增，引物采用ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2R (5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)。扩增程序为95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，持续37个循环周期；最后72 ℃延伸10 min。
1.3 微生物组测序数据质控与分析对测序得到的原始数据进行拼接质控得到有效数据。采用Uparse软件平台(http://www.drive5.com/uparse/)进行操作分类单元(Operational Taxonomic Units, OTU)聚类和物种信息分析，按最小样本序列进行数据抽平处理[28]。OTU聚类步骤如下：①对优化序列提取非重复序列，便于降低分析过程的冗余计算量；②去除无重复的单序列；③按照97%相似性对非重复序列(不含单序列)进行OTU聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU的代表序列；④将所有优化序列map至OTU代表序列，选出与代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格。采用RDP classifier(Ribosomal Database Project分类器)的贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，并分别在各个分类水平——域(Domain)、界(Kingdom)、门(Phylum)、纲(Class)、目(Order)、科(Family)、属(Genus)、种(Species)统计各样本的群落物种组成。
1.4 元宝山冷杉土壤微生物组成分析基于测序的数据，利用R语言工具(Version 3.3.1)生成土壤微生物群落柱形图。利用Mothur软件(https://www.mothur.org/wiki/Calculators)分析随机抽样下的Alpha多样性，包括Ace、Chao1、Simpson和Shannon等指数。其中，Ace和Chao指数反映样本中群落的丰富度，Simpson和Shannon指数反映群落的多样性。Ace、Chao1和Shannon指数越大，Simpson指数越小，说明样品的物种多样性越高。利用R语言工具统计并作韦恩(Venn)图，韦恩图可用于统计多组或多个样本中所共有和独有的OTU数目。
多样性指数计算公式[29]如下：
| $ {D_{{\rm{Simpson }}}}{\rm{ }} = \frac{{\sum\nolimits_{i = 1}^{{S_{{\rm{obs }}}}} {{n_i}} \left( {{n_i} - 1} \right)}}{{N(N - 1)}}, $ | (1) |
| $ {H_{{\rm{Shannon }}}}{\rm{ }} = - \sum\nolimits_{i = 1}^{{S_{{\rm{obs }}}}} {\frac{{{n_i}}}{N}} \ln \frac{{{n_i}}}{N}, $ | (2) |
其中，DSimpson为Simpson指数，HShannon为Shannon指数，Sobs为实际观测到的OTU数目，ni为第i个OTU所含的序列数，N为所有的序列数。
1.5 元宝山冷杉土壤微生物群落结构差异性分析利用QIIME软件(http://qiime.org/install/index.html)对所测样本的微生物群落构成进行分析，采用主坐标分析(Principal Co-ordinates Analysis，PCoA)法探讨不同样本间群落组成的相似性或差异。采用费舍尔精确检验(Fisher′s exact test)对不同树龄根际样本间的物种丰度差异进行比较，获得物种在对比样本中的差异显著性。根据分类学组成，利用线性判别分析效应大小(Linear Discriminant Analysis Effect Size, LEfSe)软件对根际和非根际土壤进行线性判别分析，找出对样本划分产生显著性差异影响的群落，即采用LEfSe分析组间群落差异。
1.6 数据处理采用单因素方差分析进行显著性差异检验，显著水平设置为0.05，用最小显著性差异(Least Significant Difference，LSD)法进行多重比较分析，以上分析在IBM SPSS 21.0软件上运行，用Excel 2010软件进行数据整理和统计。
2 结果与分析 2.1 两种树龄元宝山冷杉土壤微生物群落的丰富度及多样性 2.1.1 土壤细菌群落的丰富度及多样性两种树龄元宝山冷杉土壤微生物群落的丰富度指数(Ace、Chao1指数)和多样性指数(Shannon、Simpson指数)如表 1所示。在丰富度方面，老龄树非根际土壤中细菌的Ace和Chao1指数最高，幼龄树根际土壤次之，老龄树根际土壤中两个丰富度指数均显著低于其他样品，表明元宝山冷杉老龄树非根际土壤中细菌的丰富度最高，幼龄树根际土壤细菌的丰富度显著高于老龄树根际土壤；幼龄树根际土壤细菌的丰富度略微高于非根际土壤，而老龄树则相反。在多样性方面，幼龄树根际土壤细菌的Shannon指数显著高于老龄树根际土壤，而Simpson指数之间无显著差异，但幼龄树的Simpson指数小于老龄树，表明幼龄树根际土壤中细菌的多样性高于老龄树根际土壤。老龄树根际与非根际土壤细菌的Shannon和Simpson指数差异显著，表明老龄树可能抑制了某些种类细菌的生长，导致土壤中细菌种类减少，细菌多样性显著降低。幼龄树根际与非根际土壤细菌的Shannon和Simpson指数差异虽然未达显著水平，但根际土壤略高于非根际土壤，表明幼龄树可促进土壤中细菌种类的增长，进而提高细菌群落的多样性水平。综上，元宝山冷杉在幼龄期可促进根际土壤中细菌的生长，但当元宝山冷杉生长到一定阶段后，对某些细菌的生长可能产生了抑制作用，导致根际土壤中细菌丰富度和多样性均显著降低。
| 样品编号 Sample number |
Ace指数 Ace index |
Chao1指数 Chao1 index |
Shannon指数 Shannon index |
Simpson指数 Simpson index |
|||||||
| 细菌 Bacteria |
真菌 Fungi |
细菌 Bacteria |
真菌 Fungi |
细菌 Bacteria |
真菌 Fungi |
细菌 Bacteria |
真菌 Fungi |
||||
| LSN | 581.52± 2.17a | 834.95± 16.74a | 578.12± 9.62a | 813.30± 15.53a | 4.80± 0.01a | 3.14± 0.17a | 0.021 8± 0.001 1b | 0.193 5± 0.027 7a | |||
| LSR | 414.16± 17.06c | 337.92± 12.90d | 408.06± 19.71c | 331.94± 2.01d | 4.21± 0.07c | 2.29± 0.28b | 0.036 7± 0.004 5a | 0.233 5± 0.039 6a | |||
| XSN | 525.67± 27.50b | 466.09± 14.61c | 541.57± 4.65b | 460.42± 24.06c | 4.36± 0.03b | 2.84± 0.05a | 0.035 7± 0.000 4a | 0.106 9± 0.007 2b | |||
| XSR | 527.76± 7.99b | 526.40± 11.53b | 549.58± 15.90b | 509.46± 17.10b | 4.39± 0.03b | 3.04± 0.15a | 0.032 3± 0.000 9a | 0.093 1± 0.006 5b | |||
| Note: different lowercase letters in the same column indicate significant differences (P＜0.05). | |||||||||||
2.1.2 土壤真菌群落的丰富度及多样性
在丰富度方面，所有供试土壤中真菌的Ace和Chao1指数差异显著，其中，以老龄树非根际土壤中真菌的Ace和Chao1指数最高，其次是幼龄树根际土壤，老龄树根际土壤的两个丰富度指数均为最低，表明老龄树非根际土壤中真菌的丰富度最高，而幼龄树根际土壤中真菌的丰富度显著高于老龄树根际土壤。在多样性方面，老龄树根际土壤中真菌的Shannon指数最低而Simpson指数最高，表明老龄树根际土壤中真菌的多样性最低。老龄树非根际土壤中真菌的Shannon指数最高，而幼龄树根际土壤与其无显著差异且幼龄树根际土壤Simpson指数最低，表明幼龄树根际土壤中真菌的多样性最高(表 1)。综上，幼龄树根际土壤中真菌的丰富度和多样性均显著高于老龄树根际土壤，幼龄树比老龄树更利于土壤真菌的生长。
2.2 两种树龄元宝山冷杉土壤微生物群落组成 2.2.1 土壤细菌群落组成两种树龄元宝山冷杉土壤中共检测到细菌23门41纲90目133科196属317种，OTU 675个。从门水平上看，土壤中不同细菌门类的相对丰度均有所差异，主要优势菌门为变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteriota)和放线菌门(Actinobacteriota)。其中，变形菌门在4个样品中的相对丰度分别为42.93%(LSN)、37.90%(LSR)、44.43%(XSN)和40.66%(XSR)，可见变形菌门在非根际土壤中的相对丰度均高于根际土壤，在幼龄树根际土壤中的相对丰度高于老龄树根际土壤。酸杆菌门在老龄树根际土壤中的相对丰度最高(42.10%)，其次是幼龄树非根际土壤中(32.89%)，在老龄树非根际土壤中最低(26.61%)，表明老龄树根际土壤最利于酸杆菌门生长；对于幼龄树，酸杆菌门在非根际土壤中生长优于根际土壤。放线菌门在幼龄树根际土壤中的相对丰度最高(23.52%)，在老龄树非根际土壤中次之(22.00%)，在老龄树根际土壤中最低(13.18%)，表明幼龄树根际土壤最利于放线菌门生长，而在老树龄根际土壤中放线菌门生长最差[图 1(a)]。
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| 图 1 元宝山冷杉土壤细菌的相对丰度 Fig. 1 Relative abundance of bacteria in the soil of A.yuanbaoshanensis |
在纲水平上，两种树龄元宝山冷杉土壤细菌群落主要由α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、酸杆菌纲(Acidobacteriae)、放线菌纲(Actinobacteria)和γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)等组成。α-变形菌纲在幼龄树非根际土壤中的相对丰度最高(36.55%)，在幼龄树根际土壤中次之(34.67%)，在老龄树根际土壤中最低(31.31%)。酸杆菌纲在老龄树根际土壤中的相对丰度最高(42.10%)，其次是幼龄树非根际土壤中(32.77%)，在老龄树非根际土壤中最低(26.32%)。放线菌纲在幼龄树根际土壤中的相对丰度最高(17.22%)，在老龄树非根际土壤中次之(12.70%)，在老龄树根际土壤中最低(9.0%)。γ-变形菌纲在4个样品中的相对丰度分别为8.63%(LSN)、6.58%(LSR)、7.79%(XSN)和5.92%(XSR)，可见γ-变形菌纲在非根际土壤中的相对丰度均高于根际土壤，在老龄树根际土壤中的相对丰度高于幼龄树根际土壤[图 1(b)]。
2.2.2 土壤真菌群落组成两种树龄元宝山冷杉土壤中共检测到真菌10门34纲80目152科243属329种，OTU 1 235个。从门水平上看，两种树龄元宝山冷杉土壤中真菌的优势菌门主要由担子菌门(Basidiomycota)、子囊菌门(Ascomycota)和Unclassified_k_Fungi组成。担子菌门在4个样品中的相对丰度分别为52.61% (LSN)、74.36%(LSR)、40.65%(XSN)和44.29%(XSR)，表明老龄树根际土壤最利于担子菌门生长，其次是老龄树非根际土壤。对于幼龄树，根际土壤同样比非根际土壤更利于担子菌门生长，可能是元宝山冷杉根系分泌物中有促进担子菌门生长的物质，且随着元宝山冷杉生长年限的增加，这类物质也逐渐累积。子囊菌门在4个样品中的相对丰度分别为37.66%(LSN)、17.47%(LSR)、44.89%(XSN)和38.73%(XSR)，表明幼龄树非根际土壤最利于子囊菌门生长。在幼龄树阶段，非根际土壤同样比根际土壤更利于子囊菌门生长，可能是元宝山冷杉根系分泌物中有抑制子囊菌门生长的物质，且随着元宝山冷杉生长年限的增加，这类物质也逐渐累积。Unclassified_k_Fungi在4个样品中的相对丰度分别为5.70%(LSN)、2.90%(LSR)、12.89%(XSN)和15.26%(XSR)，即Unclassified_k_Fungi在幼龄树根际土壤中的相对丰度最高，其次是幼龄树非根际土壤，在老龄树根际土壤中最低[图 2(a)]。
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| 图 2 元宝山冷杉土壤真菌的相对丰度 Fig. 2 Relative abundance of fungi in the soil of A.yuanbaoshanensis |
在纲水平上，两种树龄元宝山冷杉土壤真菌群落以伞菌纲(Agaricomycetes)、子囊菌门中纲级分类地位未知的类群(Unclassified_p_Ascomycota)、古根菌纲(Archaeorhizomycetes)和Unclassified_k_Fungi为主要菌纲。伞菌纲在老龄树根际土壤中的相对丰度最高(73.45%)，老龄树非根际土壤次之(47.58%)，在幼龄树根际土壤中最低(30.03%)。Unclassified_p_Ascomycota在幼龄树非根际土壤中的相对丰度最高(34.22%)，其次是幼龄树根际土壤(15.79%)，在老龄树根际土壤中最低(2.65%)。古根菌纲在幼龄树根际土壤中的相对丰度最高(20.95%)，其次是老龄树非根际土壤(15.01%)，在老龄树根际土壤中最低(5.29%)。Unclassified_k_Fungi在幼龄树根际土壤中相对丰度最高(15.26%)，其次是幼龄树非根际土壤(12.89%)，在老龄树根际土壤中的相对丰度最低(2.90%)。此外，担子菌门中纲级分类地位未知的类群(Unclassified_p_Basidiomycota)在幼龄树根际土壤中的相对丰度最高，达12.26%；而其在其余样品中最高仅为0.95%，在老龄树根际土壤中几乎为0[图 2(b)]。
2.3 两种树龄元宝山冷杉土壤微生物群落的相关性分析 2.3.1 土壤细菌群落的相关性分析元宝山冷杉土壤细菌和真菌OTU数量的韦恩图如图 3所示。4个样品中细菌OTU数量最多的是LSN(583)，XSR次之(514)，LSR最少(417)。可见，老龄树中非根际土壤细菌OTU数量比根际土壤多，而幼龄树中根际土壤细菌OTU数量略多于非根际土壤，这可能是由于元宝山冷杉的定植可促进根际土壤中某些类群细菌的生长，起初表现为根际土壤细菌OTU数量多于非根际土壤，但随着元宝山冷杉生长年限的增加，根际土壤中大部分种类细菌受到抑制，最终表现出老龄树根际土壤细菌OTU数量少于幼龄树根际土壤，根际土壤细菌OTU数量逐渐少于非根际土壤的规律。4个样品共有的细菌OTU为308个，分别占各土壤样品细菌OTU总数的52.83%(LSN)、73.86%(LSR)、60.99%(XSN)和59.92%(XSR)。特有的细菌OTU数量以老龄树非根际土壤中最多(56个)，占该样品细菌OTU总数的9.61%；其次是老龄树根际土壤(22个)，占该样品细菌OTU总数的5.28%；幼龄树非根际土壤中最少，仅为11个，占该样品细菌OTU总数的2.18%。上述结果表明，与幼龄树相比，老龄树对根际土壤细菌的影响更为显著，表现为根际土壤细菌OTU数量显著减少、特异性下降；此外，老龄树根际与非根际土壤之间的细菌群落差异也更加明显[图 3(a)]。
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| 图 3 元宝山冷杉土壤细菌和真菌OTU数量的韦恩图 Fig. 3 Venn diagrams of bacteria and fungi in the soil of A.yuanbaoshanensis |
2.3.2 土壤真菌群落的相关性分析
4个样品中真菌OTU数量最多的是LSN(914)，XSR次之(518)，LSR最少(343)。老龄树中非根际土壤真菌OTU总数与根际土壤差异较大，而幼龄树中根际土壤真菌OTU总数比非根际土壤略多，这可能是由于元宝山冷杉的定植可促进根际土壤中某些类群真菌的生长，起初表现为根际土壤真菌数量多于非根际土壤的现象；但随着元宝山冷杉生长年限的增加，根际土壤中大部分种类真菌受到抑制，最终表现出老龄树根际土壤真菌OTU数量少于幼龄树，根际土壤真菌OTU数量逐渐少于非根际土壤的规律。4个样品共有的真菌OTU为110个，分别占各土壤样品真菌OTU总数的12.04%(LSN)、32.07%(LSR)、24.39%(XSN)和21.24%(XSR)。特有的真菌OTU数量以老龄树非根际土壤中最多(447个)，占该样品真菌OTU总数的48.91%；以幼龄树根际土壤中最少(64个)，占该样品真菌总数的12.36%；老龄树根际土壤与幼龄树非根际土壤中特有的真菌OTU数量分别为65和66，分别占各土壤真菌OTU总数的18.95%和14.63%。上述结果表明，老龄树对根际土壤真菌群落组成的影响大于幼龄树，导致其根际土壤中真菌OTU数量显著减少、特异性下降，根际与非根际土壤之间的真菌群落差异显著[图 3(b)]。
2.4 两种树龄元宝山冷杉土壤微生物群落组成差异性分析两种树龄元宝山冷杉土壤微生物群落的主坐标分析如图 4所示。细菌主坐标分析结果显示，第一轴的解释度为51.90%，第二轴的解释度为25.32%，两轴的累积贡献率为77.22%，能较全面地反映样本信息。幼龄树根际与非根际土壤样品距离相近，而老龄树根际与非根际土壤样品距离较远，表明幼龄树根际与非根际土壤细菌物种组成相近，而老龄树根际与非根际土壤细菌物种组成差异较大。此外，幼龄树与老龄树各样品间距离较远，表明幼龄树与老龄树土壤细菌物种组成差异较大[图 4(a)]。真菌主坐标分析结果显示，第一轴的解释度为40.44%，第二轴的解释度为36.43%，两轴的累积贡献率为76.87%，能较全面地反映样本信息。真菌主坐标分析结果与细菌主坐标分析结果呈现相同的规律：幼龄树根际与非根际土壤真菌物种组成相近，而老龄树根际与非根际土壤真菌物种构成差异较大，且幼龄树与老龄树土壤真菌物种组成差异较大[图 4(b)]。
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| 图 4 土壤微生物基于OTU水平的主坐标分析 Fig. 4 Principal co-ordinates analysis of soil microorganisms based on OTUs |
2.5 两种树龄元宝山冷杉根际土壤微生物物种差异分析 2.5.1 根际土壤细菌物种差异分析
基于样本中群落丰度数据，检测元宝山冷杉老龄树与幼龄树根际土壤微生物群落中相对丰度表现出显著差异的物种，结果如图 5和图 6所示，图中显示的是相对丰度排名前10的物种。在门水平上，元宝山冷杉老龄树与幼龄树根际土壤细菌中变形菌门、酸杆菌门、放线菌门、疣微菌门(Verrucomicrobiota)、RCP2-54、Armatimonadota、厚壁菌门(Firmicutes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidota)和芽单胞菌门(Gemmatimonadota)差异显著。其中酸杆菌门、疣微菌门、RCP2-54、Armatimonadota和拟杆菌门等5个菌门在老龄树中的相对丰度显著高于幼龄树，而其余菌门在幼龄树中的相对丰度显著高于老龄树[图 5(a)]。在纲水平上，元宝山冷杉老龄树与幼龄树根际土壤细菌中酸杆菌纲、α-变形菌纲、放线菌纲、γ-变形菌纲、嗜热油菌纲(Thermoleophilia)、Norank_p_RCP2-54、疣微菌纲(Verrucomicrobiae)、菌毛单胞菌纲(Fimbriimonadia)、杆菌纲(Bacilli)和衣原体纲(Chlamydiae)差异显著。其中，酸杆菌纲、γ-变形菌纲、Norank_p_RCP2-54、疣微菌纲、菌毛单胞菌纲和衣原体纲等6个菌纲在老龄树中的相对丰度显著高于幼龄树，而其余菌纲在幼龄树中的相对丰度显著高于老龄树[图 5(b)]。
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| * 0.01＜P≤0.05, ** 0.001＜P≤0.01, *** P≤0.001. 图 5 门、纲水平上的细菌物种显著性差异 Fig. 5 Differentially abundant groups of bacteria at phylum and class levels |
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| * 0.01＜P≤0.05, ** 0.001＜P≤0.01, *** P≤0.001. 图 6 门、纲水平上的真菌物种显著性差异 Fig. 6 Differentially abundant groups of fungi at phylum and class levels |
2.5.2 根际土壤真菌物种差异分析
在门水平上，元宝山冷杉老龄树与幼龄树根际土壤真菌中担子菌门、子囊菌门、Unclassified_k_Fungi、被孢霉门(Mortierellomycota)、罗兹菌门(Rozellomycota)、捕虫霉门(Zoopagomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)和毛霉门(Mucoromycota)差异显著。其中，担子菌门、被孢霉门、捕虫霉门和毛霉门在老龄树中的相对丰度显著高于幼龄树，而其余菌门在幼龄树中的相对丰度显著高于老龄树[图 6(a)]。在纲水平上，元宝山冷杉老龄树与幼龄树根际土壤真菌中伞菌纲、古根菌纲、Unclassified_p_Ascomycota、Unclassified_k_Fungi、Unclassified_p_Basidiomycota、锤舌菌纲(Agaricomycetes)、粪壳菌纲(Sordariomycetes)、被孢霉纲(Mortierellomycetes)、银耳纲(Tremellomycetes)和罗兹菌门中纲级分类地位未知的类群(Unclassified_p_Rozellomycota)差异显著。其中，伞菌纲、锤舌菌纲、粪壳菌纲、被孢霉纲在老龄树中的相对丰度显著高于幼龄树，而其余菌纲在幼龄树中的相对丰度显著高于老龄树[图 6(b)]。
2.6 元宝山冷杉根际与非根际土壤微生物物种差异分析元宝山冷杉根际和非根际土壤中起重要作用的细菌和真菌的LEfSe组间群落差异分析结果如图 7所示。元宝山冷杉根际和非根际土壤中大部分细菌物种之间无差异。在门水平上仅有变形菌门、疣微菌门、p_SAR324_cladeMarine_group_B、迷踪菌门(Elusimicrobiota)、FCPU426、蛭弧菌门(Bdellovibrionota)和螺旋菌门(Spirochaetota)7个菌门存在显著差异。在纲水平上，γ-变形菌纲、Norank_p_SAR324_cladeMarine_group_B、衣原体纲、疣微菌纲、装甲菌纲(Armatimonadia)、Norank_p_FCPU426、Oligoflexia、Leptospirae等菌纲存在显著差异，且仅衣原体纲中的差异物种属于根际土壤，其余菌纲中的差异物种均属于非根际土壤。在科和属水平上，存在显著差异的有梭菌科(Sutterellaceae) Norank_f_Sutterellaceae、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)贪噬菌属(Variovorax)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)Norank_f_Oxalobacteraceae、Chitinimonadaceae科Chitinimonas、Candidatus Ovatusbacter、Norank_f_norank_o_JG36-TzT-191、Norank_o_norank_c_norank_p_SAR324_cladeMarine_group_B、假诺卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)Crossiella、Norank_o_Subgroup_2、西门坎氏菌科(Simkaniaceae) Norank_f_Simkaniaceae、Norank_o_Elsterales等31个细菌类群，其中仅假诺卡氏菌科Crossiella、Norank_o_Subgroup_2、西门坎氏菌科Norank_f_Simkaniaceae、Norank_o_Elsterales中的差异物种属于根际土壤[图 7(a)]。以上结果表明，元宝山冷杉非根际土壤细菌群落具有更高的特异性、丰富性和多样性，而元宝山冷杉的定植也使根际土壤中产生少量特异性的细菌群落。
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| R and NR correspond to rhizosphere soil and non-rhizosphere soil, respectively. 图 7 LEfSe组间群落差异 Fig. 7 LEfSe of differentially abundant groups |
元宝山冷杉根际和非根际土壤中绝大部分真菌物种之间无差异，且与细菌相比差异更少。其中，起重要作用的真菌在门水平上无差异，纲水平上仅有酵母菌纲(Saccharomycetes)存在差异。在根际土壤中显著富集且与非根际土壤存在显著差异的微生物类群仅有Glutinomyces和伞菌纲中目水平分类地位未知的类群(Unclassified_c_Agaricomycetes)，其余差异性真菌类群均属于非根际土壤[图 7(b)]。
3 讨论 3.1 两种树龄元宝山冷杉根际土壤微生物群落多样性分析土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，土壤微生物群落的多样性可以敏感地反映出植物生长、繁殖以及代谢活动的变化[30]。同时，土壤微生物种类和数量还可以作为评价土壤质量和肥力的指标[31-32]。植物根际作为植物与土壤进行物质能量交换的场所，是土壤中生化活性最强的区域[33]，植物通过根系向根际释放养分和特定的化学物质，从而驱动根际微生物群落的组装[34]。本研究探究了两种树龄元宝山冷杉根际与非根际土壤微生物多样性的变化规律，发现元宝山冷杉幼龄树根际土壤中细菌和真菌的丰富度与多样性均显著高于老龄树，且两种树龄土壤微生物群落组成差异显著，这与不同种植年限的宁夏枸杞(Lycium barbarum)[35]和南丰蜜橘[36]等的根际土壤微生物群落多样性变化存在相似规律。在茶树(Camellia sinensis)[37]和富贵竹(Dracaena sanderiana)[38]等植物的研究中也发现不同种植年限土壤细菌群落组分存在差异且多样性指数随种植年限的增加呈下降趋势，不同的是，茶树土壤真菌群落组分在不同年限中差异不明显且多样性指数无显著差异，而富贵竹根际土壤真菌Alpha多样性指数总体呈升高的趋势，这可能与植物类型不同有关。元宝山冷杉根际土壤中细菌相对丰度较高的是变形菌门、酸杆菌门和放线菌门，真菌中相对丰度较高的是担子菌门和子囊菌门，这与华重楼(Paris polyphylla var.chinensis)[39-41]、辣椒[42]等植物根际土壤微生物群落结构相似，表明元宝山冷杉根际土壤微生物群落具有一般土壤微生物群落组成的共性。
元宝山冷杉幼龄树根际土壤中细菌Ace、Chao1指数略高于真菌，而Shannon指数明显高于真菌，Simpson指数明显低于真菌，表明幼龄树根际土壤中细菌物种较真菌丰富，多样化程度更高，属于健康的“细菌型”土壤[42]。老龄树根际土壤中细菌Ace、Chao1和Shannon指数均明显高于真菌，而Simpson指数则明显低于真菌，表明所选老龄树根际土壤也属于健康的“细菌型”土壤。元宝山冷杉可能在不同生长发育时期对营养元素的偏好和吸收程度不同，其根系分泌物组成、分泌量和累积程度也存在着较大的差异，从而促进根际土壤中某些特定的微生物生长，如酸杆菌门、疣微菌门和RCP2-54等细菌门类以及担子菌门、被孢霉门等真菌门类，形成优势类群；同时元宝山冷杉的生长也会对某些微生物，如变形菌门、放线菌门、厚壁菌门、绿弯菌门和芽单胞菌门等细菌产生抑制作用，导致根际土壤微生物群落组成结构和多样性发生改变[14-15]。值得注意的是，随着元宝山冷杉老龄树的生长，如果其根际微生物丰富度与多样性仍持续降低，那么土壤则有由“细菌型”向“真菌型”转化的风险，可能会引起连作障碍，影响植物的生长，这可能也是老龄树易发生病虫害的原因。
3.2 两种树龄元宝山冷杉根际与非根际土壤微生物群落多样性分析植物根际微生物群落主要来源于水平迁移的非根际土壤微生物，因此非根际土壤是根际微生物群落的“发源地”[43-44]，植物根际微生物群落组成与非根际土壤微生物群落结构具有相似性[45]。在植物生长过程中，植物产生的次级代谢产物释放到土壤中，呈现出明显的根际聚集效应，从而引起植物根际土壤理化性质的改变，导致根际微生物较非根际有更大的变化[46-47]。元宝山冷杉幼龄树根际与非根际土壤中细菌和真菌群落组成相近，而老龄树根际与非根际土壤中细菌和真菌群落组成的差异较大，除真菌多样性差异不显著外，细菌和真菌丰富度、细菌多样性均显著低于非根际土壤。这可能是由于幼龄阶段元宝山冷杉产生的次级代谢产物较少或是根际效应时间短，对根际土壤理化性质的影响较小，进而未对土壤微生物的群落结构产生显著影响；而老龄树通过根系长期的根际效应向土壤中释放特定的化学物质，从非根际土壤中选择性富集微生物，促进周围环境微生物在根际土壤的特异性富集和定殖[48]，从而显著影响微生物群落的组成和结构。运用LEfSe分析综合比较元宝山冷杉根际与非根际土壤微生物的差异，发现元宝山冷杉非根际土壤中细菌和真菌群落具有更高的特异性、丰富性和多样性。郑梅霞等[41]的研究也表明七叶一枝花(Paris pohyphylla)非根际土壤细菌群落比根际土壤具有更高的丰富性和多样性，但于翠等[49]的研究则发现桑树根际土壤细菌数量、微生物代谢活性和多样性指数等均高于非根际土壤。本研究与前人研究结果既有相似之处又存在差异，可能是由于所选植物类型、植物所处生长发育时期、落叶和小环境等因素不同[14-15, 50]。
4 结论土壤微生物群落组成随着元宝山冷杉的生长发育而变化，幼龄树对土壤微生物的影响较小，细菌和真菌群落结构变化不显著；而老龄树对土壤微生物的影响较大，导致土壤中细菌和真菌群落结构发生显著变化。元宝山冷杉非根际土壤细菌和真菌群落具有更高的特异性、丰富性和多样性，而元宝山冷杉的定植也使其根际土壤形成了少量特异性的细菌和真菌群落。本研究结果初步探明了元宝山冷杉生长发育与土壤微生物环境的关系，为进一步保护元宝山冷杉提供了科学依据。
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