2. 延边林业科学研究院, 吉林延边 133001
2. Yanbian Forestry Science Research Institute, Yanbian, Jilin, 133001, China
粗茎鳞毛蕨(Dryopteris crassirhizoma)为鳞毛蕨科(Dryopteridaceae)鳞毛蕨属(Dryopteris)典型药用蕨类植物，生于海拔300-1 200 m的山地林下，主要分布于我国东北和华北地区，俄罗斯、朝鲜、日本也有分布[1-2]。粗茎鳞毛蕨以干燥根茎和叶柄残基入药，称作绵马贯众，具有止血、驱虫、抗疟疾、抗病毒等作用[3-6]，可持续开发前景广阔。在粗茎鳞毛蕨代谢组成分研究中，已明确其含间苯三酚类、黄酮类、萜类等多种成分。其中，间苯三酚类为标志性活性成分[2, 7-8]，且部分成分如绵马贯众素(ABBA)被证实有抗肿瘤功效[9]。然而，粗茎鳞毛蕨相关研究仍存在较多不足。一方面，粗茎鳞毛蕨代谢产物精准鉴定与分离技术亟待突破[10]，如间苯三酚类难分离纯化，市场多为绵马酸类混合物; 另一方面，粗茎鳞毛蕨代谢产物与其生长年限、产地等因素的动态变化规律及药效机制尚未明晰。
深入研究不同生长年限植物的代谢组成分，对阐明药效物质基础、明确最佳入药年限及指导优质药材培育意义重大。植物的代谢产物类型繁多、组分复杂，传统的单一检测手段往往难以全面表征植物的代谢信息。近年来，随着代谢组学技术及其衍生技术的发展，大量植物的代谢产物实现了从定性分析到定量分析的跨越。目前，靶向代谢组学技术及其衍生技术已被广泛应用于各类植物的种间代谢组分差异分析，为植物资源的品种鉴别、优质种质筛选提供了精准的代谢层面依据[11-14]。药用植物生长年限往往会影响其药用成分含量。但以往粗茎鳞毛蕨相关研究仅提到秋季为其最佳采收期[7, 15]，尚未有文献提及其不同生长年限药用成分动态变化及最佳采收年限。本研究以人工栽培的粗茎鳞毛蕨植株根系为材料，拟运用代谢组学技术，从生长年限维度分析2-4年生粗茎鳞毛蕨根系代谢产物积累差异，筛选关键差异代谢产物，解析其随生长进程的变化规律，为其药用成分形成规律和优化药材利用等方面提供理论依据，推动其资源合理开发与药效深度挖掘。
1 材料与方法 1.1 样品采集2022年10月，于长春森林植物园采集人工栽植的2、3、4年生粗茎鳞毛蕨，去除植株表面泥土后，取其根系部分备用。依照生长年限(2、3、4年)，依次设定C2、C3、C4组，每组设置3个重复(C2：C2-1、C2-2、C2-3;C3：C3-1、C3-2、C3-3;C4：C4-1、C4-2、C4-3)，每个重复取3个植株的根系。
1.2 数据处理基于超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)检测平台及武汉迈特维尔生物科技有限公司自建数据库进行分析，具体色谱及质谱条件参考陈秀萍等[16]的研究。代谢产物含量数据采用UV(Unit variance scaling)处理。根据表达倍数筛选差异代谢物，对差异倍数进行log2(FoldChange)处理。间苯三酚类物质相对含量数据采用SPSS Statistics 26软件进行分析，同时用最小显著差异法(LSD)进行多重比较，差异显著性水平P<0.05。主成分分析采用R软件(www.r-project.org/)内置的统计函数(prcomp)对数据进行UV处理(参数scale=True)。通过R软件进行层次聚类分析，ComplexHeatmap 2.8.0绘制热图。
2 结果与分析 2.1 共有代谢产物组成分析对2-4年生粗茎鳞毛蕨进行定性分析，检测到13类1 532种共有代谢产物，包括236种氨基酸及其衍生物(占共有代谢产物总数的15.40%)；209种脂质(13.64%); 203种酚酸类(13.25%); 165种黄酮类(10.77%); 102种萜类(6.66%)；等等(图 1)。氨基酸及其衍生物、脂质、酚酸类、黄酮类占比高，为主要代谢产物。
|
| 图 1 粗茎鳞毛蕨代谢产物的成分组成 Fig. 1 Category composition of the metabolites of D. crassirhizoma |
2.2 共有代谢产物主成分分析
为探究2-4年生粗茎鳞毛蕨代谢产物积累差异，对3组样本开展主成分分析(图 2)。PC1、PC2解释率分别为43.77%、23.25%，二者共同解释了主要差异。2、3、4年生粗茎鳞毛蕨各自聚为相对独立簇群，说明不同生长年限的粗茎鳞毛蕨代谢产物谱存在明显差异。组内样品点距离近，说明组内代谢产物谱一致性良好，生物学重复可靠。质控样本聚集程度高，说明实验过程中仪器稳定性与方法重复性佳，数据可靠，可为不同生长年限样品代谢产物差异分析提供坚实支撑。
|
| QC stands for quality control group, which consists of three repetitions: QC-1, QC-2 and QC-3. 图 2 粗茎鳞毛蕨代谢产物主成分分析 Fig. 2 Principal component analysis in the metabolites in D. crassirhizoma |
2.3 共有代谢产物层次聚类分析
对2-4年生粗茎鳞毛蕨代谢产物的积累模式进行层次聚类分析，结果如图 3所示。不同分组(C2、C3、C4)组间代谢产物差异明显，而组内重复性较好。
|
| Class represents primary classification of substances. 图 3 粗茎鳞毛蕨代谢产物层次聚类分析 Fig. 3 Hierarchical cluster analysis of the metabolites in D. crassirhizoma |
2.4 差异代谢产物数量分析
对2-4年生粗茎鳞毛蕨进行定量分析，结果表明，随着生长年限增加，差异代谢产物数量逐渐增多。与2年生相比，3年生粗茎鳞毛蕨有172种代谢产物含量差异显著，占共有代谢产物的11.23%，其中117种差异代谢产物含量降低，55种差异代谢产物含量升高；与2年相比，4年生粗茎鳞毛蕨有400种代谢产物差异显著，占共有代谢产物的26.11%，其中271种差异代谢产物含量降低，129种差异代谢产物含量升高；与3年生相比，4年生粗茎鳞毛蕨有446种代谢产物差异显著，占共有代谢产物的29.11%，其中270种差异代谢产物含量降低，176种差异代谢产物含量升高(表 1)。
| 编号 No. |
差异比较组 Groups for comparison |
差异代谢产物数量 Number of differential metabolites |
下调代谢产物数量 Number of down-regulated metabolites |
上调代谢产物数量 Number of up-regulated metabolites |
| 1 | C2 vs C3 | 172 | 117 | 55 |
| 2 | C2 vs C4 | 400 | 271 | 129 |
| 3 | C3 vs C4 | 446 | 270 | 176 |
| Note：the number of up-regulated and down-regulated metabolites in No.1 and No.2 were calculated based on C2, while those in No.3 were calculated based on C3. | ||||
2.5 差异代谢产物差异倍数分析
依据表达倍数筛选出差异倍数排名前20的差异代谢产物，并对差异倍数进行log2(FoldChange)转换处理，比较其差异倍数变化情况，结果表明：与2年生相比，3年生粗茎鳞毛蕨有10种代谢产物的差异倍数增加，分别是7种萜类、2种其他类和1种黄酮类，有10种代谢产物的差异倍数降低，分别是2种酚酸类、2种氨基酸及其衍生物、2种黄酮类、2种其他类、1种萜类和1种有机酸[图 4(a)]；与2年生相比，4年生粗茎鳞毛蕨有7种代谢产物差异倍数增加，分别是4种萜类、1种黄酮类、1种氨基酸及其衍生物和1种核苷酸及其衍生物，有13种代谢产物的差异倍数降低，分别是5种氨基酸及其衍生物、3种萜类、2种生物碱、2种其他类和1种黄酮[图 4(b)]；与3年生相比，4年生粗茎鳞毛蕨有7种代谢产物的差异倍数增加，分别是2种黄酮类、1种有机酸、1种氨基酸及其衍生物、1种核苷酸及其衍生物、1种脂质和1种其他类；有13种代谢产物差异倍数降低，分别是5种氨基酸及其衍生物、3种萜类、2种生物碱、2种其他类和1种黄酮类[图 4(c)]。
|
| Red represents upregulation of metabolite content, while green represents downregulation of metabolite content. 图 4 粗茎鳞毛蕨差异代谢产物的差异倍数对比 Fig. 4 Comparison of the fold changes of differential metabolites in D. crassirhizoma |
2.6 差异代谢产物活性成分分析
根据差异代谢产物中活性成分含量，对不同生长年限粗茎鳞毛蕨进行排序，2年生粗茎鳞毛蕨代谢产物中有1种黄酮(鼠李素-3-O-葡萄糖苷)、6种萜类[乙酰戊烯醇酸、Phyllanflexoid A、8-O-乙酰哈巴苷、布卢门醇C、Tricalysioside R、(6R, 9R)-3-氧代-α-紫罗兰醇-β-D-葡萄糖苷]、4种酚酸类(间苯三酚-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、间苯三酚、对甲氧基肉桂酸乙酯、3-异戊烯基-4-O-葡萄糖氧基-4-羟基苯甲酸)含量高于3、4年生粗茎鳞毛蕨；3年生粗茎鳞毛蕨代谢产物中有2种萜类(Karaviloside Ⅹ Ⅲ、Momordicoside Ⅴ)、1种酚酸类(丁香醛)含量高于2、4年生粗茎鳞毛蕨；4年生粗茎鳞毛蕨中有3种黄酮类(5-羟基-3,7,3′,4′-四甲氧基黄酮、7,8-二羟基-5,6,4′-三甲氧基黄酮、3′,4′-二羟基-7,5′-二甲氧基黄酮)、1种萜类[2,3-二羟基齐墩果-11, 13(18)-二烯-28-酸(脱氢山楂酸)]代谢产物含量高于2、3年生粗茎鳞毛蕨(表 2)。黄酮类、萜类等活性成分呈现明显的生长阶段性积累特征。
| 类别 Category |
活性成分 Active ingredient |
排序 Rank |
| Flavonoids | 5-Hydroxy-3,7,3′,4′-tetramethoxyflavone | C4＞C2＞C3 |
| 7,8-Dihydroxy-5,6,4′-trimethoxyflavone | C4＞C2＞C3 | |
| 3′,4′-Dihydroxy-7,5′-dimethoxyflavone | C4＞C2＞C3 | |
| Rhamnetin-3-O-Glucoside | C2＞C3＞C4 | |
| Terpenoids | Acetylvalerenolic acid | C2＞C4＞C3 |
| 2,3-Dihydroxyoleana-11,13(18)-dien-28-oic acid | C4＞C3＞C2 | |
| Phyllanflexoid A | C2＞C4＞C3 | |
| 8-O-Acetylharpagide | C2＞C3＞C4 | |
| Blumenol C | C2＞C4＞C3 | |
| Tricalysioside R | C2＞C4＞C3 | |
| Karaviloside ⅩⅢ | C3＞C2＞C4 | |
| (6R,9R)-3-Oxo-α-ionol-β-D-glucoside | C2＞C3＞C4 | |
| Momordicoside Ⅴ | C3＞C2＞C4 | |
| Phenolic acids | Phloroglucinol-1-O-β-D-glucopyranoside | C2＞C4＞C3 |
| Phloroglucinol | C2＞C3＞C4 | |
| Syringaldehyde | C3＞C2＞C4 | |
| (E)-Ethyl p-methoxycinnamate | C2＞C3＞C4 | |
| 3-Prenyl-4-O-glucosyloxy-4-hydroxybenzoic acid | C2＞C4＞C3 |
2.7 间苯三酚类物质相对含量分析
对2-4年生粗茎鳞毛蕨中的5种间苯三酚类物质相对含量进行差异性分析，结果表明：间苯三酚、绵马酚和去甲绵马素PB相对含量随着生长年限的增加呈降低的趋势，间苯三酚组间差异显著(P<0.05)，间苯三酚-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和去甲绵马素AB的相对含量组间无显著差异(表 3)。
| 间苯三酚类 Phloroglucinols |
相对含量 Relative content |
差异性 Difference |
||
| C2 | C3 | C4 | ||
| Phloroglucinol | 22 833 333±1 006 645a | 20 700 000±793 725b | 4 643 333±205 020c | C2＞C3＞C4* |
| Phloroglucinol-1-O-β-D-glucopyranoside | 104 000±25 865a | 85 400±17 874a | 69 133±17 465a | |
| Aspidinol | 483 000±143 656a | 124 900±28 352b | 73 967±18 882b | C2＞C3* C2＞C4* |
| Desaspidin PB | 2 130 000±807 217a | 687 667±153 728b | 396 333±92 219b | C2＞C3* C2＞C4* |
| Desaspidin AB | 18 700 000±9 006 664a | 18 766 667±4 834 598a | 9 256 667±3 010 753a | |
| Note: relative content is expressed in terms of peak area, and the values are mean±standard deviation; different lowercase letters indicate significant differences in the same indicator between group; * indicates significant difference (P<0.05). | ||||
3 讨论
本研究发现2-4年粗茎鳞毛蕨根系有13类1 532种共有代谢产物，有多种绵马贯众的主要药用成分，但其组成及含量在不同生长年限的样本间存在一定的差异。这可能是代谢产物具有样本特异性导致的[17-21]。也有研究表明，代谢产物成分与含量存在差异的本质是植物基因型与生长发育阶段、环境因素共同作用的结果。在不同的处理或生物过程中，代谢产物组成也会发生改变[22-23]。但是，通过代谢产物组成含量分析，仍可以从整体上考察样本中的主要代谢产物分布情况[24]。
粗茎鳞毛蕨的代谢产物含量随生长年限呈现动态变化，其中萜类和黄酮类成分的积累模式可能与植物次生代谢调控机制相关。研究表明，萜类在植物防御和适应环境中起重要作用，其含量增加可能反映植株成熟后的生理需求[25]。间苯三酚类是粗茎鳞毛蕨的传统活性成分，但其含量随生长年限增加而降低，这可能与资源利用效率相关。以往的研究也提到，不同生境下的蕨类植物间苯三酚类成分存在明显差异，并推测植株生长年限可能影响代谢通路对环境胁迫的响应能力，从而间接调控成分含量[26]。而随着植株生长成熟，代谢资源可能向更复杂的次生代谢倾斜，导致间苯三酚类合成通路的资源分配减少。根据本研究结果，2年生粗茎鳞毛蕨可能更适合作为间苯三酚类成分的提取来源。4年生粗茎鳞毛蕨中部分黄酮和萜类成分的富集，可能增强其抗氧化或抗肿瘤活性，其药理机制值得进一步研究[27-28]。这一规律为粗茎鳞毛蕨的定向采收提供了直接依据。此外，本研究未检测到绵马酸、绵马素、二十六烷酸、二十五烷醇等物质，与前人研究结果[4, 7]存在差异。这一差异可能源于多重因素：一方面，生长年限是关键影响因子，已有研究表明药用植物代谢产物的检测丰度与植株生长年限密切相关，部分成分可能在更长年限的植株中才达到检测阈值[26]；另一方面，检测技术的特异性差异也可能导致结果分化，本研究采用的UPLC-MS/MS平台与武汉迈特维尔生物科技有限公司自建数据库，在代谢产物定性的精准度与覆盖度上与传统检测方法存在差异[16]，且间苯三酚类成分分离难等特性可能导致部分同系物未被有效鉴定[10]。此外，栽培环境中的土壤养分、水分条件等细微差异，也可能通过调控代谢通路影响特定成分的积累[22-23]，这一问题有待长期跟踪试验与多产地样品验证。
在间苯三酚类核心活性成分中，间苯三酚、绵马酚、去甲绵马素PB的相对含量随生长年限增加显著降低，其积累与植株早期生长阶段相关，而间苯三酚-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和去甲绵马素AB无显著差异。若以间苯三酚类为主要目标成分，建议优先采收2年生植株根系；若需综合利用萜类或其他成分，可尝试延长采收年限至3、4年，且4年生植株的特征黄酮类成分具有进一步开发潜力。通过调控生长周期高效获取特定活性成分，可进一步推动资源高效利用。
4 结论本研究基于UPLC-MS/MS广泛靶向代谢组学技术，分析了不同生长年限粗茎鳞毛蕨根系代谢产物的动态变化规律，结果表明，2-4年生粗茎鳞毛蕨共鉴定出13类1 532种共有代谢产物，涵盖氨基酸及其衍生物、脂质、酚酸类、黄酮类、萜类等多个成分，其中氨基酸及其衍生物占比最高。主成分分析和聚类分析显示，不同生长年限粗茎鳞毛蕨代谢产物谱差异显著且组内重复性较好。随着生长年限增加，差异代谢产物数量逐渐增多，黄酮类、萜类等活性成分呈现明显的生长阶段性积累特征。本研究明确了不同生长年限植株根系代谢产物的差异及药用价值，为粗茎鳞毛蕨最佳入药年限确定和优质药材培育提供了理论依据。
| [1] |
林红梅, 韩忠明, 吴劲松, 等. 粗茎鳞毛蕨种群形态性状及其生态可塑性的研究[J]. 吉林农业大学学报, 2006, 28(4): 398-401, 406. |
| [2] |
黄玉阳, 邓瑞雪, 高嘉屿, 等. 绵马贯众中新间苯三酚类化合物[J]. 中国药学杂志, 2022, 57(4): 269-271. |
| [3] |
陈红云, 刘光明, 石武祥, 等. 中药贯众的研究进展[J]. 大理学院学报(自然科学), 2006, 5(6): 75-77. |
| [4] |
高增平, 李瑞峰, 王宝华, 等. 鳞毛蕨属植物化学成分研究进展[J]. 中国实验方剂学杂志, 2003, 9(3): 50-55. |
| [5] |
闫艳韬, 王娟, 耿东浩, 等. 绵马贯众中间苯三酚类化合物抗H1N1流感病毒神经氨酸酶的活性成分筛选[J]. 北京中医药大学学报, 2018, 41(1): 71-75. |
| [6] |
萨楚拉, 敖敦格日乐. 蒙药绵马贯众的药理作用研究进展[J]. 中国民族医药杂志, 2020, 26(8): 63-66. |
| [7] |
郑皓, 梁勇满, 许亮, 等. 药用植物粗茎鳞毛蕨的研究进展[J]. 中国中医药现代远程教育, 2017, 15(17): 154-156. |
| [8] |
王研加. 粗茎鳞毛蕨化学成分鉴定及其生物活性研究[D]. 哈尔滨: 哈尔滨师范大学, 2023.
|
| [9] |
金哲. 粗茎鳞毛蕨绵马贯众素ABBA的提取及其抗肿瘤活性的研究[D]. 哈尔滨: 东北农业大学, 2015.
|
| [10] |
祁燕, 贾小舟, 郑银丽, 等. 绵马贯众中间苯三酚类化合物分离及其抑菌活性研究[J]. 中草药, 2017, 48(23): 4860-4864. |
| [11] |
杨琳琳, 柴建新, 陈强, 等. 基于LC-MS代谢组学技术的不同采收期黄芩叶化学成分比较研究[J]. 山西医科大学学报, 2020, 51(11): 1244-1254. |
| [12] |
韦小兰, 张凤媛, 曹科鑫, 等. 基于广泛靶向代谢组学的鸡骨草和毛鸡骨草藤茎成分差异分析[J/OL]. 分子植物育种, 2022: 1-12[2025-07-01]. https://kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20220602.1905.020.html.
|
| [13] |
李晓东, 姜涛, 温春秀, 等. 基于靶向代谢组学的不同种质连翘代谢产物分析[J/OL]. 分子植物育种, 2023: 1-16[2025-07-01]. https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CJFD&dbname=CJFD&filename=FZZW20230713002.
|
| [14] |
LAU W, SATTELY E S. Six enzymes from mayapple that complete the biosynthetic pathway to the etoposide aglycone[J]. Science, 2015, 349(6253): 1224-1228. DOI:10.1126/science.aac7202 |
| [15] |
赵孟娟, 金光泽, 刘志理. 阔叶红松林下典型蕨类经济策略的季节变化[J]. 应用生态学报, 2024, 35(12): 3315-3322. |
| [16] |
陈秀萍, 苏文炳, 蒋际谋, 等. 基于UPLC-MS/MS的枇杷不同组织萜类代谢物鉴定[J]. 果树学报, 2022, 39(11): 2099-2112. |
| [17] |
李晓科. 大同黄花菜花蕾发育过程中代谢成分的发生机制及抗抑郁成分研究[D]. 太原: 山西大学, 2024.
|
| [18] |
王向东, 马艳芝, 张胜珍, 等. 基于广泛靶向代谢组学的不同干燥方式丹参成分差异分析[J]. 河北农业大学学报, 2023, 46(3): 120-129. |
| [19] |
刘晴晴. 基于拟靶向代谢组学研究不同品种及生长期桑葚品质差异[D]. 镇江: 江苏科技大学, 2022.
|
| [20] |
刘锋. 不同种重楼间的差异蛋白质组学和代谢组学研究[D]. 北京: 军事科学院, 2019.
|
| [21] |
刘晓, 齐迎春, 张利超, 等. 防风抽薹质量、生理特性及代谢组比较研究[J/OL]. 吉林农业大学学报, 2025: 1-14[2025-07-01]. https://link.cnki.net/doi/10.13327/j.jjlau.2025.0118.
|
| [22] |
刘晴晴, 李勇, 张明霞, 等. 紫色桑葚和白色桑葚总酚含量、抗氧化能力及代谢指纹图谱差异分析[J]. 江苏农业学报, 2022, 38(3): 813-820. |
| [23] |
方贤胜, 吴涛, 肖良俊. 基于广泛靶向代谢组学的浅黄色和紫色核桃内种皮成分差异分析[J]. 食品科学, 2021, 42(12): 215-221. |
| [24] |
WISHART D S. Metabolomics: applications to food science and nutrition research[J]. Trends in Food Science & Technology, 2008, 19(9): 482-493. |
| [25] |
薛永常, 王贺贤, 赵娣, 等. 植物萜类化合物生物合成及其功能研究进展[J]. 植物研究, 2025, 45(4): 479-490. |
| [26] |
SOCOLSKY C, BORKOSKY S A, HERNÁNDEZ DE TERÁN M, et al. Phloroglucinols from the argentine ferns Elaphoglossum gayanum and E. piloselloides[J]. Journal of Natural Products, 2010, 73(5): 901-904. DOI:10.1021/np1000208 |
| [27] |
曹海峰, 赵志礼, 嘎务. 藏药"龙胆花"研究进展[J]. 中药材, 2014, 37(6): 1087-1093. |
| [28] |
田民义. 姜科挥发油及其萜类成分抗肿瘤活性及相关机制研究[D]. 贵阳: 贵州大学, 2021.
|