2. 黑龙江省森林植物园, 黑龙江哈尔滨 150036
2. Heilongjiang Forest Botanical Garden, Harbin, Heilongjiang, 150036, China
脓毒症是一种由感染引发的、复杂的全身性炎症性疾病[1]。研究表明，全球每年脓毒症患者超过1 900万例，其中约有600万患者死亡，致死率超过30%，脓毒症会引发患者器官功能障碍，约有300万幸存患者还存在认知功能障碍，严重影响生活质量[2-4]。因此，探索用于治疗脓毒症的药物及其作用机制，对降低脓毒症的致死率和改善患者病情具有重要的理论和现实意义。
脓毒症通常伴随着促炎细胞因子的过度释放，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素家族成员[如白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素17(IL-17)]，以及HMGB1蛋白，这些因子的过量释放会导致炎症在全身扩散，引起组织和器官功能障碍[5-6]。HMGB1可以被释放到细胞外环境，并与靶细胞表面的主要受体——Toll样受体(TLRs)结合[7]，从而激活下游信号通路，引发炎症反应[8]。受到刺激后，TLR4可识别并与胞外的MyD88结合[9]，继而激活NF-κB信号通路[10]，这两个通路可调控多种靶基因的表达[11]，如TNF-α、IL-1β和IL-6[12-14]，由此产生过量的促炎细胞因子和趋化因子，从而引发炎症反应[8]。研究表明，天然多糖可调节多种生物学反应，尤其在免疫反应中表现突出[15]。Chen等[16]的研究发现，羊栖菜(Hizikia fusiforme)多糖可激活NF-κB通路，促进腹腔巨噬细胞分泌细胞因子，从而发挥免疫调节作用。
多糖是植物中重要的活性成分，具有广泛的药理作用[17]，它参与机体的多种生理代谢过程，是天然药物[18]和保健品[19]开发中的重要组成部分。槲蕨(Drynaria roosii)隶属于水龙骨科(Polypodiaceae)槲蕨属(Drynaria)植物，药用历史悠久，其干燥根茎是治疗跌打损伤的重要植物药源之一[20]。槲蕨的化学成分主要包括脂溶性、醇溶性及挥发性成分，主要活性成分为柚皮苷[21]。从槲蕨根中分离得到的槲蕨多糖(Drynaria roosii Polysaccharide，DRP)具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤和抗病毒等多种生物活性[20]，但其作用机制尚不明确。因此，本研究通过设计对照实验，建立盲肠结扎穿孔(CLP)诱导的小鼠脓毒症模型，检测小鼠生存率、炎症因子相关基因表达水平，以及HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白的表达变化，旨在探究DRP对CLP诱导脓毒症的分子作用机制，有助于进一步发挥中医药在临床治疗中的独特优势。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 植物材料植物材料(图 1)采自湖南省娄底市娄星区双江乡洪家山森林公园(27.936 8°N，111.977 4°E，海拔296 m)，经陕西省西安植物园科研助理唐剑泉鉴定为水龙骨科(Polypodiaceae)槲蕨(Drynaria roosii)。
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| (a) Habitat picture; (b)-(e) Morphological detail pictures. 图 1 槲蕨生境及形态细节 Fig. 1 Habitat and morphological details of D. roosii |
1.1.2 动物材料
选取健康雌性KM小鼠[许可证编号: SCXK(吉)2018-0007，长春亿斯实验动物技术有限责任公司]40只，每只体质量为(26±2) g。小鼠分笼饲养，自由饮水进食，饮用水每日换1次，垫料每周更换1-2次。
1.2 方法 1.2.1 DRP的制备将槲蕨根洗净后置于电热鼓风干燥箱(SG-81，雅马拓科学株式会社)中，65 ℃干燥，粉碎过筛，用石油醚脱脂。按1∶4(g/mL)的比例加入90%乙醇溶液，去除脂类和色素，过滤后干燥，浸泡于蒸馏水(1∶10，g/mL)中12 h，85 ℃浸提3次，每次2 h。提取液经0.2 μm滤膜过滤后，使用大型旋转蒸发仪(Hei-VAP Industrial RC，德国Heidolph公司)60 ℃真空浓缩至原体积的30%。用Sevage试剂(氯仿∶正丁醇=5∶1)去除蛋白后，在浓缩液中加入4倍体积的95%乙醇溶液，4 ℃静置12 h，10 000 r/min离心30 min，将沉淀冷冻干燥后即得槲蕨粗多糖(CDRP)[22]。
取1 g粗多糖溶于40 mL蒸馏水中，4 500 r/min离心15 min，取上清液上样于已平衡的阴离子交换DEAE纤维素柱(50 cm×2.6 cm)中，用0.2 mol/L NaCl溶液洗脱(流速0.4 mL/min，每管收集40 mL)。采用苯酚-硫酸法测定多糖浓度。将洗脱峰部分透析(Sephadex G-200凝胶柱，1.6 cm×40 cm)72 h(4 ℃蒸馏水)，60 ℃减压浓缩后冷冻干燥，获得纯化多糖，于4 ℃密封保存备用[23-24]。
1.2.2 均一性与分子量测定采用高效凝胶渗透色谱(HPGPC，LC-10A，岛津制作所)系统，配备色谱柱(TSK-GEL 4000，7.8 mm×300 mm)和折射率检测器(RID-10A)测定DRP的分子量。用0.1 mol/L NaNO3缓冲液(0.3% g/mL)等度洗脱，流速0.5 mL/min，柱温25 ℃。以不同分子量的葡聚糖(5、12、50、150、270、410 kDa)为标准品绘制标准曲线，方程为lgMw=-0.352t+10.962(R2=0.999 5)。
1.2.3 单糖组成分析采用高效液相色谱(HPLC)法测定单糖组成。取10 mg多糖样品，加入10 mL 2 mol/L三氟乙酸(TFA)，于电热鼓风干燥箱中110 ℃水解6 h，衍生化后用Thermo HPLC系统[Agilent 1260，安捷伦科技(中国)有限公司]进行分析，色谱柱为Agilent EC-C18(4.6 mm×150 mm，2.7 μm)。以D-木糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-阿拉伯糖、L-鼠李糖为标准品，同法测定。
1.2.4 FT-IR分析采用FT-IR光谱仪[FTS135，伯乐生命医学产品(上海)有限公司]测定纯化DRP的红外光谱。将DRP与溴化钾(KBr)粉末研磨压片，在4 000-400 cm-1范围内扫描，分析光谱中不同波峰代表的官能团。
1.2.5 实验动物与方案采用CLP构建小鼠脓毒症模型：将小鼠用异氟醚麻醉(1%-3%异氟醚和氧气混合气体经鼻锥吸入)后，开腹暴露盲肠，结扎后用22 G或25 G针头穿刺2次，回纳肠内容物，双层缝合腹膜与皮肤，皮下注射1 mL生理盐水复苏[25-26]。
小鼠随机分为4组(n=11)：对照(Control)组(开腹后缝合，不结扎和穿孔，腹腔注射等体积生理盐水)、CLP组(腹腔注射等体积生理盐水)、CDRP+CLP组(前7 d依据体质量腹腔注射CDRP 3 mg/kg)、DRP+CLP组(前7 d依据体质量腹腔注射DRP 3 mg/kg)。观察记录各组小鼠96 h内存活率；各组小鼠眼球取血，血样离心10 min(4 ℃ 3 000 r/min)，于-80 ℃保存。将小鼠颈椎脱臼处死后取材。
1.2.6 形态学检查与组织学分析取小鼠肺、肠道和脾脏组织，经脱脂处理后置于PBS缓冲液中冰浴数分钟，随后以10%中性福尔马林溶液固定过夜。样本依次经70%、95%、100%、100%的乙醇梯度脱水后，使用二甲苯透明处理，石蜡包埋后制成4 μm切片，经苏木精-伊红(HE)染色后，使用光学显微镜(OLYMPUS BX53，奥林巴斯株式会社)观察组织形态学变化。
1.2.7 实时定量PCR(qRT-PCR)采用Trizol试剂[Takara，宝日医生物技术(北京)有限公司]和脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase Ⅰ)提取植物组织的RNA，将1 μg总RNA按说明书反转录为cDNA。引物序列见表 1，qRT-PCR反应体系(20 μL)包括0.2 μg cDNA、10 μL 2×SYBR反应混合液、4×10-7 mol/L引物。反应条件如下：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法计算相对基因表达量，β-肌动蛋白为内参蛋白。
| 基因 Gene |
引物序列(5′-3′) Primer sequence (5′-3′) |
| IL-17 | Forward: 5′-GTCCAAACACTGAGGCCAAG-3′ |
| Reverse: 5′-AGCTTCCCAGATCACAGAGG-3′ | |
| Il-23 | Reverse: 5′-AGCTTCCCAGATCACAGAGG-3′ |
| Reverse: 5′-TCAGTGCTACAATCTTCTTCAGAGGAC-3′ | |
| IL-6 | Forward: 5′-GAACTCCTTCTCCACAAGCGCCTT-3′ |
| Reverse: 5′-CAAAAGACCAGTGATGATTTTCACCAGG-3′ | |
| IL-1β | Forward: 5′-CCATGGCACATTCTGTTCAAA-3′ |
| Reverse: 5′-GCCCATCAGAGGCAAGGA-3′ | |
| IL-10 | Forward: 5′-TGCCTTCAGCCAGGTGAAGACTTTC-3′ |
| Reverse: 5′-CTTGATTTCTGGGCCATGCTTCTCTG-3′ | |
| TNF-α | Forward: 5′-GGAAACCCAGAGGCATTGAC-3′ |
| Reverse: 5′-TCAGGATCTGGCCCTTGAAC-3′ | |
| β-actin | Forward：5′-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′ |
| Reverse: 5′-GGTACCACCATGTACCCAGG-3′ |
1.2.8 酶联免疫吸附实验(ELISA)
采用ELISA试剂盒(英国Abcam公司)检测血清中IL-1β(ab197742)、TNF-α(ab208348)、IL-6(ab222503)、白细胞介素10(IL-10，ab255729)水平。具体步骤如下：血清与标准品加入预包被96孔板中，于25 ℃孵育1 h；洗板3次后加显色液，终止反应后用酶标仪[Thermo Scientific Multiskan Sky，51119700C，赛默飞世尔科技(中国)有限公司]测定450 nm处的吸光度值(OD值)，通过标准曲线计算蛋白浓度。
1.2.9 免疫印迹分析(Western blot分析取小鼠的脾脏组织，用细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0027，上海碧云天生物技术有限公司)分离核蛋白与胞质蛋白。等量蛋白经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后转至硝酸纤维素膜，使用5%脱脂奶粉溶解在TBST缓冲液中封闭，4 ℃孵育一抗(HMGB1、TLR4、NF-κB、MyD88、IKKα、IKKβ，1∶1 000)过夜。使用TBST缓冲液洗膜30 min后，将硝酸纤维素印迹与HRP偶联的二抗(IgG，1∶1 000)室温下孵育2 h，采用Uvitec Alliance Q9成像系统扫描条带，用ImageJ软件分析灰度值，β-肌动蛋白、组蛋白H3为内参蛋白。
1.2.10 统计分析使用Excel 2023处理数据，采用GraphPad Prism 8.0绘图。实验重复至少3次，结果以平均值±标准误差(SEM)表示，组间差异采用单因素方差分析(One-way ANOVA)和t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果与分析 2.1 DRP的化学组成DRP的FT-IR光谱图如图 2(a)所示，3 399.11、2 931.11 cm-1处的强吸收峰分别对应O-H和C-H伸缩振动，提示多糖链间及链内存在分子间相互作用；1 612.40 cm-1峰可能为C=O或COO-伸缩振动；1 400.93 cm-1附近峰为C=O或C=C伸缩振动；1 266.13 cm-1为不对称羰基伸缩振动；1 100-1 010 cm区间的两个吸收峰提示可能存在吡喃环结构；861.23 cm-1特征峰为β-糖苷键连接。
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| 图 2 DRP的化学组成 Fig. 2 Chemical composition of DRP |
DRP的凝胶渗透色谱图如图 2(b)所示，DRP均一性良好，平均分子量为197.15 kDa。HPLC图如图 2(c)所示，DRP主要由甘露糖(5.41%)、葡萄糖(32.41%)、阿拉伯糖(6.85%)、半乳糖(18.25%)和鼠李糖(21.17%)组成。
2.2 DRP对小鼠存活率的影响96 h内小鼠存活率的结果如图 3所示。Control组、CLP组、CDRP+CLP组、DRP+CLP组72 h的存活率分别为100.00%、45.46%、72.73%、90.91%。与Control组相比，CLP组的存活率明显降低；与CLP组相比，DRP+CLP组的存活率明显升高，表明DRP可显著降低CLP诱导的脓毒症小鼠的死亡率。
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| 图 3 DRP对小鼠存活率的影响 Fig. 3 Effect of DRP on the survival rate of mice |
2.3 小鼠肺、肠道及脾脏HE染色组织学评价
小鼠肺、肠道、脾脏组织的HE染色结果如图 4所示。Control组肺泡结构完整，腔内无渗出及炎症细胞浸润；CLP组肺组织结构破坏明显，肺泡大小不一，炎症细胞浸润显著；CDRP+CLP组和DRP+CLP组上述损伤显著减轻，且DRP+CLP组效果更优。CLP组肠绒毛高度和肠壁厚度均低于Control组(P<0.05)；DRP+CLP组肠绒毛高度和肠壁厚度均高于CLP组(P<0.05)，与Control组相比无显著差异(P>0.05)。Control组脾脏结构清晰、无充血；CLP组脾脏出现不同程度充血、炎症细胞浸润；与CLP组相比，CDRP+CLP组和DRP+CLP组上述损伤显著缓解。结果表明，DRP可有效改善脓毒症小鼠肺和肠道的损伤。
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| *P<0.05 compared with control group, #P<0.05 compared with CLP group. 图 4 小鼠肺、肠道和脾脏的HE染色组织学评价 Fig. 4 Histology evaluation by HE staining of mouse lung, intestine and spleen |
2.4 DRP对小鼠脾脏炎症相关细胞因子基因表达的影响
小鼠脾脏炎症相关细胞因子基因表达的结果如图 5所示。CLP组IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、TNF-α的基因表达均显著高于Control组(P<0.05)；DRP+CLP组IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、TNF-α的基因表达均显著低于CLP组(P<0.05)，与Control组无显著差异(P>0.05)。此外，DRP+CLP组IL-10的基因表达显著高于CLP组(P<0.05)。结果表明，DRP可通过上调抗炎因子IL-10基因的表达，并抑制促炎因子IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、TNF-α基因的释放来减轻炎症损伤。
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| *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with CLP group. 图 5 DRP对小鼠脾脏炎症相关细胞因子基因表达的影响 Fig. 5 Effects of DRP on mRNA levels inflammation-related cytokines in mouse spleen |
2.5 DRP对小鼠血清炎症相关细胞因子蛋白浓度的影响
小鼠血清炎症相关细胞因子蛋白水平的检测结果如图 6所示。CLP组IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白浓度显著高于Control组(P<0.05)；DRP+CLP组IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白浓度显著低于CLP组(P<0.05)，与Control组相比无显著差异(P>0.05)。同时，DRP+CLP组IL-10蛋白浓度显著高于CLP组(P<0.05)。结果表明，DRP可通过增加血清抗炎因子IL-10蛋白浓度来抑制促炎因子释放。
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| *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with CLP group. 图 6 DRP对小鼠血清炎症相关细胞因子蛋白浓度的影响 Fig. 6 Effects of DRP on the protein concentration of inflammation-related cytokines in mouse serum |
2.6 小鼠脾脏HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路蛋白表达
小鼠脾脏HMGB1/TLR4/NF-κB通路关键蛋白的表达结果如图 7所示。CLP组HMGB1、TLR4、NF-κB、MyD88、IKKα和IKKβ蛋白的表达显著高于Control组(P<0.05)；DRP+CLP组上述蛋白的表达显著低于CLP组(P<0.05)，与Control组相比无显著差异(P>0.05)，表明DRP可能通过抑制HMGB1的释放，阻断HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路，从而减轻炎症反应。
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| *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with CLP group. 图 7 小鼠脾脏HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路蛋白表达 Fig. 7 Expression of proteins involved in HMGB1/TLR4/NF-κB signaling pathway in mouse spleen |
3 讨论
脓毒症是由感染引发的全身炎症反应综合征(SIRS)[27]。近年来，对脓毒症病理机制的研究不断深入，免疫失衡是其核心致病机制之一[28]。已有研究表明，他汀类药物[29-30]、维生素C[31]、乌司他丁[32]、雷帕霉素[33]等可通过抑制炎症因子释放来治疗脓毒症[34]。脓毒症发生时，促炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6等)过度释放引发炎症风暴，导致组织器官功能障碍[35]。TNF-α和IL-1β在清除病原体的同时，也会损伤自身组织细胞[28]，进一步促进炎症因子大量释放，加剧全身炎症反应，最终导致多器官功能衰竭[36]。本研究中，CLP组小鼠脾脏及血清促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白浓度显著高于Control组，肺泡间质大量炎症细胞浸润，与前人研究[27, 37]中CLP诱导的小鼠脓毒症模型结果一致。近期研究表明，脓毒症可导致肠道屏障功能下降，细菌毒素及促炎因子进入血液循环，进而引发全身器官的炎症反应及免疫损伤[36]。本研究中CLP组小鼠肠绒毛高度和肠壁厚度低于Control组，与肥胖脓毒症小鼠的结果相似[37]，提示肠道屏障损伤可能是脓毒症的重要病理环节。
上述促炎因子的合成与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路密切相关，该通路可激活多种转录因子及蛋白分子(尤其是HMGB1)来促进炎症反应的发生[38]。HMGB1从细胞核转位至细胞质，经赖氨酸乙酰化后释放至胞外，与靶细胞TLR4结合，激活MyD88/NF-κB通路，NF-κB与DNA结合后可上调多种炎症介质编码基因的转录，诱导TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子的合成与释放，进而加重炎症反应，其中TNF-α在炎症性疾病中表达显著[39-43]。本研究显示，CLP组小鼠脾脏中HMGB1、TLR4、NF-κB、MyD88、IKKα和IKKβ蛋白表达均高于Control组，而DRP+CLP组上述蛋白的表达显著低于CLP组，表明CLP组中信号分子HMGB1蛋白显著表达，其与受体TLR4识别结合后启动炎症级联反应，导致TLR4下游适配蛋白MyD88表达增加，招募激酶IKKα和IKKβ并活化NF-κB转录因子，促进促炎因子基因(IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23、TNF-α) 的表达；表明DRP通过抑制HMGB1/TLR4/NF-κB通路关键蛋白表达，增加血清抗炎因子IL-10蛋白的浓度，减少促炎因子释放，从而改善免疫异常。
植物多糖的免疫调节作用是其核心生物活性之一，大量研究表明不同来源的植物多糖可通过多途径调控免疫反应，如桦褐孔菌(Inonotus obliquus)多糖可抑制慢性胰腺炎小鼠IL-1β、IL-6、IL-17等促炎基因的表达[20]；玉屏风多糖可促进小鼠脾脏淋巴细胞增殖，进而增强免疫功能[44]；白术(Atractylodes macrocephala)多糖通过升高miR-27b表达，抑制TLR2/NF-κB通路，从而调节雏鸡免疫功能[45]；金银花(Lonicera japonica)多糖通过抑制IκB和p65磷酸化，阻断NF-κB通路，进而下调脂多糖(LPS)诱导的血清IL-1β、IL-6等促炎因子的mRNA表达[46]。
综上所述，本研究虽然证实了DRP通过调控HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路对CLP诱导的小鼠脓毒症模型发挥抗炎作用，但DRP是否通过影响其他炎症相关通路形成多靶点调控网络，其单糖组分是否存在构效关系及协同效应尚不明确。后续可通过建立体外细胞模型，结合网络药理学及体外靶向示踪技术，明确DRP的作用靶点及关键活性成分，从而更深入地揭示DRP缓解小鼠脓毒症的具体作用机制。
4 结论本研究采用水提醇沉法从槲蕨中提取粗多糖，经纯化后获得均一性良好的多糖组分，通过建立CLP诱导的小鼠脓毒症模型，运用qRT-PCR和Western blot技术系统检测了小鼠脾脏组织中HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路关键蛋白的表达水平。结果显示，DRP的平均分子量为197.15 kDa，主要由甘露糖(5.41%)、葡萄糖(32.41%)、阿拉伯糖(6.85%)、半乳糖(18.25%)和鼠李糖(21.17%)组成。DRP可通过抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路关键蛋白的表达，提高血清抗炎因子IL-10蛋白的浓度，并减少促炎因子的释放，从而减轻脓毒症炎症反应及减少多器官损伤。通过上述研究，可系统阐明DRP缓解脓毒症的作用机制，为开发基于DRP的精准抗炎策略提供科学支撑。
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