2. 广西壮族自治区药用植物园, 国家中医药传承创新中心, 广西南宁 530023;
3. 广西壮族自治区药用植物园, 广西壮族自治区中药资源智慧创制工程研究中心, 广西南宁 530023;
4. 中国科学院昆明动物研究所, 中国科学院天然活性多肽工程实验室/云南省活性多肽研究与利用重点实验室, 云南昆明 650201;
5. 广西医科大学基础医学院, 广西南宁 530000
2. National Center for Traditional Chinese Medicine Inheritance and Innovation, Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants, Nanning, Guangxi, 530023, China;
3. Guangxi Engineering Research Center of Traditional Chinese Medicine Resource Intelligent Creation, Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants, Nanning, Guangxi, 530023, China;
4. Engineering Laboratory of Peptides of Chinese Academy of Sciences/Key Laboratory of Bioactive Peptides of Yunnan Province, Kunming Institute of Zoology, The Chinese Academy of Sciences, Kunming, Yunnan, 650201, China;
5. School of Basic Medical Sciences, Guangxi Medical University, Nanning, Guangxi, 530000, China
阿尔茨海默病(Alzheimer′s Disease, AD)是一种常见的慢性神经退行性疾病，发病率随年龄增长而增加，表现为进行性记忆损伤、认知行为功能障碍等症状[1]。2010年，全球AD患者人数约为5 000万，预计到2050年，这一数字将攀升至1.13亿[1]。AD对患者、患者家属以及社会均带来了沉重的负担，已发展成世界性公共卫生问题。
多学科研究表明，人脑胆碱(Choline)能使网络功能障碍类疾病(如AD)表现出重要病理生理特征，如淀粉样β斑块(Aβ plaques)、神经纤维缠结(Neurofibrillary tangles)、炎症(Inflammation)、氧化应激(Oxidative stress)、血管功能不全(Vascular insufficiency)等，从而破坏认知[2-3]。可逆性胆碱酯酶抑制剂(Reversible Cholinesterase Inhibitors，RCI)是一种可逆的竞争性胆碱酯酶抑制剂，通过抑制神经元突触间乙酰胆碱(Acetylcholine)的分解来提高乙酰胆碱的利用率，是临床上少数被证实可用于改善AD所致痴呆症状的药物治疗手段之一[4]。20世纪80年代，研究人员从蛇足石杉(Huperzia serrata)中分离出一种石杉类生物碱——石杉碱甲(Huperzine A，HupA)[5-6]。随后的研究发现，HupA对乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)具有高效的选择性及可逆性抑制作用，可减弱或逆转认知损害，并改善AD患者的学习记忆和认知行为能力，调控中枢神经递质以及保护受损神经，是缓解AD患者痴呆症状的有效药物之一[5-8]。然而，HupA仅存在于自然生长十分缓慢的石杉科(Huperziaceae)、极少数石松科(Lycopodiaceae)植物及其内生真菌中，天然来源非常有限。此外，HupA的化学合成工艺复杂、成本昂贵、合成产物活性低，至今尚不能工业化量产。目前HupA来源几乎完全依赖于植物提取，产率极低，无法满足大规模临床使用的需求[9]。
近年来石杉科植物组织培养、内生真菌发酵及HupA生物合成途径成为HupA来源的研究热点。本文系统地归纳相关方面的研究，重点总结HupA生物合成途径的研究进展，为合理利用石杉科植物及HupA生产扩大化提供参考。
1 产HupA植物组织培养研究进展石杉科植物及其近缘植物，以及石杉科植物内生真菌是HupA的直接生物来源。迄今已知的可作为HupA天然来源的植物包括石杉科植物蛇足石杉、马尾杉(Phlegmariurus phlegmaria)、华南马尾杉(P.fordii)、小杉兰(Huperzia selago)和石松科藤石松(Lycopodiastrum casuarinoides)等[10-11]。然而，这些植物生长均十分缓慢，生命周期长，再生困难且内含的HupA本底量极低[12-13]，因此有必要研究如何通过组织培养来尽可能使HupA的生产规模化。
不同地域生长的不同石杉科种群中有效成分含量差异显著，石杉科植物不同生长发育阶段和不同部位的HupA含量积累亦有差异[12]。现有研究普遍表明，HupA在石杉科植物幼苗中的含量最高，其次是成株；在不同部位中的含量为叶片＞茎＞根，11月前后蛇足石杉全草中HupA积累量达到最高[14-16]。因此，在进行组织培养时，外植体的选择也可能直接影响组织培养的成功率和目标产物得率。Harvey[17]证明了不同来源的愈伤组织产次生代谢物能力不同，需选用疏松易碎、快速生长并高效率合成次生代谢物的外植体，并在此基础上进一步筛选具有上述特征的高产细胞系。Ma等[18]开创了培养原叶体和孢子体以获得粗糙马尾杉(P.squarrosus)外植体的方法，所培养组织中HupA含量高于天然石杉科植物，可作为HupA的生产来源。Liu等[19]取蛇足石杉茎尖组培，在提高生长速率的同时减少了组织感染，并通过砂栽法繁殖蛇足石杉芽孢，提高其成活率。Yang等[20]对3种不同基因型的野生型蛇足石杉成功开展了离体培养，探索出最佳诱导培养基和再生培养基配方，再生组织中HupA含量为53.90-87.17 μg·g-1。然而，由于愈伤组织再生HupA来源的基源植物普遍生长缓慢，因此研究者们还尝试通过改变组织培养的步骤和添加不同的诱导子来促进再生效率、提高HupA含量。Ishiuchi等[21]曾成功实现11种HupA来源的基源植物原叶体的培养，且其中5种以芽尖为外植体成功分化出白黄色球形愈伤组织。遗憾的是，愈伤组织中HupA的含量远低于野生基原植物[21]。吉枝单等[22-23]成功获得了蛇足石杉的叶状体，并通过施加外源激素、改变培养基离子量、改变光质等操作诱导HupA产率提高。袁慧慧等[24]采用浅层液体培养叶状体，提高了叶状体的存活率和HupA产率。徐贤柱等[25]测定了基于蛇足石杉诱导的叶状体、根状体和苔藓状体的细胞特征、总DNA特征、生物生长量和HupA含量，发现叶状体的生物生长量和HupA含量最优。
现有研究证明，植物在胁迫条件下，产生物碱相关基因的表达可被刺激或调控；营养胁迫及环境胁迫对培养物的生长发育和次生代谢物积累有重要影响[26]。叶丽婻等[27]利用H2O2对蛇足石杉叶状体进行浸泡处理，培养90 d后诱变后代叶状体的相对生长率和HupA含量分别达到4499.28%和261.17 μg·g-1 DW，比起始叶状体均提高了2倍多。进一步的研究发现这种处理可造成叶状体可遗传性变异，表明H2O2用于诱导蛇足石杉培养物能提高HupA含量和建立丰富的遗传资源[28]。
2 产HupA内生真菌研究进展内生真菌指存在于宿主植物体内并通过次生代谢物与宿主保持稳态且互惠共生的真菌[29]。这些内生真菌的群落分布和种群结构受宿主的组织、生活环境、季节等因素的影响[30-31]，显著影响着植物体内的HupA含量。了解内生真菌与其宿主石杉科植物之间的特殊关系，有助于未来通过调控培养条件，实现HupA的生物合成和量产，以满足临床需求。目前已从蛇足石杉中分离出300余种内生真菌，子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)是其中的优势种群，相对丰度较高[30]。研究表明，内生真菌的群落组成在2、5、8、11月均有所不同，5月份在丰度上达到峰值，而8月以后多样性与均匀度开始增加[32]。推测夏、秋季节的高温高湿有利于内生真菌的孢子生长融合，随着气温下降，种间竞争达到平衡，物种多样性开始增加，同时HupA积累量达到峰值。在组织上，叶、茎与根的优势属不尽相同，也存在独有的内生真菌群落[30]。内生真菌在叶、茎中的群落数目远大于根，此种现象与叶、茎中的HupA含量高于根一致[32-33]。
内生真菌可产生不同的生物活性化合物，如生物碱、二萜、黄酮类和异黄酮类，赋予植物抗逆性，促进植物生长[30, 34-35]。从蛇足石杉中分离出的300余种内生真菌中有十数株是HupA的直接来源，同时发现20余种菌株能产生其他相关代谢物[36-37]。国内外学者已从石杉科植物中分离到产HupA的菌株并对其产量进行了测定。青霉属(Penicillium)是其中HupA产率较高的一类真菌，产量可达168.9 μg·g-1，较为接近叶组织的HupA含量[37]。Shu等[38]从蛇足石杉中分离出可产生HupA的炭疽菌属(Colletotrichum)真菌，产量为1 μg·g-1干菌丝体；董丽辉等[39]从HupA中分离出一种产HupA的Podospora sp. S29，HupA产量为50.64 μg·g-1干菌丝体；Sun等[40]从蛇足石杉中得到产HupA的真菌Naumannella huperziae sp. nov.，但未提及HupA的产率；Cruz-Miranda等[41]从蛇足石杉中分离出一种产HupA的镰刀菌属(Fusarium)真菌，HupA产量为1 μg·g-1干菌丝体。内生真菌菌株在持续传代过程中的活力下降会导致生物活性物质产生能力的下降，因此需要考虑应用有效的诱导剂刺激HupA的产生。Zhao等[42]将乙醇与甲醇作为附加碳源培养胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)ES026，有效诱导HupA产生，使其产量较一般碳源培养条件下分别提高51.89%和47.05%；Yan等[43]使用蛇足石杉提取物、赖氨酸、乙酸作为诱导剂刺激竹黄属(Shiraia)内生真菌产生HupA，最大产量可达40 μg·g-1。
尽管HupA能够通过分离内生真菌发酵的方法生产，但是菌种退化、产量不稳定的现象依然无法避免。迄今未能分离出能够完全满足工业化量产以及临床需求的内生真菌。
3 HupA的化学合成研究进展在过去的30年里，HupA的化学合成一直是药物化学领域的一大热点课题。从最初的消旋体合成发展到手性剂辅助选择性合成，其反应步骤逐渐减少，产物选择性逐渐提升。尽管如此，这些方法仍存在局限性，目前依然无法在工业生产中大规模应用。在众多化学合成方法中，人工合成的HupA终产物包括与天然HupA结构特性相同的(–)-HupA及其对映体(+)-HupA。临床研究显示，(–)-HupA的药效是(+)-HupA的34倍[44]，因此，人工合成HupA的主要目标是在尽可能低的成本下获得高纯度的(–)-HupA。1989年，Brookhart等[45]首次实现了Hup A的全合成；1991年，Yamada等[46]发现(–)-Hup A合成的关键在于在手性辅助剂(–)-8-苯基薄荷醇[(–)-8-Phenylmenthol]衍生物存在下进行的不对称Michael和Aldol成环反应，并首次报道了(–)-Hup A的合成，其对映体过量(enantiomeric excess, ee)值达到80%。然而，由于手性辅助剂成本高昂，其应用价值尚需进一步提升[46]。2003年，Ma等[47]以β-酮酯(β-Keto ester)和甲基丙烯醛(Methacrylaldehyde)作为原料，实现了(–)-Hup A核心骨架的不对称合成，产率较高且反应时间大幅缩短。到了2012年，Ding等[48]筛选出多官能团硫脲(Thiourea)作为小分子催化剂，使得化学合成(–)-Hup A的ee值可达到92%；该反应在微量投料下的性能显著提升，显示出潜在的实际应用前景。
4 HupA的生物合成研究进展HupA目前最大的来源是从石杉科植物中提取纯化[49]。然而，产HupA的石杉科植物数量稀少，生长环境严苛，再生缓慢，无法满足逐渐增长的神经退行性疾病治疗市场[9]。为解决HupA产量不足的问题，需探求新的可行制药途径。近年的研究方向集中在生物合成与发酵及基因合成方面，尤其是在植物源HupA生物合成通路解析方面取得了突破性进展。但目前对内生真菌合成HupA途径的解析还远远不足，关于其是否采用了与植物类似的合成通路，学界尚未达成共识。
4.1 HupA生物合成通路的解析与争议 4.1.1 植物源HupA生物合成通路石松生物碱(Lycopodium alkaloids)最初的合成通路是基于所鉴定的潜在中间代谢物及同位素饲喂实验结果推导而来的。饲喂实验主要由麦克马斯特大学(McMaster University)的Ian Spenser教授等利用加拿大安大略省北部(Northern Ontario)的野生石松植物开展[13]。基于14C和13C标记的前体对这些植物的嫩芽进行饲喂，Ian Spenser教授等确定了包括HupA在内的石松生物碱起始合成模块，并推导了可能的下游合成路径，Ma等[13]对此有详细的总结。HupA生物合成的前体物质为L-赖氨酸(L-lysine)，L-赖氨酸经过赖氨酸脱羧酶(Lysine decarboxylase, LDC)脱羧形成1,5-戊二胺(Cadaverine，尸胺)，尸胺经铜胺氧化酶(Copper Amine Oxidase, CAO)脱胺脱水形成Δ1-哌啶烯(Δ1-Piperideine)；同时，两分子丙二酰辅酶A(Malonyl-CoA)经聚酮合酶(Polyketide synthase, PKS)缩合后再与Δ1-哌啶烯脱羧形成4-(2-哌啶基)乙酰乙酸[4-(2-piperidyl) acetoacetic acid, 4PAA]，最后脱羧形成石榴碱(Pelletierine)。这是HupA生物合成的起始模块，而石榴碱也是包括HupA在内的石松生物碱合成的广谱前体。随后，石榴碱与4PAA又经脱羧形成Phlegmarine。Phlegmarine氧化闭环后形成Lycodane的途径可能是由桥小檗碱酶(Berberine Bridge Enzyme，BBE)催化形成，再经细胞色素P450(Cytochrome P450，CYP450)或2-酮戊二酸依赖的双加氧(2-Oxoglutarate-dependent dioxygenases，2OGD)家族等酶的催化氧化，以及一系列脱甲基及甲基化最终形成HupA。近期，斯坦福大学的Sattely实验室基于产HupA的石杉属植物Phlegmariurus tetrastichus不同组织的转录组数据，通过体外孵育和烟草体内表达等实验，成功验证了HupA上游合成模块的正确性[50]，并解析了HupA的下游合成通路[51]，鉴定了参与该通路的一系列功能蛋白酶，为HupA生物合成通路的全解析奠定了重要基础，也提供了可行的新方法和新思路(表 1、图 1)。
| 通路相关酶 Pathway-related enzyme |
蛋白名称 Protein name |
物种 Species |
GenBank号 GenBank accession number |
功能验证方法 Functional validation method |
参考文献 Reference |
| LDC | HsLDC-X1 | Huperzia serrata | Not mentioned | In vitro enzyme activity assay, in vivo gene overexpression experiment | [52] |
| HsLDC-L1 | H.serrata | Not mentioned | In vitro enzyme activity assay | [53] | |
| LcL/ODC | Lycopodium clavatum | BAR42911 | In vitro enzyme activity assay, in vivo gene overexpression experiment | [54] | |
| PtLDC-1, PtLDC-2 | Phlegmariurus tetrastichus | QWQ66219, QWQ66220 | In vivo gene overexpression experiment | [50] | |
| LDC, Trx-LDC | Shiraia sp. Slf14 | KT362170 | In vitro enzyme activity assay | [55] | |
| CgLDC | Colletotrichum gloeosporioides ES026 | Not mentioned | In vitro enzyme activity assay, in vivo gene overexpression experiment | [56] | |
| Cg01_LDC_09672-RA, Cg01_LDC_02374-RA; CgLDC1, CgLDC2 | C.gloeosporioides Cg01 | Not mentioned | In vivo gene knockout experiment, in vitro enzyme activity assay | [56] | |
| CgLDC-03647, CgLDC-04099 | C.gloeosporioides | Not mentioned | In vivo gene knockout experiment | [56] | |
| CAO | CgCAO4 | C.gloeosporioides Cg01 | Not mentioned | In vivo gene knockout experiment | [56] |
| CAO3097 | C.gloeosporioides | Not mentioned | In vivo gene knockout experiment | [56] | |
| HsCAO | H.serrata | JN247732 | In vitro enzyme activity assay | [57] | |
| PtCAO-1, PtCAO-2 | P. tetrastichus | QWQ66221, QWQ66222 | In vivo gene overexpression experiment | [50] | |
| CgCAO | C.gloeosporioides ES026 | Not mentioned | In vivo gene overexpression experiment | [56] | |
| PKS | H.Serrata PKS1 | H.serrata | DQ979827 | In vitro enzyme activity assay | [58] |
| H.Serrata PKS2 | H.serrata | Not mentioned | In vitro enzyme activity assay | [59] | |
| HsPKS3 | H.serrata | Not mentioned | In vitro enzyme activity assay | [60] | |
| HsPKS4 | H.serrata | Not mentioned | In vitro enzyme activity assay | [61] | |
| CgPKS-06762, CgPKS-03512, CgPKS-02152, CgPKS-12940, CgPKS-00749 | C.gloeosporioides | Not mentioned | In vivo gene knockout experiment | [56] | |
| PcPKS1 | P.cryptomerianus | Not mentioned | In vitro enzyme activity assay | [61] | |
| PtPKS-1, PtPKS-2 | P. tetrastichus | QWQ66223, QWQ66224 | In vitro enzyme activity assay, in vivo gene overexpression experiment | [50] | |
| Short-chain Dehydrogenase/Reductase(SDR) | PtSDR-1, PtSDR-2 | P. tetrastichus | WOJ51801, WOJ51802 | In vivo gene overexpression experiment | [51] |
| Acyltransferase(ACT) | PtACT-1 | P. tetrastichus | WOJ51791 | In vivo gene overexpression experiment | [51] |
| CYP450 | PtCYP782C1 | P. tetrastichus | WOJ51797, WOJ51798, WOJ51799, WOJ51800 | In vitro enzyme activity assay, in vivo gene overexpression experiment | [51] |
| Alpha-carbonic anhydrase(CAL) | PtCAL-1a, PtCAL-1b, PtCAL-2a, PtCAL-2b, PtCAL-3 | P. tetrastichus | WOJ51792, WOJ51793, WOJ51794, WOJ51795, WOJ51796 | In vitro enzyme activity assay, in vivo gene overexpression experiment | [51] |
| 2-oxoglutarate-dependent dioxygenase(2OGD) | Pt2OGD-1, Pt2OGD-2, Pt2OGD-3 | P. tetrastichus | QWQ66225, QWQ66226, QWQ66227 | In vivo gene overexpression experiment | [50] |
| Pt2OGD-4, Pt2OGD-5 | P. tetrastichus | WOJ51788, WOJ51789 | In vivo gene overexpression experiment | [51] | |
| Alpha/Beta Hydrolase(ABH) | PtABH-1 | P. tetrastichus | WOJ51790 | In vivo gene overexpression experiment | [51] |
|
| The purple shaded area indicates the steps for the construction of the HupA core skeleton; the pink shaded area represents steps that remain unelucidated; the green shaded area depicts the late-stage modification steps of the HupA skeleton.Key enzymes involved in the pathway are highlighted in red, with abbreviations and full names as follows: LDC, lysine decarboxylase; CAO, copper amine oxidase; PKS, polyketide synthase; SDR, short-chain dehydrogenase/reductase; ACT, acyltransferase; CYP450, cytochrome P450;α-CA, alpha-carbonic anhydrase; ABH, alpha/beta hydrolase; 2OGD, 2-oxoglutarate-dependent dioxygenase. 图 1 HupA生物合成流程 Fig. 1 Schematic biosynthetic pathway of HupA |
4.1.2 内生真菌中HupA的生物合成通路
有关内生真菌中HupA的生物合成通路，目前尚未得到系统解析，仅有一些关于LDC、CAO和PKS等基因挖掘和功能验证的报道。很显然，关于内生真菌中参与合成HupA的关键酶的挖掘思路几乎完全依赖于植物源HupA生物合成通路的推导和解析。然而，就报道的这些基因敲除、超表达等结果来看，很多与内生真菌中HupA的累积模式并没有关联性。因此，究竟这些基因编码的蛋白酶是否参与了内生真菌中HupA的生物合成，或者内生真菌中HupA是否存在有别于植物源HupA的生物合成通路，目前还不清楚。
因此，本文将依据植物源HupA生物合成通路的解析模块，对参与其合成的蛋白酶逐一进行总结。此外，因内生真菌中HupA生物合成通路尚不清晰，本文对其中鉴定到的可能参与HupA合成且与植物中相关酶同源的蛋白酶一并归纳阐述。
4.2 通路相关酶的研究进展 4.2.1 LDCsLDC广泛存在于植物、动物和微生物中，是生物体内高度专一性酶，其功能是采用磷酸吡哆醛(Pyridoxal phosphate, PLP)作为脱羧的辅因子，使赖氨酸脱羧生成尸胺[62]。反应产生的尸胺是一种多胺，研究证明其为一种重要的胞内代谢物质，能够赋予植物对极端环境的耐受性，调控植物的生长发育[63]。
Bunsupa等[54]从东北石松(Lycopodium clavatum)中成功克隆了1个LcL/ODC基因，其编码的蛋白酶对赖氨酸的催化效率是鸟氨酸的5倍；超表达L/ODC的拟南芥(Arabidopsis thaliana)和烟草株系中赖氨酸来源的生物碱含量显著上调。此外，Bunsupa等[54]还从蛇足石杉中克隆到2个HsL/ODCs，但因为体外表达时未获得纯化的蛋白而没有做进一步的催化功能探究。Xu等[52]从蛇足石杉中分离出6个LDC cDNA，并通过动力学验证、烟叶转基因和纯化酶法证明HsLDC的赖氨酸所具有的高催化活性，同时利用液质联用与质谱法鉴定出LDC与PLP结合的关键残基K1-18。李赛男等[53]提取蛇足石杉总RNA得到转录组，测序筛选到3个可能的LDCs基因，分别命名为HsLDC-L1、HsLDC-L2、HsLDC-L3，生物信息学分析和表达产物功能鉴定表明，这些基因与现报道的赖氨酸脱羧酶HsLDCX1/2/3具有高度的相似性，在三维结构上也具有高度的相似性。将这些酶的序列与已知的石杉科或石松科植物的LDC进行比对，证明其均属于PLP依赖性超家族酶并存在高度保守的N端PLP结合域与C端底物结合域。Yang等[64]将提取到的cDNA序列定位于京都基因与基因组百科全书(KEGG)参考途径的“异喹啉生物碱生物合成”上，经对比表明赖氨酸衍生生物碱产生有趋同进化的趋势，为发掘新的同源基因合成HupA前体提供了更多可能性。Nett等[50]基于转录和代谢联合分析，从Phlegmariurus tetrastichus中鉴定到两个LDCs(PtLDC-1和PtLDC-2)，二者氨基酸序列同源性高达84%，且均具有催化赖氨酸合成尸胺的功能。
除此之外，产HupA内生真菌中的LDC研究也有进展。彭思露[55]分离出蛇足石杉内生真菌Shiraia sp. Slf14，成功克隆到其LDC基因，通过镍离子金属亲和层析纯化重组LDC并建立酶促反应体系和薄层层析检测了其催化活性；张香梅[56]等成功从胶孢炭疽菌ES026中克隆得到CgLDC基因，与不同物种的LDCs基因多序列比对，使用MEGA7软件进行系统发育分析、邻接法构建系统发育树。这些克隆得到的内生真菌LDC在结构上与HsLDC相似，但在理化性质方面有较大差异[52, 55-56]。值得注意的是，康信聪[63]通过波兰青霉(Penicillium polonicum)的基因敲除实验发现，单个候选LDC基因的敲除并不影响HupA的产量；在敲除两个LDCs基因后，菌丝生长反而得到促进，HupA产量反而增加。由此推测LDCs并不是内生真菌中合成HupA的关键酶，但也不排除内生真菌中HupA的合成途径与植物中存在差异的可能性[65]。
4.2.2 CAOsCAO是HupA合成过程中的第二个酶，其通过脱氨反应，将尸胺氧化脱胺生成哌啶烯[66]。CAO是多胺代谢和环亚胺裂解过程中的关键酶和活性过氧化氢供体[67]。CAO也被证明参与了植物生长分化以及赋予植物抗逆性的功能[68]。
CAO目前已经在多种植物和微生物中成功被克隆鉴定，且在一些植物如豌豆以及一些微生物如汉逊酵母、大肠杆菌(Escherichia coli)等中的CAO晶体结构已经获得了解析[69-72]。已知的晶体结构解析和生化实验结果均表明，CAO是同源二聚体蛋白，该二聚体均具有两个保守的活性位点，即2,4,5-三羟基苯丙氨酸醌(2,4,5-Trihydroxyphenylalanine quinone，TPQ)结合位点和铜离子结合位点[69-72]。关于其详细的结合和催化反应机制，可参考Klema等[73]发表的相关综述。简言之，CAO的TPQ帮助催化底物接受电子和质子，再通过催化位点将其向分子氧转移，最后得到产物和过氧化氢[73]。
在产HupA的植物中，第一个被克隆并功能鉴定的基因是Sun等[57]报道的蛇足石杉中的HsCAO；体外表达及凝胶电泳实验证明其可以形成同源二聚体。此外，体外底物孵育实验结果表明HsCAO具有底物泛杂性，对多种单胺和二胺均具有催化活性，但对尸胺的催化效率最高[57]。刘爱佳等[74-75]亦从蛇足石杉中克隆得到HsCAO2与HsCAO3, 与从美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中筛选的同源性较高的CAOs进行比对，结果显示这两个CAO基因与HsCAO1有较近的亲缘关系，并预测HsCAO2可能以二聚体形式行使功能。Nett等[50]从Phlegmariurus tetrastichus中也鉴定到了2个CAOs(PtCAO-1和PtCAO-2)，二者均具有催化尸胺合成Δ1-哌啶烯的功能。但意外的是，Nett等[50]也验证了Sun等[57]之前从蛇足石杉中筛选出的HsCAO，发现后者并不能以尸胺为催化底物，这与Sun等[57]之前的研究结果不相符。同源性比对结果表明，PtCAO-1和PtCAO-2氨基酸同源性高达88%，而它们与HsCAO的氨基酸同源性却不到30%[50]。造成这种差异的原因可能包括体外蛋白的纯度反应条件、检测手段精准度等方面。笔者也曾尝试利用不同的原核表达系统、毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统、截断信号肽等方式体外表达HsCAO、HsCAO2和HsCAO3，但均未成功。未来可尝试采用温和诱导型启动子、昆虫表达系统或无细胞蛋白表达系统来诱导表达这些蛋白，检测其催化活性的有无或高低，筛选或改造对尸胺具有高催化效率的CAOs用于HupA等重要次生代谢物的合成生物学研究。
除了植物，目前也在若干具有HupA合成能力的内生真菌中鉴定到了CAO[55-56, 65, 73]。将这些CAOs进行同源比对，发现真菌的CAOs基因在进化上相聚较近，与蛇足石杉的CAOs则有较远的遗传距离[76]。研究者从胶孢炭疽菌ES026中克隆得到1个CgCAO基因，通过体外表达和酶活鉴定，证明其表达产物是CAO，且可催化尸胺生成哌啶烯[56, 77]。还有研究者在胶孢炭疽菌Cg01中筛选到数个CgCAOs基因，采用基于融合PCR的split-marker同源敲除策略对其进行敲除，逐一敲除后，内生真菌合成HupA的能力不受影响，说明这些CAOs并不是合成HupA的关键酶，或者该内生真菌中的CAOs功能具有冗余性[63, 65]。黄瑞珂[78]在筛选出数个胶孢炭疽菌CgCAOs基因的基础上也进一步开展了敲除研究，结果表明，敲除CAO(s)基因也不会对HupA产量产生明显变化。未来还需要更多的湿实验证据来验证CAOs是否参与了内生真菌中HupA的合成。
4.2.3 PKSs聚酮化合物(Polyketides, PKs)是一类由植物和微生物产生的具有重要生物活性的天然次生代谢产物。催化生产PK骨架的酶被称为PKS[79]。PKS通过改变其底物特异性、缩合反应的步骤数量以及利用不同的环化反应来合成多种功能各异的产物，因此PKS在次级代谢物的生物合成过程中发挥着关键作用[79]。
生物体内的PKS分为3类。Ⅰ、Ⅱ型PKS主要存在于微生物中，分别为多功能模块和多功能酶复合体。Ⅰ型PKS主要催化酰基CoA聚合成大环内酯类抗生素等化合物。Ⅱ型PKS主要催化酰基CoA合成芳香环类抗生素等化合物。Ⅲ型为查耳酮合成酶，催化对羟基肉桂酰CoA与丙二酰辅酶A生成双去甲氧基姜黄素[80]。
Wanibuchi等[58]率先报道了蛇足石杉中的一个Ⅲ型PKS(HsPKS1)，体外孵育实验发现其可以催化4-对甲基肉桂酰-CoA(4-methoxycinnamoyl-CoA)、N-甲基邻氨基苯甲酰-CoA(N-methylanthraniloyl-CoA)等底物生成各式各样的芳香型丁烯酮，如查尔酮、苯甲酮(Benzophenone)、间苯三酚(Phloroglucinol)、吖啶酮(Acridone)等。这是首次在非芸香科(Rutaceae)植物中发现可以催化生成吖啶酮的Ⅲ型PKS[58]。然而，到目前为止，在蛇足石杉中并没有发现吖啶酮类生物碱。在此基础上，HsPKS1的晶体结构获得解析[81]，并被用来合成多种重要的非天然生物碱骨架[82]。叶金翠等[59]从蛇足石杉中克隆得到一个编码Ⅲ型PKS的cDNA(HsPKS2)，测序结果显示其与其他植物来源的PKSs基因存在50%-66%的同源性，且具有PKS活性中心的保守序列，在体外表达时具有较广的底物选择性，可催化芳香族底物、脂肪族底物生成系列非天然聚酮产物，如吖啶酮生物碱。Wang等[60]从蛇足石杉中克隆得到与HsPKS1和HsPKS2催化活性有差异的HsPKS3，利用同源建模将HsPKS3与4PAA-CoA、phlegmarine类似物进行分子对接，从结构上阐释了石杉碱甲生物合成通路的上游重要前体——石榴碱(Pelletierine)对其进行缩合的可能性。此外，该团队又分别从蛇足石杉和柳杉叶马尾杉(Phlegmariurus cryptomerinus)中克隆到HsPKS4、PcPKS1和PcPKS2，并证实HsPKS4和PcPKS1参与了石榴碱的合成[61]。沈玉等[83]从蛇足石杉中克隆的HsPKS1基因与Wanibuchi等[58]克隆的HsPKS1同源性高达99.72%，只有一个碱基的无义突变。HsPKS1可定位于烟草叶肉细胞的细胞核和细胞质，且其转录本在不同组织和样本中的基因表达量与HupA含量呈正相关[83]。瞬时超表达HsPKS1的烟草中黄酮类的前体化合物和异喹啉类生物碱化合物的累积发生了变化[83]。Nett等[50]基于共表达分析，也成功从P. tetrastichus中鉴定到2个PKS，这2个PKS氨基酸同源性高达82%，且与HsPKS4、PcPKS1的同源性均达到90%以上。体外孵育实验证实它们均可以催化生成石榴碱，因此也是P. tetrastichus中参与HupA生物合成的重要蛋白酶。
产HupA的内生真菌中也发现有PKS编码基因。彭思露等[84]从蛇足石杉内生真菌Shiraia sp. Slf14中克隆到一个Ⅲ型PKS，但未进一步鉴定其催化功能。胡莉琴[85]将筛选出的胶孢炭疽菌ES026 CgPKS基因敲除后，仅菌丝生物量有所下降，发酵液中总HupA含量基本不变。研究发现，真菌基因组中的PKSs基因数量远多于克隆所得，还有部分PKSs基因因处于沉默态而暂未被检测到[86]。鉴于PKS基因的类别多样性，未来应加大产HupA内生真菌中PKS基因功能的鉴定力度。
4.2.4 短链脱氢/还原酶(SDRs)SDRs家族广泛存在于生物界，是一类古老的NAD(P)(H)依赖型的氧化还原蛋白酶家族[87]。SDRs家族成员蛋白序列差异较大，但仍保留了3个共性特征：都有一个辅因子结合位点TGxxxGxG；具有一个保守的催化基序YxxxK；具有一个由两个重复的β-α-β-α-β单元组成的蛋白质结构基序(罗斯曼折叠，Rossmann fold)[88]。进一步地，基于结构特征，SDRs家族又可以分为5种类型，这些SDRs在生物碱合成、糖代谢、脂肪代谢等生物过程中可作为脱氢酶，负责将底物氧化或还原[87]。Nett等[51]基于P. tetrastichus不同组织的转录本数据，通过与之前鉴定到的PtLDC、PtCAO及PtPKS进行共表达分析，筛选到2个参与HupA上游合成通路的SDRs(PtSDR-1和PtSDR-2)，二者氨基酸同源性高达88.6%，均可催化石榴碱的还原，但对映选择性稍有差异。
4.2.5 酰基转移酶(ACTs)ACTs广泛存在于动物、植物和微生物中，可将酰基从供体转移到产物上[89]。植物ACTs分为两大家族，即丝氨酸羧肽酶样ACTs(Serine carboxypeptidase-like acyltransferases, SCPL ACTs)和BAHD ACTs[90]。前者以1-O-β-葡萄糖酯类(1-O-β-glucose esters)为酰基供体，后者则以酰基辅酶A硫酯类(Acyl-CoA thioesters)为酰基供体[90]。BAHD这一名称来源于最早通过生化实验鉴定出功能的4种ACTs英文全称首字母的组合，即苯甲醇O-酰基转移酶(Benzylalcohol O-acetyltransferase)、花青素O-去甲氧基转移酶(Anthocyanin O-hydroxycinnamoyltransferase)、邻氨基苯甲酸N-去甲氧基/苯甲酰基转移酶(Anthranilate N-hydroxycinnamoyl/benzoyltransferase)、脱酰基文朵灵4-O-酰基转移酶(Deacetylvindoline 4-O-acetyltransferases)[91]。BAHD ACTs在植物从水生到陆生进化的过程中扮演着至关重要的角色[92]。众多植物基因组数据显示BAHD ACTs家族成员经历了显著的扩张或丢失，以帮助植物应对各种生物和非生物胁迫[92]。具体而言，BAHD ACTs参与了植物天然产物及其前体如花青素、生物碱、芳香醇、萜类等的合成，在扩展植物次生代谢物的结构多样性、增强代谢产物的稳定性、脂溶性及生物利用度方面均具有关键作用[92]。HupA上游合成通路中，其中一个氧原子的酰基化由BAHD ACT来执行。Nett等[51]基于共表达簇，成功从P. tetrastichus中筛选并鉴定了1个BAHD ACT(PtACT-1)参与该反应，且该酶对底物的立体化学性要求不严格。
4.2.6 CYP450sCYP450s广泛分布于动物、植物和微生物中，因其CO结合态在450 nm处有吸收峰而得名[93]。CYP450s有一个保守的血红素结合结构域FxxGxRxCxG[94]。基于进化关系，CYP450s可划分为11个家族，这11个家族中，CYP71为A型，其余均为非A型[95]。CYP450s是植物中最大的蛋白家族，参与烷基氧化、氧化性碳碳键断裂、羟化等次生代谢过程[95]。对蛇足石杉不同组织的转录组分析显示多个CYP450s参与了次生代谢[49]。Yang等[64]分析了CYP450基因的组织差异性表达，候选的CYP450s在叶片中的表达量高于其他器官，这与HupA的器官特异性积累模式一致。Wu等[96]基于野生型蛇足石杉和蛇足石杉叶状体的比较转录组和广靶代谢组联合分析，挖掘到29个可能参与HupA生物合成的CYP450s候选基因，为进一步验证其酶学功能奠定了重要基础。Nett等[51]则通过共表达簇和烟草瞬时表达实验从P. tetrastichus中直接鉴定到一个参与HupA上游合成通路的CYP450(PtCYP782C1)，可以合成Phlegmarane骨架的初始底物，这也是首个报道的参与HupA生物合成的CYP450。
4.2.7 α-碳酸酐酶(Alpha-Carbonic Anhydrases, α-CAs)CAs是一种Zn2+依赖的金属酶，能够可逆地催化CO2与HCO3-之间的转化[97]。作为CO2浓缩机制(CO2 Concentrating Mechanism, CCM)的关键酶，这一反应将膜通透的CO2生成膜不通透的HCO3-，对生物体维持正常生理活动极其重要[97]。CAs可分为α、β、γ、δ、ε、θ、ι 7个家族，这些家族成员序列同源性不高，但活性中心却高度相似。植物中的CAs主要有α、β、γ 3种类型，它们可以通过吸收环境中的无机碳，帮助植物实现核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase, RuBisCO)周围CO2的富集，提高光合效率[98-99]。在大多数植物中，α-CAs是植物CAs中最大的家族，但对其功能的研究却非常有限，仅在部分模式植物和作物中开展了α-CA表达模式的初步探索[99]。基于转录本的共表达簇分析，Nett等[51]在对P. tetrastichus的研究中发现，4PAA除了被用于合成Phlegmarane骨架，还可以在两个α-CAs(PtCAL-1a和PtCAL-2a)的介导下，与Phlegmarane骨架前体进一步缩合；该缩合反应可通过立体选择的方式控制消耗配比，最终实现完整的Phlegmarane骨架的合成。这一发现完全拓展了对α-CAs功能的认知，因为4PAA是八碳骨架，并非CO2或HCO3-或其他无机碳。此外，通常来讲，植物的α-CAs都是以单体形式发挥功能，但PtCAL-2a只有与PtCAL-1a共表达时，其蛋白才会与PtCAL-1a一样共定位到质外体，表现出催化功能，说明PtCAL-2a需要PtCAL-1a帮助其完成翻译后修饰才能行使正常的催化能力[51]。
4.2.8 2OGDs与CYP450s不同，2OGD家族是非血红素蛋白[100]。2OGD是植物基因组中第二大氧化酶家族[100]，其催化过程需要2OG和O2作为共底物、Fe2+作为辅助因子催化底物氧化，通过氧化反应、脱羧基/脱羧基反应参与包括代谢调控、DNA修复等多种生物学过程[101]。植物2OGDs可分为3类：DOXAs、DOXBs和DOXCs，其中参与植物次生代谢的主要是DOXCs家族成员[102]。HupA分子中存在吡啶酮环，因此推测双加氧酶可能参与HupA的生物合成。张君诚等[103]报道了同种生境下两种马尾杉中双加氧酶的表达情况，HupA产率高者的双加氧酶基因是正常表达的，而低者中几乎不表达。这意味着双加氧酶可能在HupA的合成通路中扮演重要角色。基于转录本的共表达簇分析，Nett等[50-51]成功挖掘到多个2OGD酶家族成员，它们作为关键酶将Phlegmarane骨架修饰成各种石杉碱，其中Lycophlegmarinine D可经由Pt2OGD-3合成HupB，后者再经由Pt2OGD-1合成HupC；HupC再经由Pt2OGD-2最终合成HupA。总体而言，2OGDs在HupA生物合成通路的下游部分发挥关键作用。
4.2.9 α/β水解酶(Alpha/Beta Hydrolases, ABHs)ABHs是自然界中发现的最大的蛋白质家族之一，其共有的保守结构为α/β水解酶折叠[104]。该折叠通常由两侧的α螺旋和被其包裹着的几个相互平行的β折叠片层组成，内含保守的三联体残基，奠定了α/β水解酶催化功能的稳定性[104]。除此之外，不同的α/β水解酶也含有其他不同的功能结构域，赋予其对不同底物独特的催化功能[105]。目前已知的α/β水解酶超家族成员繁多，有酯酶(Esterases)、蛋白酶(Proteases)、脂肪酶(Lipases)、脱卤酶(Dehalogenases)、裂解酶(Lyases)、环氧化物水解酶(Epoxide hydrolases)等[104]。基于转录本的共表达簇分析，Nett等[51]筛选到一个参与形成HupB前体Lycophlegmarinine D的α/β水解酶PtABH-1，实现了HupA生物合成下游模块的全解析。
5 展望HupA作为一种有效的胆碱酯酶抑制剂，对重症肌无力、阿尔茨海默病、记忆障碍等神经退行性疾病具有显著的疗效，拥有良好的临床价值与广阔的应用前景。对石杉科植物及其内生真菌合成HupA的机理开展研究，阐明HupA的生物化学合成通路，对HupA的工业化合成具有重要意义。分子生物学技术的快速发展、次生代谢物合成及其调控基因研究的深入，为探索HupA生物合成途径提供了重要线索。然而，目前研究还存在一些问题。首先，HupA的完整合成通路尚未完全打通，中间模块中的异构、缩合等关键酶仍有待挖掘[51]。其次，参与次生代谢产物合成的基因不仅包括功能基因，还包括调控基因；在次生代谢物及合成基因的调控方面，与表观遗传修饰相关的碱基或组蛋白甲基化酶、乙酰化酶、磷酸化酶等仍需验证。
目前对HupA合成通路关键基因的挖掘主要还是依赖转录组数据[50-51, 96]，缺乏基因组数据的支撑。近年来，关于基因簇调控次生代谢物合成的研究陆续报道[106-107]，为HupA生物合成通路的完整阐释指明了方向。基因簇依赖于高质量基因组的组装和注释。石杉科及近源植物的系统发育进化导致其染色体组繁杂，基因组C值反常现象严重[108]，虽然已有少数关于石松科和石杉科基因组完成组装和注释的报道[109-110]，但石杉科物种高质量基因组的获得仍充满挑战。此外，鉴于石杉科及近源植物自然生长缓慢、人工培育技术不够成熟等因素，其合成调控相关分子机制的研究十分匮乏，尚无调控通路以及相关调控基因挖掘和鉴定的报道。随着测序和组装技术的革新，未来有望能够解决复杂基因组一维数据解析的难题，助力天然产物合成和调控机制的精准挖掘。
鉴于产HupA的石杉科等植物自然生长缓慢、HupA含量低，借助合成生物学利用微生物或异源植物量产HupA是一条可行的替代路径[96]。目前常用的微生物底盘主要有大肠杆菌和酵母[111-112]。对于HupA来说，打通其合成通路是构建微生物底盘的前提。这些底盘也可以作为生产其他石松生物碱的储备。此外，鉴于一些内生真菌也可产HupA，解析内生真菌的遗传信息背景以及通过比较基因组和转录组等信息挖掘内生真菌中HupA的生物合成通路，继而通过添加诱导子或对合成通路的基因进行基因编辑改造，也是利用微生物量产HupA的另一条理论上的可行之路。异源植物方面，通常选择遗传背景清晰的烟草来进行[113]。Nett等[51]的实验证实，在烟草中瞬时超表达HupA上游基因可以合成HupA，这为未来构建基于烟草的稳定表达体系提供了重要依据。无论是微生物底盘还是烟草底盘，抑或是其他植物底盘，遴选、修饰和改造HupA合成途径上的关键酶，减少甚至消除底盘自身背景蛋白酶对中间物的分流，同时尽可能降低高次生代谢物累积带给底盘的可能伤害，将是未来利用合成生物学量产HupA乃至其他天然产物的工业化方向。
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