2. 中国科学院分子植物科学卓越创新中心, 植物分子遗传国家重点实验室, 上海 200032;
3. 扬州大学农学院, 江苏扬州 225009
2. State Key Laboratory of Plant Molecular Genetics, CAS Center for Excellence in Molecular Plant Sciences, Shanghai, 200032, China;
3. Agricultural College of Yangzhou University, Yangzhou, Jiangsu, 225009, China
植物和昆虫是自然生态系统中的重要组成部分，二者在地球上共存了近4亿年，建立了复杂且多样的互作关系[1]。面对植食性昆虫所带来的选择压力，陆生植物逐步演化出多种防御机制来减少昆虫取食造成的损伤[2]。与组成型防御相比，诱导型防御可在植物遭受攻击后迅速启动，从而实现资源的动态响应和高效分配，极大提升了植物的资源利用效率和环境适应能力[3]。根据作用方式的不同，诱导型防御机制可分为直接防御和间接防御两类：直接防御主要通过诱导合成防御相关的蛋白或次生代谢产物来抑制昆虫的取食和生长；间接防御则表现为植物在受到昆虫取食时释放特定的挥发性有机化合物(Volatile Organic Compounds，VOCs)，这些化合物可以吸引取食者的天敌(如捕食性或寄生性昆虫)，以此对取食昆虫施加“间接”抑制[4]。
在诱导型防御中，茉莉酸(Jasmonic Acid, JA)及其衍生物被认为是种子植物中调控挥发物释放和防御反应的核心信号分子[5-6]。JA是在多种酶参与下形成的代谢产物，其生物合成途径依次经过叶绿体、过氧化物酶体，最终在细胞质中生成其衍生物。研究表明，在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中，JA主要通过十八烷途径(octadecanoid pathway)合成。即以α-亚麻酸(C18：3)为起点，在13-脂氧合酶(13-Lipoxygenase，13-LOX)、丙二烯氧化物合成酶(Allene Oxide Synthase，AOS)以及丙二烯氧化物环化酶(Allene Oxide Cyclase，AOC)的作用下，在叶绿体中生成12-氧代植物二烯酸(12-Oxo-Phytodienoic Acid，12-OPDA)，12-OPDA随后被转运至过氧化物酶体，在过氧化物酶体中在OPDA还原酶3(OPDA Reductase 3，OPR3)等酶的作用下生成JA，JA再被转运到细胞质中，进一步生成其他衍生物，例如在茉莉酸羧基甲基转移酶(Jasmonic acid carboxyl Methyltransferase，JMT)的催化下合成茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate，MeJA)，以及在茉莉酸酰胺合成酶(Jasmonate Acid Resistant 1，JAR1)的催化下合成茉莉酸-异亮氨酸(Jasmonic Acid-Isoleucine，JA-Ile)等[5]。除十八烷途径外，植物中还存在另一条JA合成通路，即十六烷途径(hexadecanoid pathway)。二者的主要区别在于起始底物不同：十八烷途径以α-亚麻酸(C18:3)为底物，生成12-OPDA；而十六烷途径以十六碳三烯酸(C16:3) 为底物，生成dn-OPDA。这两条途径均依赖13-LOX、AOS、AOC及OPDA还原酶等关键酶的作用，但其同工酶往往表现出底物特异性，从而决定代谢流向[5]。
有研究表明，JA合成通路可能起源于植物早期祖先，并在陆生植物演化中逐步完善[7-10]。苔藓植物能够合成OPDA，然而并未积累JA及其衍生物，这表明完整的JA合成与信号通路尚未建立[7]。石松类植物已具备完整的JA合成与响应体系，能够通过JA信号调控生长和逆境适应，但OPDA仍是主效的响应分子[8]。在真蕨类植物中，有研究报道，铁线蕨(Adiantum capillus-veneris) 能在机械损伤情况下合成JA，并系统检测到参与JA合成通路的关键酶基因的表达上升，表明真蕨类植物已经具备较为完整的JA生物合成能力[9]。然而，目前真蕨类植物中JA合成通路的研究仍局限于少数物种，关于JA是否参与真蕨类植物对昆虫取食的诱导型防御仍缺乏系统研究[10]。
姬蕨(Hypolepis punctata)隶属于木贼纲(Equisetopsida)水龙骨目(Polypodiales)碗蕨科(Dennstaedtiaceae)姬蕨属(Hypolepis)，是一种典型的真蕨类植物。姬蕨属主要分布于热带亚洲与热带美洲地区，现存约80种，是碗蕨科较大的属之一[11]。姬蕨属植物往往具有极强的克隆生长能力，常在林缘或扰动后的空地快速生长形成大型群落，表现出典型的先锋物种特征[12]。此外，Huang等[13]的研究发现，姬蕨在受到植食性昆虫取食后会释放出多种具有挥发性的化学物质，这些物质对取食昆虫的天敌——齿缘刺猎蝽(Sclomina erinacea)具有很强的吸引力，该研究首次证明了蕨类植物具有间接防御能力，也为研究蕨类植物诱导型防御的分子机制提供了理想材料。然而，对于姬蕨分子层面的基础研究仍较为薄弱，尤其是在基因组水平，尚缺乏高质量序列与功能注释信息，严重限制了对其防御机制和信号通路的深入解析。
随着高通量测序技术的迅速发展，转录组测序已成为非模式植物功能基因挖掘的重要手段，尤其在缺乏参考基因组的物种中显示出独特优势[14]。相较于依赖短读长进行转录本拼接的二代转录组测序，基于PacBio Sequel平台的三代全长转录组测序能够直接读取单cDNA分子的完整序列，显著提升了转录本结构注释的准确性和完整性[15]。这一技术在构建高质量参考转录组、识别复杂剪接事件、功能基因预测等方面具有显著优势，在种子植物中已被广泛应用[16-17]。近年来，该技术也逐步应用于蕨类植物，为多个尚未完成基因组测序的蕨类植物提供了高质量的序列参考信息[18-23]。本研究以姬蕨为对象，利用PacBio三代测序技术构建高质量的参考转录本数据集，并在此基础上系统鉴定JA合成通路相关的候选基因，为姬蕨及其他真蕨类植物的分子研究提供转录组学资源，探索姬蕨是否具备JA合成通路的潜在遗传基础，并为进一步解析JA在真蕨类植物防御反应中的作用机制提供研究线索和数据支持。
1 材料与方法 1.1 试验材料与RNA提取多年生的姬蕨植株取自上海辰山植物园蕨类专类园，随后在人工培养室[温度26 ℃，湿度70%，光周期光照∶黑暗(L∶D)=16∶8]进行种植。分别采集成熟植株的叶片、嫩茎和根，液氮冷冻，-80 ℃保存，样品等量混合后用于总RNA提取。使用TRIzol-氯仿对混合样品进行总RNA提取，使用异丙醇沉淀总RNA，并用75%乙醇进行清洗，最后使用RNase-free ddH2O溶解沉淀，得到纯净的总RNA。利用琼脂糖凝胶电泳分析总RNA降解程度以及是否有污染；使用Nanodrop[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]检测总RNA的纯度；利用Qubit和Agilent 2100[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]对总RNA浓度和完整性进行精确的定量和测定。
1.2 全长转录本的文库构建与测序在获得植物总RNA后使用Oligo富集含有polyA的mRNA，然后使用SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit[宝日医生物技术(北京)有限公司]将mRNA反转录为cDNA，对获得的全长cDNA进行损伤修复、末端修复、连接SMART哑铃型adapter，形成完整的SMRT bell文库。利用PacBio Sequel测序平台对文库进行测序。
1.3 全长转录本的组装与功能注释使用SMRTlink(V8.0)软件处理原始下机数据后获得的Subreads序列，经校正后获得环形一致性序列(circular consensus sequence, CCS)。随后，检测CCS中是否包含5′-primer、3′-primer、poly-A序列，将其分为两类：全长嵌合序列(full-length read, FL)和非全长嵌合序列(full-length non-chimeric read, FLNC)，FL包含完整的5′-primer、3′-primer以及poly-A尾，而FLNC则是经过去除嵌合部分后的全长序列。接着利用hierarchical n×log(n)算法对FLNC进行聚类，获得cluster consensus序列，供后续分析。
为获得更加全面的基因功能信息，使用NR(NCBI non-redundant protein sequences)、NT(NCBI nucleotide sequences)、Pfam(protein family)、KOG(euKaryotic ortholog groups)、Swiss-prot(swiss-prot protein sequence database)、KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)、GO(gene ontology)七大数据库对所得到的姬蕨全长转录组数据进行基因功能注释分析。使用BLAST软件(V2.7.1)，并设置NT数据库e-value值为1e-5进行分析；使用Diamond软件(V0.8.36)进行BLASTX分析，设置e-value值为1e-5对NR、KOG、Swiss-Prot以及KEGG数据库进行分析；蛋白结构域的注释使用HMMER软件包(V3.1)的hmmscan程序，在Pfam数据库中完成。
1.4 CDS预测与SSR分析使用ANGEL软件(V2.4)对CDS序列进行预测分析；使用MISA软件(V1.0)对简单重复序列(simple sequence repeats, SSR)进行鉴定。SSR又称短串联重复序列(short tandem repeats)或微卫星标记(microsatellite markers)，是由1-6个核苷酸组成的重复单元以串联方式排列而成的重复序列，其总长度通常可达数十个碱基。根据SSR的重复次数将其分为5-8次、9-12次、13-16次、17-20次和21-24次重复5个组别。
1.5 JA合成通路候选基因预测以KEGG数据库中定义的JA合成通路模块(模块编号M00113)为参考，提取通路中关键酶对应的KO编号，并在姬蕨全长转录组注释结果中对这些KO编号逐一进行检索，从而获得候选的功能基因转录本编号。
2 结果与分析 2.1 全长转录组测序与组装使用PacBio Sequel测序平台环状测序，共获得504 878条原始序列(polymerase reads)，总计66.34 Gb，平均长度为131 394 bp，N50为200 711 bp。对原始数据进行去接头和质量过滤后，共获得有效插入片段Subreads 22 576 352条(64.67 Gb)，平均长度为2 865 bp，N50为3 118 bp。经CCS校正后得到469 142条CCS，平均长度为3 182 bp，N50为3 451 bp。进一步筛选得到FLNC 437 279条，占CCS的93.21%，平均长度为3 075 bp。将同一转录本的FLNC进行聚类去冗余，得到Consensus序列共计49 455条。使用CD-HIT(V4.6.8)软件对校正后的Consensus序列进行去冗余处理，最终获得24 167条非冗余转录本用于后续分析(表 1)。
| 序列类型 Sequence type |
序列数量 Sequence number |
总碱基数/Gb Total base count/Gb |
平均长度/bp Average length/bp |
N50/bp |
| Polymerase reads | 504 878 | 66.34 | 131 394 | 200 711 |
| Subreads | 22 576 352 | 64.67 | 2 865 | 3 118 |
| CCS | 469 142 | 3 182 | 3 451 | |
| FLNC | 437 279 | 3 075 | 3 355 | |
| Consensus sequences | 49 455 | 0.14 | 3 025 | 3 306 |
| Non-redundant transcripts | 24 167 | 0.07 | 2 983 | 3 299 |
2.2 转录本功能注释
将去冗余后得到的24 167条转录本分别在7个公共数据库进行功能注释。结果显示，共有23 340条转录本获得功能注释信息，占总转录本的96.58%，其中，在NR、Swiss-port、KEGG、KOG、GO、NT和Pfam数据库中分别获得23 072(98.85%)、20 557(88.08%)、22 814(97.75%)、15 839(67.86%)、17 643(75.59%)、8 273(35.45%)和17 643(75.59%)条转录本的功能注释信息，有5 454条转录本同时在7个数据库中获得功能注释信息(图 1)。
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| 图 1 非冗余转录本在七大数据库中获得功能注释的数量 Fig. 1 Number of functional annotations of non-redundant transcripts in seven major databases |
在各类功能注释数据库中，KEGG数据库成功注释到22 814条(图 2)。注释到的转录本覆盖所有KEGG定义的六大类功能通路，包括细胞过程(cellular processes，1 303条)、环境信息处理(environmental information processing，1 278条)、遗传信息处理(genetic information processing，1 908条)、人类疾病(human diseases，2 244条)、代谢(metabolism，4 390条)、生物体系统(organismal systems，1 908条)。其中，富集转录本数量最多的是代谢功能通路，主要涉及初生代谢，如碳水化合物代谢(carbohydrate metabolism，859条)、全局与概述图谱(global and overview maps，656条)、氨基酸代谢(amino acid metabolism，594条)、脂质代谢(lipid metabolism，470条)等，以及次生代谢，如其他次生代谢物合成途径(biosynthesis of other secondary metabolites，250条)、萜类和聚酮类(metabolism of terpenoids and polyketides，147条)等子通路。在脂质代谢途径中，有85条转录本被注释为亚麻酸代谢途径(alpha-linolenic acid metabolism)，推测这些转录本可能与姬蕨中JA合成通路相关。另外，在人类疾病功能通路中，注释到一些在植物中普遍参与胁迫信号转导与防御反应的信号元件，如MAPK级联(KO05200、KO05231、KO05323等)、活性氧(ROS)代谢相关酶(KO05010、KO05012、KO05014等)，这些在植物中功能保守的元件很可能与JA信号通路的下游基因表达和防御网络密切相关。
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| 图 2 KEGG注释的功能分类与通路富集统计 Fig. 2 Functional classification and pathway enrichment of KEGG annotation |
对姬蕨转录本进行NR数据库注释分析，结果显示共计23 072条转录本被注释，共匹配到261个物种(图 3)。其中与姬蕨序列相似度最高的物种是地钱(Marchantia polymorpha)4 165条(18.05%)；其次是小立碗藓(Physcomitrella patens)3 462条(15.01%)、巨云杉(Picea sitchensis)2 321条(10.06%)、江南卷柏(Selaginella moellendorffii)2 102条(9.11%)。
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| 图 3 NR数据库同源物种的分布 Fig. 3 Distribution of homologous species in NR database |
与GO数据库比对后，共注释到17 643条转录本(图 4)。根据GO体系，这些注释结果分为三大功能类别：生物过程(biological process，33 613条)、分子功能(molecular function，22 263条)、细胞组分(cellular component，15 926条)。这些大类进一步细分为52个亚类。在生物过程的24个亚类中，代谢过程(metabolic process)是注释到转录本数量最多(8 317条)的亚类，其次为细胞过程(cellular process，7 948条)。在细胞组分的18个亚类中，细胞(cell)、细胞部分(cell part)和细胞器(organelle)注释到的转录本数量排前三，依次为3 166条、3 166条和2 172条；在分子功能的10个亚类中，Binding注释到转录本数量最多(11 928条)，其次是Catalytic activity(8 085条)。
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| 图 4 GO分析功能分类 Fig. 4 GO function classification |
通过KOG功能注释可进一步了解姬蕨转录本的功能特征(图 5)。共有15 839条转录本在KOG数据库中获得注释，并被划分至25个功能组别。其中，被归类到一般功能预测(general function prediction only)的转录本数量最多，共4 524条，占比28.56%；其次是信号转导机制(signal transduction mechanisms)，共1 794条，占比11.33%；此外，翻译后修饰、蛋白周转、分子伴侣(posttranslational modification, protein turnover, chaperones)和RNA加工与修饰(RNA processing and modification)也占有一定比例，分别为1 458条(9.21%)、1 041条(6.57%)。值得注意的是，有572条转录本被归类到次级代谢物的合成、运输和代谢(secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism)，这些转录本可能参与姬蕨次生代谢产物的合成、运输和积累等过程。
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| 图 5 KOG功能注释分类 Fig. 5 Function classification of KOG annotations |
2.3 转录因子分析
转录因子在基因表达调控过程中起关键作用，参与构建生物体复杂的基因表达调控网络。本研究对姬蕨全长转录本进行转录因子预测，共预测到转录因子1 458个，分属于29个转录因子家族。其中C3H家族的成员数目最多，共135个；其次是bHLH家族，共106个(图 6)。
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| 图 6 转录因子家族分类 Fig. 6 Types of transcription factor families |
2.4 转录本SSR分析
本研究共检测到32 772个序列含有SSR，二核苷酸重复是最主要的SSR类型，共检测到26 078个位点，占所有SSR的79.57%。其次为三核苷酸重复和单核苷酸重复，分别在3 123和3 029个序列中被检测到，占所有SSR的9.53% 和9.24%。此外，四核苷酸重复占0.93%(306个); 六核苷酸重复占0.58%(189个)；五核苷酸重复最少，仅占0.14%(47个)。在二核苷酸重复类型中，重复次数为5-8次的位点数量最多，共11 070个(图 7)。
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| 图 7 SSR数量类型分布 Fig. 7 Quantities and types of SSRs |
2.5 JA生物合成途径相关基因预测分析
基于KEGG注释结果，对姬蕨转录本中参与JA合成通路的基因进行预测分析，共鉴定出与该通路相关的转录本83条，其中包括13-LOX 10条、AOS 13条、AOC 4条、OPR3 8条、OPCL1 7条、ACX 26条、MFP 8条、3-KAT 3条、JAR1 4条(表 2)。姬蕨中JA的潜在合成过程如下：在叶绿体内，α-亚麻酸由13-LOX催化生成13-(S)-氢过氧-亚麻酸，随后在AOS、AOC的催化下生成12-OPDA。生成的12-OPDA进入过氧化物酶体，在OPCL1的催化下合成OPC-8:0辅酶A，然后在ACX、MFP、3-KAT的作用下进行3次β-氧化，最终生成JA。最后，JA被转运至细胞质，在JAR1的作用下转化为JA-Ile(图 8)。
| KO编号 KO No. |
基因功能 Gene function |
缩写 Abbreviation |
数量 Number of genes |
转录本ID Transcript ID |
| K00454 | 13-lipoxygenase | 13-LOX | 10 | 10747/f2p0/3856, 12731/f13p0/3685, 13948/f5p0/3599, 14022/f3p0/3595, 14913/f2p0/3534, 16203/f2p0/3454, 19224/f4p0/3185, 31502/f2p0/2553, 3715/f4p0/4634, 6287/f2p0/4286 |
| K01723 | Allene oxide synthase | AOS | 13 | 27502/f3p0/2765, 29506/f5p0/2601, 31044/f11p0/2544, 32875/f3p0/2477, 33645/f2p0/2454, 33986/f2p0/2419, 35399/f2p0/2341, 37947/f13p0/2183, 38927/f2p0/2146, 40550/f6p0/2045, 42767/f6p0/1857, 45036/f10p0/1715, 46161/f2p0/1573 |
| K10525 | Allene oxide cyclase | AOC | 4 | 13814/f3p0/3611, 20383/f6p0/3105, 22264/f3p0/3057, 48133/f2p0/1346 |
| K05894 | OPDA reductase 3 | OPR3 | 8 | 34247/f2p0/2405, 38717/f2p0/2162, 40085/f4p0/2076, 41539/f3p0/1983, 44596/f2p0/1759, 46883/f2p0/1531, 47319/f3p0/1477, 47379/f2p0/1483 |
| K10526 | OPC-8:0 CoA ligase 1 | OPCL1 | 7 | 34619/f3p0/2384, 35615/f2p0/2329, 36689/f2p0/2273, 37517/f10p0/2212, 37852/f3p0/2210, 39851/f3p0/2015, 39998/f2p0/2086 |
| K00232 | Acyl-CoA oxidase | ACX | 26 | 15230/f2p0/3494, 15707/f5p0/3401, 16310/f6p0/3409, 16345/f2p0/3432, 20751/f3p0/3209, 22585/f2p0/3039, 23887/f2p0/2965, 25886/f2p0/2852, 29272/f2p0/2674, 31020/f13p0/2532, 31363/f7p0/2506, 32467/f14p0/2474, 32559/f7p0/2499, 32616/f2p0/2492, 33248/f2p0/2458, 33930/f3p0/2422, 34075/f3p0/2441, 35005/f2p0/2362, 35083/f7p0/2358, 35169/f2p0/2367, 35456/f2p0/2338, 36279/f9p0/2265, 37600/f3p0/2240, 37863/f3p0/2212, 39267/f3p0/2127, 44182/f3p0/1745 |
| K10527 | Multifunctional protein | MFP | 8 | 23955/f7p0/2945, 25483/f5p0/2873, 27539/f27p0/2660, 27781/f8p0/2662, 28000/f24p0/2629, 28500/f3p0/2628, 32539/f2p0/2497, 33694/f2p0/2434 |
| K07513 | 3-ketoacyl-CoA thiolase | 3-KAT | 3 | 45963/f2p0/1637, 46194/f4p0/1609, 47293/f2p0/1475 |
| K14506/ K14487 | Jasmonate resistant 1 | JAR1 | 4 | 36409/f2p0/2295, 3062/f2p0/4787, 33508/f9p0/2438, 33711/f2p0/2432 |
| Note: the full Transcript ID is created by adding the prefix “transcript_HQ_HP1_transcript” (e.g., transcript_HQ_HP1_transcript10747/f2p0/3856). | ||||
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| 图 8 姬蕨中预测的JA及其衍生物生物合成途径 Fig. 8 Proposed pathway for synthesis of JA and its derivatives across the H.punctata transcriptome |
3 讨论 3.1 姬蕨全长转录组的构建
姬蕨作为一种非模式蕨类植物，长期缺乏系统的分子基础研究[12-13]。本研究首次利用PacBio三代测序技术对姬蕨进行全长转录组测序，经过严格的质量控制以及序列去冗余处理，共获得24 167条高质量转录本(表 1)。通过与七大公共数据库的比对注释，96.58%的转录本被成功注释，涵盖代谢通路、信号转导、转录因子等多个生物学过程(图 1、图 4、图 5)。特别是KEGG通路分析揭示，姬蕨中存在丰富的次生代谢物合成、运输和代谢相关通路(图 2)，暗示了其在环境适应过程中可能依赖多样化的次生代谢机制[24]。值得注意的是，与姬蕨转录本相似度较高的物种包括地钱、小立碗藓、巨云杉和江南卷柏等早期分化的陆生植物，提示其基因组中保留了这些早期陆生植物中进化保守的功能元件(图 3)。姬蕨全长转录组数据的获得不仅在一定程度上补充了早期维管植物，尤其是真蕨类植物的分子基础数据，也为蕨类植物功能基因的系统挖掘及其机制研究提供了高质量的数据资源。
3.2 JA合成相关基因注释JA作为重要的脂氧化类信号分子，其起源可追溯至植物登陆之前的共同祖先，并在陆生植物的演化过程中逐步获得稳定且关键的生理功能[25-26]。在部分藻类中已有JA或其前体物质的代谢痕迹被发现，提示该通路的起源可能早于植物的登陆[27]。对苔藓植物小立碗藓的研究表明，小立碗藓具备合成OPDA的能力，但未检测到JA或其活性衍生物JA-Ile的积累，暗示其合成通路可能在OPDA阶段即终止[7]。此外，地钱中的COI1-JAZ复合体可识别OPDA类分子而非JA-Ile，进一步支持早期陆生植物主要依赖OPDA类信号调控生理过程[28]。这一结果表明，苔藓植物虽已具备部分JA合成通路元件，但整体信号系统仍处于早期演化阶段[29]。进入维管植物后，JA的核心合成通路逐步完善，并在各主要类群中表现出较高的保守性。有研究证实，石松类卷柏属(Selaginella)植物珊瑚卷柏(Selaginella martensii)[8]和江南卷柏(Selaginella moellendorffi)[30]能够合成JA和JA-Ile，并可通过这些信号分子响应机械损伤和调控生长发育[8, 30]。类似地，真蕨类植物也表现出典型的JA合成与响应能力。例如，机械刺激可诱导欧洲蕨(Pteridium aquilinum)中JA的积累[10]；在铁线蕨的基因组中亦鉴定到JA合成通路所涉及的全部关键酶基因，并证实这些基因的表达受外界胁迫诱导[9]。这些研究结果共同支持了JA通路在真蕨类植物中已基本建立的观点。与早期陆生植物相比，种子植物中的JA合成与信号转导通路已高度完善，扩展JA功能的修饰途径广泛存在。例如，广泛存在于种子植物中的茉莉酸甲基转移酶能够将JA转化为其甲酯衍生物MeJA，这一分子在挥发信号传递和远距离防御调控中具有重要作用[31]。
本研究在真蕨类植物姬蕨中系统鉴定到83条与JA合成相关的转录本，涵盖13-LOX、AOS、AOC、OPR3、OPCL1、ACX、MFP、JAR1等多个酶家族成员(图 8)。这一结果强烈提示姬蕨具备较为完整的JA生物合成潜力。值得注意的是，本研究并未在姬蕨全长转录组数据中鉴定到茉莉酸羧基甲基转移酶基因的同源序列(表 2)。这一方面可能是源于转录组数据的局限性，例如某些基因因表达量过低或者具有组织、时空的表达特异性而未能被获取。另一方面，从进化的角度来看，本研究显示该基因的分布与功能在不同植物谱系中呈现明显差异。茉莉酸羧基甲基转移酶属于植物SABATH甲基转移酶家族，虽然在部分苔藓植物中已鉴定到若干SABATH家族成员，但未有证据表明这些成员具有茉莉酸羧基甲基转移酶的功能[32]；在石松类植物中，如卷柏属植物珊瑚卷柏虽然能够合成JA和JA-Ile，但其转录组序列中同样未发现编码茉莉酸羧基甲基转移酶的基因[8]。相比之下，在裸子植物如云杉(Picea abies)中，已报道有催化JA甲酯化活性的茉莉酸羧基甲基转移酶[33]；在被子植物中，功能性的茉莉酸羧基甲基转移酶则普遍存在，其产物MeJA在植物防御、发育调控及挥发性信号传递中发挥重要作用[34-35]。因此可以推测，功能性茉莉酸羧基甲基转移酶的出现可能是种子植物进化过程中产生并保留的创新性状，而早期分化的孢子植物并不具备这种催化能力。
植物体内的JA合成可通过两条途径实现，即十八烷途径和十六烷途径[5, 26]。进化研究表明，十八烷途径在维管植物中更为普遍，是JA合成的主要途径，而十六烷途径则被认为起源较早，在苔藓等早期陆生植物中更为普遍，其产物dn-OPDA在这些类群中可能是主要的信号分子[7, 28-30]。本研究在姬蕨转录组中鉴定到13-LOX、AOS、AOC及OPR3等完整的基因家族成员，覆盖了上述两条途径的关键步骤，但是两条途径在姬蕨JA合成中的具体贡献仍不清楚。未来可通过检测12-OPDA和dn-OPDA的体内含量动态、外源信号敏感性以及同工酶的底物特异性等来进一步厘清两条途径在姬蕨防御反应中的具体作用。
3.3 JA信号转导相关转录因子鉴定与潜在功能在被子植物中，诱导型防御已被确立为应对昆虫取食的关键防御机制，JA是核心信号分子[6]。被昆虫取食后，JA在植物体内快速合成，并通过信号转导驱动相关防御基因的表达和挥发物的释放[5]。然而，在真蕨类植物等早期陆生维管植物中，是否存在JA介导的诱导型防御，目前还缺乏系统的研究以及直接证据[9-10]。Radhika等[10]研究发现，虽然欧洲蕨具有合成JA的能力，JA也能够诱导下游防御响应，但是虫食信号却无法启动防御响应，也未能诱导JA的积累。与该研究结果不同，在姬蕨中有生态学证据表明，其在遭受昆虫取食时会释放特定的挥发物，且这些挥发物能够吸引捕食性天敌齿缘刺猎蝽[13]。这一结果不仅直接证明了姬蕨具有诱导型防御能力，也提示真蕨类植物的防御响应或存在物种特异性。同时，姬蕨为成为进一步探讨JA信号通路是否参与蕨类植物诱导防御的理想材料。
本研究在姬蕨的转录本中共预测到29个转录因子家族，涵盖1 458个成员，其中bHLH、ERF、WRKY和NAC家族与JA信号转导的潜在关系最为密切(图 6)。在这些转录因子家族中，部分成员在种子植物中已被报道与JA相关的生物合成或信号通路密切相关。例如，bHLH家族中的MYC类转录因子被认为是JA信号转导通路中的核心正调控因子，能够响应JA-Ile信号并调控防御相关基因的表达；此外，ERF、WRKY、NAC等家族的成员也在JA介导的逆境响应、挥发物释放及次生代谢调控中发挥重要作用[5]。因此，姬蕨中丰富的转录因子资源，特别是bHLH类数量较多，可能在其JA相关信号调控网络中发挥关键功能。未来的研究需要结合代谢物检测和基因功能验证实验，以明确该调控网络是否真正参与姬蕨的昆虫取食防御。
4 结论姬蕨因受到昆虫取食后能释放挥发物并吸引其天敌，被认为是研究真蕨类植物诱导型防御的理想材料。然而其分子研究滞后，缺乏高质量序列信息。本研究利用PacBio三代测序技术构建了姬蕨的高质量全长转录组，共获得24 167条非冗余转录本，其中96.58%的转录本得到了功能注释，并鉴定出丰富的转录因子家族和SSR，显著丰富了该物种的分子数据资源。进一步分析共鉴定到83条与JA合成通路相关的转录本，涵盖13-LOX、AOS、AOC、OPR3、OPCL1、MFP、ACX、3-KAT和JAR1等关键酶家族成员，提示姬蕨具备较为完整的JA生物合成潜力。本研究为解析姬蕨的JA合成通路及分子防御机制打下了坚实基础。未来需要结合代谢物检测、基因功能验证及生态学实验，进一步阐明JA信号在姬蕨诱导型防御中的具体作用和网络调控。
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