加拿大一枝黄花(Solidago canadensis)是菊科(Asteraceae)一枝黄花属(Solidago)多年生草本植物^[1]，被我国列入第二批外来入侵物种名单，是我国危害严重的入侵植物之一^[2]。加拿大一枝黄花入侵的重要机制之一是具有较强的化感作用，其可通过分泌黄酮、酚类等化感物质，并由根、茎、叶向土壤或空气中释放，影响周围其他植物的生长^[3]；其浸提液可使受体植株活性氧清除系统的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性下降，导致细胞内自由基浓度失衡，引起叶绿素降解加速、荧光动力学参数异常以及光合系统功能紊乱，使光合效能下降，抑制植株生长^[4]。

加拿大一枝黄花不同部位及不同提取方式的浸提液对受体植物的影响存在差异，并且现有研究大多以被子植物为对象。例如，加拿大一枝黄花茎、叶的水浸提液对辣椒(Capsicum annuum)等作物的抑制作用强于地下部分^[5]；鲜根茎和鲜叶片的组织粉碎抽滤液对7种杂草的影响大于鲜根茎和鲜叶片的水浸提液^[6]；根、茎、叶的乙醇提取液对桑树(Morus alba)等的种子萌发和幼苗生长的抑制作用强于水浸提液^[7]；Reznicek等^[8]证实乙醇提取可高效富集黄酮类、绿原酸衍生物及挥发油，有毒的萜类化合物可抑制植株淀粉酶与呼吸酶活性^[9]。

蕨类植物配子体作为结构简单的单倍体世代，独立于孢子体进行有性生殖，其发育极易受外界环境因素的影响，故可用于研究植物对环境的响应以及揭示其机理。目前，仅有加拿大一枝黄花对红盖鳞毛蕨(Dryopteris erythrosora)的影响研究，研究发现其地上部分水浸提液对红盖鳞毛蕨孢子萌发的抑制作用及性别分化影响较地下部分更强，且呈现浓度依赖性^[10]。而加拿大一枝黄花水浸提液对其他蕨类植物是否存在影响尚未可知；同时，其乙醇浸提液对蕨类植物配子体发育的影响亦缺乏研究。

水蕨(Ceratopteris thalictroides)属于水蕨科(Parkeriaceae)水蕨属(Ceratopteris)，生于池沼、水田或水沟的淤泥中^[11]；而加拿大一枝黄花可见于河滩、农田等地^[12]，两者生境存在重合，如福建厦门。因生态环境恶化，水蕨受到严重威胁而濒临灭绝，现被列为国家二级重点保护野生植物^[13]。因此，本研究基于加拿大一枝黄花不同部位的水浸提液与乙醇浸提液对水蕨孢子萌发、配子体发育和性别分化的影响进行研究，明确加拿大一枝黄花对水蕨配子体发育是否存在影响，为评估加拿大一枝黄花生态影响及生物胁迫机制积累基础资料，为健全野生蕨类植物保护体系提供数据支持。

1 材料与方法 1.1 材料

本研究使用的水蕨孢子于2022年采自上海师范大学奉贤校区生物基地的成熟、健康水蕨植株孢子叶，待孢子叶自然风干后收集纯孢子于信封中，保存于4 ℃冰箱。凭证标本由曹建国教授鉴定，现保存于上海师范大学蕨类植物研究室。加拿大一枝黄花植株于2024年5-6月采自同一基地，每次采样选取10株处于营养生长盛期的植株。

1.2 方法 1.2.1 加拿大一枝黄花水浸提液母液制备及水浸提液Knop′s培养基配制

参考秦勤等^[10]的方法配制不同质量浓度加拿大一枝黄花各部位水浸提液及Knop′s培养基。选取处于营养生长盛期的加拿大一枝黄花植株，去除病老残组织后，经自来水漂洗和蒸馏水二次冲洗，使用滤纸吸干水分。将根、茎、叶各部位组织分离，粉碎根和叶，茎切成约12 cm小段。按每100 mL重蒸馏水与8 g根、茎、叶各组织鲜重的比例分别浸泡于锥形瓶内，放置于摇床上振荡浸提24 h，转速为130 r/min。使用干净的3层纱布过滤，即得质量浓度为0.080 g·mL^-1的加拿大一枝黄花根、茎、叶水浸提液母液。用去离子水梯度稀释母液后，得到质量浓度分别为0.008、0.024、0.040 g·mL^-1的加拿大一枝黄花根、茎、叶水浸提液，并制备水浸提液Knop′s培养基。以0.000 g·mL^-1的水浸提液作为对照(CK_T)处理。依据提取部位不同，共制备9种培养基处理(T_1R、T_2R、T_3R、T_1S、T_2S、T_3S、T_1L、T_2L、T_3L)，备用。其中，T_1R、T_2R、T_3R分别表示0.008、0.024、0.040 g·mL^-1根水浸提液；T_1S、T_2S、T_3S分别表示0.008、0.024、0.040 g·mL^-1茎水浸提液；T_1L、T_2L、T_3L分别表示0.008、0.024、0.040 g·mL^-1叶水浸提液。

1.2.2 加拿大一枝黄花乙醇浸提液母液制备及乙醇浸提液Knop′s培养基配制

选取处于营养生长盛期的加拿大一枝黄花植株，去除病老残组织后，经自来水漂洗和蒸馏水二次冲洗，使用滤纸吸干水分。将根、茎、叶各部位组织分离，放入烘箱内烘干24 h。使用粉碎机粉碎后，以1∶10的比例加入95%乙醇溶液浸泡24 h，过滤后使用R-100型旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司)旋干，即得初浸提膏。取过滤后的各部分植物组织，以1∶10的比例再次加入95%乙醇溶液浸泡24 h，重复上述操作，即得再浸提膏。将两次浸提膏混合后，加入超纯水制备质量浓度为0.080 g·mL^-1的加拿大一枝黄花根、茎、叶乙醇浸提液母液，4 ℃冷藏保存。将醇浸提液母液用去离子水梯度稀释，得到质量浓度为0.002、0.004 g·mL^-1的加拿大一枝黄花乙醇浸提液，参考秦勤等^[10]制备乙醇浸提液Knop′s培养基，以0.000 g·mL^-1的乙醇浸提液作为对照(CK_E)处理，共制备6种培养基处理(E_1R、E_2R、E_1S、E_2S、E_1L、E_2L)，备用。其中，E_1R、E_2R分别表示0.002、0.004 g·mL^-1根乙醇浸提液；E_1S、E_2S分别表示0.002、0.004 g·mL^-1茎乙醇浸提液；E_1L、E_2L分别表示0.002、0.004 g·mL^-1叶乙醇浸提液。

1.2.3 水蕨孢子接种与培养

参考戴锡玲等^[14]的方法进行孢子培养。以约30个/cm²的接种密度，均匀接种于不同处理的培养基上，置于ZRX-300E型光照培养箱(杭州钱江仪器设备有限公司)培养。培养条件为温度25 ℃，每日光照18 h，光照强度约为2 000 lx，相对空气湿度60%-70%。每种处理设置3个重复，每个重复接种于6个直径为6 cm的培养皿中。

1.2.4 水蕨孢子萌发率与性别分化观察

参考秦勤等^[10]的方法进行观察。在接种后3 d统计孢子萌发率，每隔2 d计数一次，直至萌发率不再上升。接种后28 d，统计各处理组雌性、雄性和两性配子体的数量。

1.2.5 水蕨配子体形态观察

自接种后第7天开始，每隔7 d取具代表性的配子体，使用Nikon SMZ1500型光学显微镜(日本尼康株式会社)观察、记录并拍照。

1.2.6 数据分析

最终数据均取自3个独立实验批次的平均值，数据整理采用Excel 2021软件完成，使用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan′s多重比较。

2 结果与分析 2.1 加拿大一枝黄花浸提液对水蕨孢子萌发的影响

加拿大一枝黄花在水浸提液处理下，CK_T及各处理组孢子均在接种3 d开始萌发，至15 d萌发率趋于稳定；随培养时间的延长，各处理组萌发率整体呈上升趋势，但高浓度处理组(0.040 g·mL^-1)增速显著滞后。第15天的孢子萌发率方差分析显示，各处理组萌发率均显著低于CK_T(P＜0.05)，其中T_3R的萌发率为74.07%，显著低于T_3L(78.90%)和T_3S(80.89%)(P＜0.05)(表 1)。由此可知，加拿大一枝黄花根水浸提液对孢子萌发抑制作用最强，其次为叶、茎。

加拿大一枝黄花在乙醇浸提液处理下，仅CK_E、E_1S接种3 d开始萌发，其余处理组延迟至接种5 d开始萌发，至15 d萌发率趋于稳定；随培养时间延长，各处理组萌发率整体呈上升趋势，但高浓度处理组(0.004 g·mL^-1)增速整体显著滞后。对第15天的最终萌发率进行方差分析可得，E_2R的萌发率仅为11.28%，显著低于E_2L(76.40%)和E_2S(86.55%)(P＜0.05)，且根、叶、茎乙醇浸提液处理组均导致孢子延迟萌发(表 2)。由此可知，加拿大一枝黄花根乙醇浸提液对孢子萌发抑制作用最强，其次为叶、茎。

2.2 加拿大一枝黄花浸提液对水蕨配子体发育的影响

加拿大一枝黄花根、茎、叶各浓度浸提液处理下，随着不同部位浸提液浓度的升高，各处理组水蕨配子体发育速度减缓，平均大小逐渐减小，出现畸形雄配子体的比例升高。

加拿大一枝黄花水浸提液处理下，接种14 d，CK_T发育为心脏形两性配子体，配子体边缘较平滑，其余各处理组开始形成精子器；T_3S[图 1(a)]和T_3L[图 1(b)]发育至幼原叶体初期，都为不对称的心脏形，其上多精子器，多为雄配子体；T_3R仅发育至片状体末期，片状体形态较小且具分支状，边缘形成精子器，发育程度明显晚于其他组[图 1(c)]。由此可知，加拿大一枝黄花根水浸提液对配子体形态发育抑制作用最强，其次为茎、叶。

加拿大一枝黄花乙醇浸提液处理下，接种14 d，E_1R、E_2R配子体发育受到强烈抑制，处于萌发初期；E_2S、E_2L开始形成精子器。其中，E_2S处于片状体早期，边缘形成精子器，并伴随叶绿体分布不均[图 1(d)]；E_2L发育至片状体末期，呈现分支状畸形，其上长有精子器并有衰老趋势[图 1(e)]。接种21 d，E_1R发育形成分支片状体，边缘形成精子器，并有衰老趋势[图 1(f)]；E_2R中孢子萌发率极低，发育进程明显迟缓，个别形成丝状体，且因早衰而未能进入性别分化阶段。由此可知，加拿大一枝黄花根乙醇浸提液对配子体形态发育抑制作用最强，其次为茎、叶。

2.3 加拿大一枝黄花浸提液对水蕨性别分化的影响

与对照组相比，加拿大一枝黄花根、茎、叶高浓度浸提液处理组水蕨的雄配子体比例显著上升，两性配子体及雌配子体比例显著下降，且存在浓度依赖性(表 3、表 4)。

加拿大一枝黄花水浸提液处理下，各处理组及CK_T配子体均能正常进入性别分化阶段，除T_1R外，其余处理组两性配子体占比显著低于CK_T；除T_1R、T_2R、T_1S外，其余各处理组雄配子体占比显著高于CK_T。其中，T_3L雄配子体占比(61.4%)显著高于CK_T(P＜0.05)，且为所有处理组中最高，同时其两性配子体占比(33.7%)显著低于CK_T(P＜0.05)，为所有处理组中最低。由此可知，叶水浸提液对水蕨性别分化抑制作用最强，其次为茎、根。

加拿大一枝黄花乙醇浸提液处理下，各处理组与CK_E的雄配子体比例差异均达到显著水平(P＜0.05)。其中，E_1R、E_1L、E_2L、E_1S、E_2S少数配子体可进入性别分化阶段，且全部分化为雄配子体，E_2R配子体则全部因早衰或在片状体阶段死亡，无法正常性别分化，未形成性器官。由此可知，低浓度乙醇浸提液处理下幸存配子体全部发育为雄配子体，高浓度则造成广泛死亡，其中根乙醇浸提液对水蕨性别分化抑制作用最强，其次为茎、叶。

3 讨论

本研究发现，加拿大一枝黄花的根、茎、叶浸提液对水蕨配子体发育影响显著，具体表现为延迟孢子萌发，降低萌发率；导致配子体发育阶段滞后并提前进入衰老阶段，配子体形态较小或畸形，叶绿体分布不均；易诱导形成雄配子体，或因早衰不能进行性别分化。这些表现与加拿大一枝黄花对红盖鳞毛蕨配子体发育的影响^[10]存在相似性。加拿大一枝黄花叶水浸提液对红盖鳞毛蕨孢子萌发的抑制作用较强，而茎水浸提液对其性别分化影响更显著，且均呈浓度依赖性^[10]。相比之下，本研究加拿大一枝黄花根水浸提液对水蕨孢子萌发和配子体形态发育的抑制作用较强，而叶水浸提液则对水蕨性别分化的抑制作用较强。这种差异可能源于加拿大一枝黄花不同器官(根、茎、叶)中化感物质的种类组成、浓度及释放途径具有特异性^[15]，从而导致次生代谢产物的合成积累特征不同^[16]。因此，不同蕨类植物对加拿大一枝黄花各部位化感物质的响应存在显著的种间差异^[17]。上述结果表明，加拿大一枝黄花对受体蕨类植物的影响具有物种特异性和作用器官选择性的双重特征，其内在分子机制有待进一步阐明。

本研究结果显示，相较于水浸提液，乙醇浸提液对水蕨配子体发育的抑制作用显著增强，且地下部分强于地上部分，具体表现为孢子萌发进程延迟且萌发率降低，配子体畸形率与早衰率升高，并显著诱导雄配子体分化。该结果与黄洪武等^[18]的研究结果一致，其研究也表明加拿大一枝黄花根、茎、叶乙醇提取液(尤以叶部乙醇提取液)的抑制作用较水提取液稍强。此外，加拿大一枝黄花根部的有机萃取相(乙酸乙酯、正丁醇)较水提物对莴苣(Lactuca sativa)、小麦(Triticum aestivum)等植物表现出更强的浓度依赖性化感抑制效应^[19]。这种作用差异主要源于提取溶剂对化感物质的选择性溶解。目前，已从加拿大一枝黄花中鉴定出萜类、黄酮类、酚类及精油等化感活性成分^[20]，其中马腾^[21]从其全草乙醇提取物中分离出6-羟基-3, 13Z-二烯-15, 16-克罗烷内酯等14种化合物。综上所述，乙醇浸提液含有更丰富的化感活性成分，因而对蕨类植物配子体发育表现出更强的抑制作用。

4 结论

本研究探讨加拿大一枝黄花浸提液对蕨类植物配子体的影响，结果显示：

(1) 加拿大一枝黄花不同器官浸提液处理后，水蕨孢子萌发率显著降低，配子体发育进程显著延迟，配子体发育畸形，早衰，雄配子体占比显著上升、雌配子体和两性配子体占比显著下降，并存在浓度依赖性，最终影响水蕨的有性生殖。

(2) 加拿大一枝黄花根水浸提液对水蕨孢子萌发及配子体形态发育的抑制作用强于茎、叶；叶水浸提液对水蕨性别分化的影响强于茎、根。

(3) 加拿大一枝黄花乙醇浸提液对水蕨配子体发育的影响强于水浸提液，根乙醇浸提液对水蕨孢子萌发、配子体形态发育和性别分化的影响均强于茎、叶，即地下部分乙醇浸提液的抑制作用强于地上部分。

加拿大一枝黄花对蕨类植物的化感影响研究目前仍处于初步探索阶段，尚缺乏细胞分子层面的机制研究。为健全野生蕨类植物保护体系，应加强原生境保护，减少人为干扰并防控外来物种入侵，同时系统推进种质资源保存与科学引种工作^[22]。