2. 广西大学, 广西南海珊瑚礁研究重点实验室, 广西南宁 530004;
3. 广西大学资源环境与材料学院, 广西南宁 530004
2. Guangxi Laboratory on the Study of Coral Reefs in the South China Sea, Guangxi University, Nanning, Guangxi, 530004, China;
3. School of Resources, Environment and Materials, Guangxi University, Nanning, Guangxi, 530004, China
珊瑚及其共附生微生物，包括虫黄藻，以及与其长期互利共生的细菌、古菌、真菌、原生动物和病毒等，共同组成了珊瑚共生功能体(Coral holobiont)[1]。在该共生系统中，虫黄藻作为重要组成部分，通过光合作用为珊瑚提供超过95%的光合能量[2]，使其得以在营养贫瘠的浅海环境中生存。研究表明，仅虫黄藻等共生藻对溶解无机氮、无机磷的吸收利用就可以满足珊瑚的快速生长所需[3]。此外，虫黄藻吸收的CO2也参与珊瑚的钙化过程，促进其骨骼生长，为其他生物提供结构支持[4]。相应地，珊瑚则为虫黄藻提供受保护的栖息环境，并供应CO2、氮、磷等无机营养物质[5]。蓝藻同样是珊瑚共生功能体中一类重要的光合微生物，也是优势共生藻之一[6]。已有研究显示，在某些珊瑚共生微生物组中，蓝藻的丰度仅次于虫黄藻，部分珊瑚共生功能体中蓝藻甚至占细菌总数的50%以上[7]。蓝藻能够通过固氮作用为珊瑚提供额外氮源，参与整个共生功能体的氮循环，提供细胞修复所需要的氮，促进光合作用[8-9]，从而帮助珊瑚在逆境中维持稳态并增强其对热白化的抵抗能力[10-12]。需要指出的是，珊瑚的热白化并非单一物种作用的结果，而是“珊瑚-微生物”共生体失衡的综合体现。目前，关于虫黄藻在珊瑚热应激响应中的作用已有较为深入的研究，然而对共生微生物组中其他成员的功能机制，尤其是“虫黄藻-蓝藻”之间的代谢协调机理，仍了解不足。
关于珊瑚共生蓝藻的研究多聚焦于其在珊瑚宿主内发挥的能量供给、物质循环及环境适应等方面的多维功能。蓝藻可能通过代谢交互与虫黄藻形成互补网络，在珊瑚共生功能体中，二者的代谢协调对珊瑚的营养获取、环境适应力以及抗逆性具有关键作用。例如，有研究发现，加勒比海珊瑚Montastraea cavernosa中的虫黄藻会优先使用蓝藻固氮作用的产物[13]，这些产物还可直接整合进珊瑚宿主的氨基酸合成途径[14]。在红海珊瑚Stylophora pistillata中，共生蓝藻甚至可满足宿主高达30%的氮源需求[15]，其重要性不言而喻。此外，蓝藻还能通过抗氧化与耐高温机制直接增强珊瑚对环境胁迫的适应能力。高温胁迫下，蓝藻丰度显著上升，其合成的热休克蛋白(Hsp70)和超氧化物歧化酶(SOD)有助于清除宿主组织内的活性氧(ROS)[16]。蓝藻与虫黄藻之间也可能存在协同响应机制：夏季高温条件下，虫黄藻密度下降，蓝藻丰度显著上升，二者此消彼长的协同变化有助于提升珊瑚宿主应对环境变化的能力[17]。Liang等[18]在研究杯形珊瑚(Pocillopora sp.)的高温胁迫与恢复过程时发现，尽管虫黄藻密度显著降低，蓝藻的相对丰度却明显上升，而珊瑚的最大光化学效率(Fv/Fm)未受显著影响，说明蓝藻可能在能量供给与恢复过程中发挥了补偿作用。在营养匮乏的情况下，虫黄藻还会通过主动摄食蓝藻以补充氮源。这一发现不仅更新了人们对虫黄藻营养模式(主要依赖光合作用)的传统认知，也揭示了虫黄藻在珊瑚共生功能体中更为复杂的营养互作关系[19]。因此，深入解析珊瑚共生功能体中虫黄藻与蓝藻之间的代谢协调机制，不仅有助于揭示珊瑚共生功能体的稳态维持机制，也为提升珊瑚应对气候变化与营养扰动的适应力提供新思路。
综上所述，目前关于内共生蓝藻和虫黄藻互作的研究多从珊瑚宿主角度展开。然而，由于共生体中复杂的生物互作网络，研究人员对蓝藻和虫黄藻之间代谢协调机制的整体认识仍较为有限。现有研究多关注高温[20]、高光[21]或酸化[22]等环境胁迫下虫黄藻的生理变化与基因表达，而对其与蓝藻共培养等生物互作情形的探讨相对不足。研究表明，虫黄藻在25 ℃条件下表现出较高的生长速率和光合活性[23]；而当温度超过31 ℃时，Fv/Fm开始显著下降，32 ℃被认为已产生明显高温胁迫效应[24]。在珊瑚共生功能体中，32 ℃培养条件下虫黄藻会出现大量差异表达基因，说明该温度已超出其稳态耐受范围[25]。此外，珊瑚热白化会损伤虫黄藻的光合系统，导致其光合作用能力下降，研究也发现高温胁迫显著抑制虫黄藻光合作用相关基因的表达[26]。在光合作用相关基因中，psbA基因编码光系统Ⅱ(PSⅡ)的D1蛋白，其表达水平反映光合系统的修复能力[27]；rbcL基因则编码核酮糖-1, 5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RuBisCO)大亚基，是评估碳固定效率的关键指标[28]。二者均为虫黄藻响应环境变化的核心功能基因，然而蓝藻是否调控其表达尚不明确。为深入探究蓝藻对虫黄藻生理生化特性的影响，特别是对其在psbA与rbcL基因表达、光合作用及碳同化能力方面的调控作用，本研究以环境敏感型虫黄藻Cladocopium goreaui、环境耐受型虫黄藻Durusdinium trenchii以及蓝藻Synechococcus sp.GXU01(以下简称GXU01)为研究对象，建立共培养体系，通过测定虫黄藻生长率、光合色素含量、Fv/Fm、ROS水平以及关键基因表达等指标，系统分析游离状态下珊瑚共生蓝藻对两种典型虫黄藻的代谢协调作用，以期为理解珊瑚共生功能体的热适应机制与热白化响应提供新视角。
1 材料与方法 1.1 材料GXU01由本课题组从涠洲岛(21°10′-21°54′N，109°00′-109°15′E)十字牡丹珊瑚(Pavona decussata)中分离并保存[17]。实验时，将该菌株接种于含3.5%海盐的蓝藻培养基(BG-11培养基)，置于温度25 ℃、光照强度4 000 Lux、光暗比12∶12的二氧化碳型人工气候箱(RDN-500D-CO2，宁波扬辉仪器有限公司)中培养。虫黄藻C.goreaui和D.trenchii分别分离自涠洲岛的霜鹿角珊瑚(Acropora pruinose)和西沙群岛(15°46′-17°08′N，111°11′-112°54′E)的丛生盔形珊瑚(Galaxea fascicularis)，其培养方法参照覃良云等[29]的研究。
1.2 实验设计本研究采用双因素(温度、GXU01共培养)实验设计，以探究虫黄藻C.goreaui (C1)、D.trenchii (D1)分别与GXU01共培养的协调作用机理。实验分组设计如下：对照组(25C1，25D1)，常温共培养组(25C1+，25D1+)，高温胁迫组(32C1，32D1)，高温共培养组(32C1+，32D1+)，分别设3个生物学重复。其中，组名中的25和32分别指25 ℃(对照)与32 ℃(高温胁迫)两种温度条件。
将GXU01和C1、D1分别用BG-11培养基和L1培养基在25 ℃条件下预培养至4×105 cells/mL。随后，将GXU01以10 000 r/min离心5 min，并用无菌海水洗涤沉淀3次。经预处理的GXU01以0.5%(V/V)[17]接种至含等密度C1、D1的L1培养基。混合藻液分装至250 mL锥形瓶，置于二氧化碳型人工气候箱中培养。培养条件：温度25 ℃/32 ℃，湿度60% RH，CO2含量1 964 mg/m3，光照强度4 000 Lux，光照周期12 h。培养期间，每日早晚各摇匀一次培养基。
1.3 虫黄藻密度测定分别取培养1、4、7 d的藻液2 mL，使用浮游植物流式细胞仪(CytoSense，荷兰CytoBuoy公司)测定虫黄藻密度。测定前将藻液充分涡旋混匀，设置样品流速为3 μL/s，测量时间60 s，每组样品重复测量9次并取平均值。
1.4 细胞光合效率测定在培养的第1、3、5、7天晚上，将藻液在黑暗环境中避光处理30 min后，使用连续监测荧光仪(Monitoring PAM，德国WALZ公司)测定Fv/Fm。测量前摇匀藻液，并将探头垂直置于锥形瓶底部。电信号阻尼(Damping)和增益(Gain)分别设置为1和2。每组样品重复测量9次，结果取平均值。
1.5 光合色素测定在培养的第1、4、7天，取藻液各1 mL至离心管中，在4 ℃条件下以8 000 r/min离心5 min，去上清液，再加入1 mL 100%甲醇后用锡纸覆盖，放入4 ℃冰箱中黑暗保存24 h，利用紫外分光光度计[UV-2700，岛津仪器(苏州)有限公司]分别测定其在665、470、652 nm处的吸光度(记为A665、A470、A652)，并计算叶绿素a(Chl a)、叶绿素b(Chl b)和类胡萝卜素(Carotenoid)的含量。单细胞的色素含量用密度(cells/mL)换算。计算公式[30]如下：
| $\begin{aligned} & \operatorname{Chl} a(\mu \mathrm{~g} / \mathrm{mL})=16.72 A_{665}-9.16 A_{652}, \\ & \operatorname{Chl} b(\mu \mathrm{~g} / \mathrm{mL})=34.09 A_{652}-15.28 A_{665}, \\ & \operatorname{Carotenoid}(\mu \mathrm{g} / \mathrm{mL})=\left(1000 A_{470}-1.63 \mathrm{Chl} a-\right. 15.28 \mathrm{Chl} b) / 221 。\end{aligned} $ |
取培养至第7天的藻液各1 mL，离心后取上清液加入DCFH-DA探针(终浓度为10 μmol/L)，取200 μL加入96孔板中，锡箔纸包裹于37 ℃水浴孵育30 min，立即放至酶标仪(Varioskan Lux 3020，美国Thermo Fisher Scientific公司)检测荧光强度，激发波长488 nm，发射波长525 nm。
1.7 RT-qPCR功能验证为验证蓝藻对虫黄藻光合作用的影响，挑选虫黄藻psbA和rbcL两个光合作用相关基因，分析藻液中基因表达的变化规律，虫黄藻内参基因选择GAPDH基因[31]，相关基因引物序列见表 1。
1.7.1 总RNA提取与反转录
取培养至第7天的藻液，使用MolPure® Plant RNA Kit植物RNA提取试剂盒[翌圣生物科技(上海)股份有限公司]提取总RNA，并经紫外分光光度计测定其浓度和质量。根据PrimeScriptTM RT reagent Kit反转录试剂盒(日本Takara Bio公司)使用说明书，将RNA反转录为cDNA。具体反应体系见表 2。反应程序如下：37 ℃孵育15 min；84 ℃加热5 s使反转录酶失活；最后冷却至4 ℃保存，用于后续实验。
| Unit: μL | |||||||||||||||||||||||||||||
| 组分 Component |
添加量 Addition amount |
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| 5×PrimeScript Buffer (real time) | 2.0 | ||||||||||||||||||||||||||||
| PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ | 0.5 | ||||||||||||||||||||||||||||
| Oligo dT Primer (50 μmol/L) | 0.5 | ||||||||||||||||||||||||||||
| Random 6 mers (100 μmol/L) | 0.5 | ||||||||||||||||||||||||||||
| Total RNA | 6.5 | ||||||||||||||||||||||||||||
1.7.2 RT-qPCR反应与分析
采用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒(Q711，南京诺唯赞生物科技股份有限公司)，RT-qPCR反应体系见表 3。RT-qPCR反应程序设置如下：首先在95 ℃下预变性30 s；随后进行40个循环，每个循环包括95 ℃ 10 s与60 ℃ 30 s两个步骤；扩增结束后，进行熔解曲线分析，熔解条件采用仪器默认程序。所使用仪器为荧光定量PCR仪(7500Fast，美国ABI公司)。采用2-△△Ct法对基因相对表达量进行分析，虫黄藻基因相对表达量是以GAPDH作为内参基因，以25 ℃无GXU01添加组为对照组计算获得。
| Unit: μL | |||||||||||||||||||||||||||||
| 组分 Component |
添加量 Addition amount |
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| 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix | 5.0 | ||||||||||||||||||||||||||||
| Primer 1 (10 μmol/L) | 0.2 | ||||||||||||||||||||||||||||
| Primer 2 (10 μmol/L) | 0.2 | ||||||||||||||||||||||||||||
| cDNA | 2.0 | ||||||||||||||||||||||||||||
| ddH2O | 3.6 | ||||||||||||||||||||||||||||
1.8 数据统计
使用Excel 2021对实验中获得的数据进行预处理，统计分析及绘图均在GraphPad Prism 10.1.2中进行，结果以平均值±标准差(Mean±SD)表示。若数据满足高斯正态分布，通过单因素方差分析(One-way ANOVA)对所有实验数据进行显著性检验，组间差异通过Tukey多重比较检验进行分析；若数据不满足高斯正态分布，则采用Kruskal-Wallis检验并使用Dunn多重比较检验进行组间比较，显著性水平设为P < 0.05。
2 结果与分析 2.1 共培养下虫黄藻生理生化指标 2.1.1 虫黄藻密度(1) GXU01对虫黄藻生长的影响。在C.goreaui中，第4天共培养组(25C1+与32C1+)的细胞密度相较对照组(25C1与32C1)略有上升；但至第7天，两组间差异不明显[图 1(a)]。在D.trenchii中，第1天与第4天共培养组(25D1+与32D1+)的细胞密度亦呈现上升趋势，但差异不显著[图 1(b)]。整体上，GXU01对两种虫黄藻的生长均未产生显著影响。
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| Different letters indicate significant differences among groups (P < 0.05). 图 1 不同温度下虫黄藻密度变化 Fig. 1 Changes in density of Symbiodiniaceae at different temperatures |
(2) 温度对虫黄藻生长的影响。高温处理显著抑制了两种虫黄藻的生长(第7天)。在C.goreaui中，32C1组较25C1下降了55.28%，32C1+较25C1+下降了56.23%；在D.trenchii中，32D1较25D1下降了52.95%，32D1+较25D1+下降了49.26%，两者均达到显著差异水平(P < 0.05)。综上，GXU01对两种虫黄藻的生长均没有显著影响，而高温会显著抑制虫黄藻的生长。
2.1.2 虫黄藻光合色素(1) C.goreaui虫黄藻响应特征。实验前期(第1至第4天)，共培养对C.goreaui的叶绿素b含量呈阶段性促进，共培养组(25C1+和32C1+)叶绿素b含量显著高于对照组(P < 0.05)，提升幅度分别为20.44%-29.14%(25 ℃)和10.21%-18.22%(32 ℃)，到第7天差异不再显著。叶绿素a和类胡萝卜素则仅在第4天25C1+显著高于对照组(P < 0.05)，其他阶段无显著差异。25 ℃时C.goreaui色素含量随时间持续下降，32 ℃高温胁迫下则整体维持较高稳定水平。至第7天，32C1相较于25C1，叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量分别高出53.23%、60.66%和48.76%；共培养组(32C1+相较25C1+)的提升幅度更高，分别为61.00%、68.62%和64.18%[图 2：(a)、(c)、(e)]。
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| Different letters indicate significant differences among groups (P < 0.05). 图 2 不同温度下虫黄藻光合色素含量变化 Fig. 2 Changes in photosynthetic pigment content of Symbiodiniaceae at different temperatures |
(2) D.trenchii虫黄藻响应特征。共培养对D.trenchii光合色素有明显的抑制效应，在前期(第1天)，共培养组光合色素含量显著降低，其中叶绿素a降低24.50%-27.14%、叶绿素b降低27.75%-29.60%、类胡萝卜素降低25.10%-27.31%。随着时间推移，抑制效应减弱，第4-7天降幅收窄。分析温度对光合色素的调控发现，25 ℃时，单细胞色素含量随时间持续下降；32 ℃高温胁迫下，色素维持较高水平。第7天时，32D1较25D1叶绿素a高出43.58%、叶绿素b高出21.63%、类胡萝卜素高出43.81%；而共培养条件下，32D1+较25D1+叶绿素a高出48.51%、叶绿素b高出32.91%、类胡萝卜素高出39.16%[图 2：(b)、(d)、(f)]。
C.goreaui和D.trenchii在与GXU01共培养时物种特异性差异显著，D.trenchii对共培养的敏感度高于C.goreaui。
2.1.3 虫黄藻Fv/Fm如图 3所示，C.goreaui的Fv/Fm在25 ℃时较为稳定，第1天Fv/Fm为0.58±0.03，第7天保持在0.59±0.03；而D.trenchii的Fv/Fm在第1天为0.56±0.05，到第7天时，显著提升至0.61±0.03(P < 0.05)。32 ℃高温胁迫时，虫黄藻Fv/Fm出现显著下降，C.goreaui的Fv/Fm从第1天的0.55±0.03显著降低至第7天的0.48±0.04(P < 0.05)，降幅达12.7%；D.trenchii的Fv/Fm从0.52±0.03下降至0.51±0.05，差异不显著(P>0.05)。
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| Different letters indicate significant differences among groups (P < 0.05). 图 3 不同温度下虫黄藻Fv/Fm变化 Fig. 3 Changes in Fv/Fm of Symbiodiniaceae at different temperatures |
与GXU01共培养后，两种虫黄藻的Fv/Fm都有了显著提高(P < 0.05)。C.goreaui在25 ℃时，第1天Fv/Fm提高5.03%，第7天提高达5.30%(25C1+对比25C1)；而32 ℃高温胁迫下，第1天提高6.61%，第7天提高至10.79%(32C1+对比32C1)。D.trenchii在25 ℃时，第1天Fv/Fm提高7.57%，第7天仅提高4.95%(25D1+对比25D1)；而32 ℃高温胁迫下，第1天Fv/Fm提高7.69%，第7天提高达9.84%(32D1+对比32D1)。
2.1.4 虫黄藻ROS水平25 ℃时，与GXU01共培养的C.goreaui(25C1+)ROS水平相较于单独培养的对照组(25C1)显著提升36.09%(P < 0.05)；32 ℃高温胁迫时，共培养组依旧保持9.83%的增幅[图 4(a)]，表明共生体会加剧C.goreaui的氧化应激。与之相反，D.trenchii在共培养体系中的ROS水平呈现反向变化趋势，25 ℃共培养组(25D1+)较对照组(25D1)ROS水平显著降低23.12%，32 ℃共培养组则下降12.55%[图 4(b)]，这提示共生关系对D.trenchii具备抗氧化保护效应。高温胁迫显著增强了两种共生藻的ROS积累，无论是单独培养还是共培养，32 ℃高温胁迫下的ROS水平均显著高于25 ℃(P < 0.05)。
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| Different letters indicate significant differences among groups (P < 0.05). 图 4 不同温度下虫黄藻ROS含量变化 Fig. 4 Changes in ROS content of Symbiodiniaceae at different temperatures |
2.2 高温胁迫下GXU01对虫黄藻光照相关基因表达影响
与GXU01共培养对C.goreaui和D.trenchii的psbA基因相对表达量无显著影响。C.goreaui的psbA基因受高温胁迫的影响不大，且共培养组(32C1+)表达量要高于对照组(32C1)，这与常温的情况相反；而D.trenchii的psbA基因受高温胁迫影响后相对表达量显著降低(P＜0.05)，与常温组相比，下降了82.45%-85.01%[图 5: (a)、(b)]。
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| Different letters indicate significant differences among groups (P < 0.05). 图 5 不同温度下虫黄藻psbA和rbcL基因相对表达量变化 Fig. 5 Changes in relative expression levels of psbA and rbcL in Symbiodiniaceae at different temperatures |
C.goreaui和D.trenchii的rbcL基因均表现出共培养组相对表达量显著高于对照组。25 ℃条件下，GXU01添加使C.goreaui的rbcL基因表达量提高43.04%(25C1+相比25C1)，使D.trenchii提高63.18%(25D1+相比25D1)。32 ℃高温胁迫时提升的幅度减小，C.goreaui共培养组rbcL表达量提高25.37%(32C1+相比32C1)，D.trenchii提高51.62%(32D1+相比32D1)[图 5: (c)、(d)]。以上结果表明，添加GXU01有助于提高虫黄藻的光合作用效率。
3 讨论 3.1 虫黄藻生理生化响应规律尽管有研究指出，含有蓝藻群体的珊瑚中虫黄藻的DNA含量较高，可能处于细胞分裂准备阶段[13]，但这并不意味着蓝藻的固氮作用能显著提升虫黄藻密度。本实验中，两种虫黄藻(C.goreaui与D.trenchii)与蓝藻GXU01共培养时，仅在第4天虫黄藻密度略有增加，但差异均不显著(P>0.05)。在7 d的实验周期中，高温胁迫抑制了虫黄藻的生长，但其密度仍缓慢上升；而在25 ℃条件下，虫黄藻密度增长迅速，并在第4天后显著高于高温胁迫组。表明尽管高温会抑制C.goreaui和D.trenchii的生长，但两者对高温都有良好的适应能力。然而，前人研究将D1型虫黄藻归为耐热型虫黄藻，能适应极端高温环境，而C1型虫黄藻则属于热敏感型[32]。例如，以Durusdinium属为主比以Cladocopium属为主的鹿角杯形珊瑚表现出更强的热耐受性[33]。本研究推测，在离体培养条件下，培养基提供了充足营养，高温胁迫尚处于前期至中期阶段，虫黄藻抵御高温胁迫的能力较强。然而，若高温胁迫持续，两类虫黄藻的温度响应差异可能更为显著，值得进一步研究。
高温胁迫会直接破坏虫黄藻的PSⅡ反应中心，而Fv/Fm是量化高温胁迫下虫黄藻PSⅡ功能丧失的首选指标[34]。本研究中C.goreaui和D.trenchii的Fv/Fm在共培养条件下均高于单培养，高温则显著降低了这两种虫黄藻的Fv/Fm。这与本课题组之前的研究结果[17]一致，进一步支持GXU01对虫黄藻代谢具有协调作用的结论，即蓝藻可在一定程度上缓解高温胁迫引起的Fv/Fm下降。值得注意的是，本实验共培养组仅添加0.5%的蓝藻，在总藻密度中占比极低，因此蓝藻自身对光合色素、ROS及光合参数测定的影响可忽略不计。尽管蓝藻添加量极少，但虫黄藻的Fv/Fm仍显著提升，提示GXU01可能通过固氮作用为虫黄藻提供氮源，进而提高其光合效率。已有研究也表明，添加无机氮可增强鳞砗磲(Tridacna squamosa)-虫黄藻共生体的光合作用[35]，而氮限制条件下虫黄藻的Fv/Fm则较低[20]，进一步说明氮供应对虫黄藻光合效率具有关键作用。
在高温胁迫和共培养条件下，C.goreaui和D.trenchii表现出不同的光合色素响应模式。实验结果显示，D.trenchii的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素在共培养条件下，无论是常温还是高温，均有不同程度下降，且在第1天差异显著。而C.goreaui的色素变化较为复杂：常温下，其叶绿素a含量在第1天和第7天时共培养组低于对照组，高温下则相反，第4天表现相反；类胡萝卜素含量变化趋势与叶绿素a大致相同；叶绿素b含量在前4天共培养组显著高于对照组。值得注意的是，两种虫黄藻在高温胁迫下均表现出单细胞光合色素含量的上升，与已有研究结果[36-37]一致。类似地，杨晓红[20]也观察到虫黄藻Fugacium kawagutii叶绿素a含量在高温下上升的趋势，尽管差异不显著。
ROS是一类化学性质活泼、氧化能力强的含氧物质，包括含氧自由基(如超氧自由基·O2-)和含氧非自由基(如单态氧1O2和过氧化物H2O2)[38]。虫黄藻在应激状态下会产生ROS，导致PSⅡ的光损伤[39]。研究表明，不同类型虫黄藻对高温胁迫的ROS响应差异显著：C1型虫黄藻对高温高度敏感，产生最多ROS，而D1型虫黄藻是所研究的7种虫黄藻中唯一不受高温影响的类型[40]。本研究中，C.goreaui和D.trenchii两种虫黄藻单细胞中的ROS含量均因高温胁迫而上升，与相关报道[41]一致。尽管一般认为热敏感型虫黄藻更易积累ROS，本实验中D.trenchii的ROS水平相对更高。推测该差异可能与藻株生长状态有关：C.goreaui在培养中表现出更好的细胞活性与稳定性，而D.trenchii的细胞状态较差，可能处于亚健康或代谢压力下，从而导致其ROS水平偏高。这提示ROS积累不仅与虫黄藻的固有耐热性有关，也可能受细胞培养状态及活力的影响。未来将结合细胞活性与抗氧化指标，进一步探讨这一机制。
GXU 01与这两种虫黄藻共培养也引发了不同的响应：与C.goreaui共培养导致ROS积累，推测该藻可能通过增加色素合成以竞争资源，从而引起氧化应激；而与D.trenchii共培养则减轻了其氧化损伤，推测D.trenchii通过降低色素合成以降低光捕获效率，避免PSⅡ过度激发，从而减少ROS生成[37]。此外，蓝藻可能通过分泌类胡萝卜素协助D.trenchii淬灭多余光能，降低ROS水平，或通过其抗氧化系统(如超氧化物歧化酶和谷胱甘肽)协同增强D1型虫黄藻的ROS清除能力[38]。这表明GXU01对C.goreaui和D.trenchii两种虫黄藻具有不同的共生协调作用。已有研究指出，不同虫黄藻物种在资源竞争或受限时会表现出物种特异性的代谢调节策略[42]，这为我们关于C.goreaui可能通过增强色素合成以竞争资源导致氧化应激，以及D.trenchii采取降低光捕获策略以避免过度激发的解释，提供了生态学层面的支持。
3.2 高温胁迫下GXU01对虫黄藻光照基因表达的影响psbA基因编码PSⅡ反应中心的D1蛋白，是光合作用过程中的关键组分[43]。rbcL基因编码Rubisco酶的大亚基，是卡尔文循环中催化CO2固定的关键酶，其活性直接影响暗反应的碳同化效率，从而调控光反应与暗反应之间的能量平衡[44]。本研究结果显示，高温胁迫下，C.goreaui中psbA基因的表达量虽有波动，但差异不显著；而D.trenchii的psbA基因表达量则显著下降(P < 0.05)。共培养处理并未对两种虫黄藻的psbA基因表达产生显著影响。高温胁迫导致D.trenchii的psbA基因表达下调，与沈城等[26]对稀杯盔形珊瑚(Galaxea astreata)共生虫黄藻的研究结果一致。然而，C.goreaui并未表现出显著下降趋势，与通常的认识“敏感型虫黄藻对高温更为脆弱”存在一定差异。这种差异可能与实验初始状态有关。前期分析表明，在高温胁迫下，两种虫黄藻所承受的氧化应激水平不同：D.trenchii的ROS积累量高于C.goreaui。因此，基因表达模式的差异不仅取决于其耐热性，也可能受到氧化损伤程度的影响。此外，沈城等[26]的研究也发现，胁迫处理5 d时，28 ℃和32 ℃条件下的psbA基因表达量相近，而28 ℃仍处于虫黄藻的适宜温度范围[21]。
对rbcL基因表达的分析发现，高温胁迫未显著影响C.goreaui的基因表达量，而D.trenchii的基因表达量则出现不同程度的下降，其中高温胁迫共培养组的表达量显著低于对照组，其原因可能与上述分析一致。本研究还发现，共培养能够显著提高两种虫黄藻rbcL基因的相对表达量(P < 0.05)，提示蓝藻可能通过提供额外碳源，缓解虫黄藻的碳限制，进而触发Rubisco合成的反馈调控机制。蓝藻进化出的无机CO2浓缩机制(CCM)能够主动转运并积累高浓度HCO3-，随后在羧酶体中经碳酸酐酶转化为CO2，供Rubisco固定[45-46]。当蓝藻细胞内CO2浓度过高时，部分CO2可能扩散至细胞外，形成局部高CO2微环境，有利于虫黄藻吸收利用。此外，蓝藻在光合作用过程中可分泌蔗糖、葡萄糖等小分子糖类[47]，虫黄藻可直接吸收这些有机物作为碳源和能量来源，从而调控激活rbcL的转录。另有研究显示，在亚高温和强光胁迫下，番茄幼苗的rbcL基因表达量下降60%，同时Fv/Fm降低40%[48]，这一结果证实了rbcL基因对PSⅡ的直接影响，从基因表达层面解释了本研究中共培养条件下虫黄藻Fv/Fm显著提升的现象。
4 结论本研究从离体互作的角度，探讨了蓝藻GXU01与两种环境敏感性不同的虫黄藻(C.goreaui和D.trenchii)共培养过程中的代谢协调作用。结果表明，GXU01对不同类型虫黄藻的生理响应具有差异性影响。在不显著影响虫黄藻生长的前提下，GXU01能够调节其光合色素含量与ROS水平，并显著提高两种虫黄藻的Fv/Fm；在分子水平上，GXU01显著上调了虫黄藻rbcL基因的表达，表明其碳同化能力增强；而psbA基因的表达则未受到显著影响。以上结果表明，珊瑚共生蓝藻能够在不同虫黄藻类型中行使差异化的调控机制，协同调节其光合作用与固碳能力。本研究为深入理解珊瑚共生功能体的热适应机制与热白化响应提供了新的研究视角。
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