2. 桂林理工大学环境科学与工程学院, 广西环境污染控制理论与技术重点实验室, 广西桂林 541006
2. Guangxi Key Laboratory of Theory and Technology for Environmental Pollution Control, College of Environmental Science and Engineering, Guilin University of Technology, Guilin, Guangxi, 541006, China
海草床是世界上最有价值的生态系统之一[1]。然而，全球海草生态系统正在经历衰退[2]。贝克喜盐草(Halophila beccarii)便是这一趋势的典型例证，它已被世界自然保护联盟(IUCN)列为易危(VU)种，并被认为是10种具有灭绝风险的海草种类之一[3]。该物种在印度洋-太平洋地区有不连续的分布：在印度洋地区主要分布于马来西亚(西马印度洋沿岸)、孟加拉国和印度；在太平洋地区主要分布于中国、新加坡、马来西亚(砂拉越州)、菲律宾和越南[3-6]。在我国，贝克喜盐草于台湾、福建、广东、香港、澳门、广西及海南均有分布[7-10]。贝克喜盐草对盐度的适应范围较广，从高盐环境(盐度为45)到纯淡水(盐度为0)均可存活，但是与中等盐度(25)相比，其植物形态较小[11]。对于贝克喜盐草的有性繁殖而言，相对较低的盐度更有利于其开花、结果和种子萌发[12-13]。Zakaria等[14]发现位于马来西亚吉兰丹州Pangkalan Nangka潟湖内的一个贝克喜盐草种群，其在退潮时受到稻田排出淡水的影响仍能生长良好。全球贝克喜盐草资源的持续衰退，主要源于不断增加的多重胁迫因素的共同作用：一方面，滨海地区的硬底化开发活动超出了贝克喜盐草的适应能力；另一方面，渔业活动、海水富营养化、海平面上升、海水酸化等由人为活动驱动或加剧的压力，以及真菌感染、风暴潮等自然活动，都可能对贝克喜盐草的生存和发育带来威胁。此外，贝克喜盐草种子的萌发率较低，进一步限制了种群的恢复与扩展。由于上述原因，贝克喜盐草在多个地区面临严峻挑战：在斯里兰卡，被认为是全国性濒危物种[15]；在新加坡，被列为极危(CR)等级红色物种[16]；在菲律宾，被认为已经全国性灭绝[17]。而在我国，目前报道的贝克喜盐草面积不超过200 ha，滨海地区的快速发展给贝克喜盐草的生存和发育造成了极大的压力[13]。
许多关于海草的遗传研究在解析海草床的遗传多样性及种群结构方面获得了重要见解，可为海草保护和管理策略的制定提供关键科学依据。例如，对鳗草(Zostera marina)种群的微卫星分析显示，太平洋种群的等位基因丰富度至少是大西洋种群的两倍，这表明鳗草可能是在相对较近的地质历史时期(很可能是末次冰期结束后)才从太平洋扩散到大西洋[18]。此外，研究发现欧洲鳗草种群在北海/瓦登海地区存在意想不到的遗传多样性高峰[18]，这与经典的“南部多样性高、北部纯度高”的避难所模型[19]不同，表明该地区可能是未曾预料的冰期避难所，或是不同来源种群交汇的结果[18]。对诺氏鳗草(Z.noltii)种群的遗传多样性分析表明，其遗传多样性符合经典的避难所模型，即从南部的毛里塔尼亚和地中海到北部，多样性逐渐减少[20]。而在塔霍河/纳扎雷峡谷地区，诺氏鳗草种群出现了显著的分化，可能是洋流起到了生物地理屏障的作用[21]。大洋波喜荡草(Posidonia oceanica)作为地中海特有种，其遗传结构揭示了地中海东西盆地之间存在强烈的分化，这种分化以西西里-突尼斯海峡为界，每个盆地都有许多私有等位基因，但在边界区域存在一个接触带，表明基因流并未完全中断[22]。蒋凯等[23]对海南岛海菖蒲(Enhalus acoroides)的研究发现，海菖蒲种群克隆多样性和遗传多样性较低，这与所研究种群处于分布区北缘有关；种群间遗传分化值范围较大，这可能是分布于不同港湾的种群间距离范围较大及局域绝灭/再拓殖的遗传漂变效应所致；各种群未发现近期经历种群瓶颈的信号，很可能是由于种群内的遗传多样性已经很低，种群减少未能导致遗传多样性明显降低。上述关于各类海草种群遗传结构的深刻见解，正是得益于微卫星标记的有效应用。微卫星标记又称简单重复序列(Simple Sequence Repeat, SSR)，具有重复性好、特异性强、稳定性高等特点，已成功用于水稻[24]、樱花[25]、杨树[26]、白三叶(Trifolium repens)[27]、番茄(Solanum lycopersicum)[28]等植物的种质资源鉴定。目前，微卫星标记仍然是海草种群遗传研究中常用的工具之一。众多关键海草物种的系统地理学和遗传结构已通过多态性微卫星标记开展研究，如全球广泛分布的鳗草[19]、东大西洋和地中海分布的诺氏鳗草[20-21]和大洋波喜荡草[22, 29]，以及印度-澳大利亚群岛分布的泰来草(Thalassia hemprichii)[30]等。迄今为止，关于贝克喜盐草种群的遗传研究报道仍较少[31-33]。尽管已经通过传统方法为贝克喜盐草开发了一些微卫星标记[34]，但标记数目少、等位基因数(Number of alleles, Na)低、多态性低且均为两碱基重复。因此，有必要开发具有更高多态性的微卫星标记，以满足贝克喜盐草种群遗传研究日益增长的需求。
单分子实时测序(Single-Molecule Real-Time sequencing，SMRT)技术有助于更快速、低成本地开发包括海草在内的众多植物物种的微卫星标记。本研究基于前期贝克喜盐草单分子实时测序的研究结果[35]，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳对其微卫星标记进行筛选与验证；在此基础上，评估贝克喜盐草不同种群的遗传多样性，并结合主坐标分析(Principal Component Analysis，PCoA)探讨种群间遗传变异分化格局，拟为贝克喜盐草群体遗传研究提供多态性更高的微卫星标记，从而优化贝克喜盐草的保护和管理策略。
1 材料与方法 1.1 样品采集及处理通过查阅文献资料[8-9, 36-37]并结合实地踏查了解的北部湾贝克喜盐草分布情况，分别对广西沙井(Shajing, Guangxi, GX-SJ)、海南花场湾(Huachangwan, Hainan, HN-HCW)和洋浦(Yangpu, Hainan, HN-YP)的贝克喜盐草采样，具体采样信息见表 1。3个贝克喜盐草种群的海草床面积均较大，且都位于海湾中。其中，广西沙井属于亚热带季风型海洋性气候，年均降水量为1 300-2 200 mm，降水主要集中在6-8月，年平均气温18-23 ℃。海南花场湾和洋浦属于热带季风型海洋性气候，年均降水量在1 600 mm以上，年平均气温23-26 ℃[38]。鉴于海草克隆生长的特性，间隔5 m以上采样，以避免样本来源于同一株[33]。利用GPS(型号：彩途K20S；定位精度2 m)对采样点进行定位。
| 种群 Population |
纬度 Latitude |
经度 Longitude |
采样数量/株 Number of samples |
采样日期 Sampling date |
| GX-SJ | 21.848 9°N | 108.568 2°E | 8 | 2024-07-23 |
| HN-HCW | 19.919 2°N | 109.977 3°E | 8 | 2024-07-26 |
| HN-YP | 19.730 4°N | 109.272 4°E | 8 | 2024-11-16 |
每个样品应包含连续的根状茎，以确保采集的海草为同一个个体。由于贝克喜盐草植株较小，采集的根状茎长度应大于15 cm以满足DNA提取要求[33]。将采集的贝克喜盐草植株去除根部、腐烂的叶片及附着藻类的叶片，将根状茎和叶片用超纯水冲洗干净后，用纸巾吸干水分，装入10 mL离心管，保存在液氮中。样品带回实验室后放入-80 ℃超低温冰箱中保存[33]。用干冰运输到南京集思慧远生物科技有限公司，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳技术，对海草样品的微卫星标记进行检测分析。
1.2 DNA提取及SSR-PCR扩增基因组DNA采用通用型植物DNA提取试剂盒(D312型，南京集思慧远生物科技有限公司)提取，经1%琼脂糖凝胶电泳(电压：120 V；电泳时间：25 min)检测及估计浓度后，置于-20 ℃冰箱保存。在前期研究中，对贝克喜盐草进行了单分子实时测序，总共鉴定出6 974个包含位点的序列，并成功设计了1 153对引物[35]。本研究从中随机挑选60对引物(55个三碱基重复位点、4个四碱基重复位点和1个五碱基重复位点)进行PCR扩增，引物由南京集思慧远生物科技有限公司合成，采用高亲和纯化(High Affinity Purification，HAP)方式纯化。
SSR-PCR扩增采用10 μL反应体系：5 μL 2×Taq PCR MasterMix(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)、1 μL模板DNA、1 μL正向引物(10 μmol)、1 μL反向引物(10 μmol)、2 μL双蒸水(ddH2O)。PCR扩增反应程序：95 ℃预变性2 min；94 ℃变性40 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min 30 s，26个循环；72 ℃延伸7 min。
利用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行检测，首先设置电压为120 V，电泳30 min；然后设置电压为180 V，电泳75 min。电泳结束后，凝胶经过银染、漂洗等步骤处理后，被置于灯箱上拍照。
1.3 微卫星基因分型和多态性研究采用毛细管电泳对经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选出的、能正常扩增且具有多态性的引物进行微卫星基因分型和多态性分析。使用不同的荧光染料(FAM、HEX、TAMRA和ROX)标记引物。使用来自3个贝克喜盐草种群的24个个体(各8个个体)作为研究材料。PCR扩增体系为15 μL反应体系：1.5 μL 10×缓冲液(Buffer)，1.5 μL MgCl2(25 mmol)，0.3 μL脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP，10 mmol)，1 μL模板DNA，0.15 μL正向引物(10 μmol)，0.15 μL反向引物(10 μmol)，用H2O补至15 μL。PCR扩增在PCR仪(EDC-810黑金刚型，北京东胜创新生物科技有限公司)上进行。PCR扩增程序设置为94 ℃预变性3 min；94 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸3 min。PCR反应结束后，扩增产物进行毛细管电泳检测分型。
1.4 数据分析 1.4.1 克隆鉴别所有的海草植物都能进行克隆繁殖[39]，形成多位点基因型(Multilocus genotype，MLG)相同的分株。本研究采用克隆起源概率(Psex)来判断具有相同基因型的个体是否属于相同的克隆。当Psex＜0.01时，认为相同的MLG为同一个克隆，在种群遗传统计分析时仅使用其中一个MLG进行分析[29]。
1.4.2 连锁不平衡(LD)和哈迪-温伯格(Handy-Weinberg)平衡检验使用TASSEL软件(版本：3.0)Analysis模块下的Link.Diseq.功能计算不同微卫星标记组合间的LD水平及其支持概率，并使用Results模块下的LD Plot功能绘制LD配对检测矩阵图。利用Genepop软件(版本：4.7)进行各群体和总体标记的哈迪-温伯格平衡检验和无效等位基因分析。
1.4.3 遗传多样性分析使用GenAlEx软件(版本：6.51b2)对基因型数据进行分析，计算单个微卫星标记在样本整体的Na、有效等位基因数(NE)、期望杂合度(Expected heterozygosity, HE)、观测杂合度(Observed heterozygosity, HO)。用单因素方差分析(One-way ANOVA)比较3个贝克喜盐草种群的Na、HE和HO是否有显著差异。当P＞0.05时，认为结果无统计学显著性。使用Powermarker软件(版本：3.25)中的Summary Statistics功能计算各位点的多态性信息含量(Polymorphism Information Content, PIC)。当0.25≤PIC＜0.5时，位点属于中度多态性水平；当PIC≥0.5时，位点属于高度多态性水平。基于筛选出的多态性微卫星标记，对广西沙井、海南花场湾和海南洋浦种群的遗传多样性进行评估。
1.4.4 种群遗传分化利用Arlequin软件(版本：3.5)计算种群间遗传分化系数(Fst)和基因流。通常认为，Fst＜0.05表明分化程度可忽略，0.05≤Fst＜0.15为中度分化，0.15≤Fst＜0.25为高度分化，Fst≥0.25则为极高度分化。利用GenAlEx软件(版本：6.51b2)计算遗传距离矩阵，进行主坐标分析。
2 结果与分析 2.1 贝克喜盐草微卫星引物的筛选多态性分析结果显示，在所合成的60对引物中，共有6对引物扩增出明确条带且具有多态性，在总引物中占10.00%的比例(表 2)。6个位点的重复单元均为三核苷酸。后续对这6个位点的PCR产物进行毛细管电泳分型。
| 位点 Locus |
正向引物序列(5′→3′) Forward primer sequence (5′→3′) |
反向引物序列(5′→3′) Reverse primer sequence (5′→3′) |
重复单元 Repeat motif |
退火温度/℃ Annealing temperature/℃ |
长度/bp Size/bp |
| Hb58 | TGTGATGATCTCGAATGGGA | CAACAAAAGCGGGAGGTAGA | (TGC)6 | 60 | 203-270 |
| Hb124 | GACGAGAATGGGGAGAGTTG | ACAAGACATGGAAACGACCC | (CTG)9 | 60 | 237-248 |
| Hb288 | AAATTGGCTGGCTGTAATGG | CTTGCTTGGAACAGTCGAAA | (GAA)21 | 60 | 218-241 |
| Hb646 | TCGATCTCCACCATCAAACA | GCAGCTATGGTGGTTAGGGA | (TCT)13 | 60 | 109-118 |
| Hb850 | GCACGACAGCCATCTTCTCT | CGAGAGGATAGGAGGAGCAA | (CCT)17 | 61 | 181-220 |
| Hb961 | AAAAACCGATTCGCACAAAC | GCGGACTTGTCTACCTGGAG | (GGC)5 | 60 | 138-145 |
本研究共识别出24个MLGs，种群内每个个体均具有不同的基因型，因此所有样本数据均用于后续分析。
哈迪-温伯格平衡检验结果表明，位点Hb58在广西沙井种群为单态；位点Hb124在海南花场湾种群显著偏离哈迪-温伯格平衡；位点Hb850在广西沙井种群显著偏离哈迪-温伯格平衡，而在海南花场湾和洋浦种群均为单态；位点Hb961在海南洋浦种群显著偏离哈迪-温伯格平衡，而在广西沙井种群为单态。
筛选出的6个位点的Na共41个，范围为3-14，HE为0.477-0.857，HO为0.292-0.917，PIC为0.405-0.843(表 3)。Hb58、Hb961和Hb850为中度多态性位点，Hb646、Hb124和Hb288为高度多态性位点。
| 位点 Locus |
样本数 Number of samples |
等位基因数 Na |
有效等位基因数 Effective number of alleles |
期望杂合度 HE |
观测杂合度 HO |
多态信息含量 PIC |
| Hb58 | 24 | 3 | 2.083 | 0.520 | 0.292 | 0.405 |
| Hb124 | 24 | 14 | 5.731 | 0.826 | 0.417 | 0.805 |
| Hb288 | 24 | 14 | 6.982 | 0.857 | 0.917 | 0.843 |
| Hb646 | 24 | 4 | 2.961 | 0.662 | 0.708 | 0.601 |
| Hb850 | 24 | 3 | 2.000 | 0.500 | 0.333 | 0.449 |
| Hb961 | 24 | 3 | 1.910 | 0.477 | 0.292 | 0.427 |
2.2 3个贝克喜盐草种群的遗传多样性分析
用筛选出的6个多态性三核苷酸位点对广西沙井、海南花场湾和洋浦种群的24个个体进行评估发现(表 4)，广西沙井、海南花场湾和洋浦种群的Na无显著差异(P＞0.05)，分别为1-11(平均值=4.2)、1-6(平均值=2.8)和1-6(平均值=3.5)。广西沙井种群的HE、HO分别为0.000-0.875(平均值=0.440)、0.000-1.000(平均值=0.542)。海南花场湾种群的HE、HO分别为0.000-0.758(平均值=0.358)、0.000-1.000(平均值=0.417)。海南洋浦种群的HE、HO分别为0.000-0.688(平均值=0.515)、0.000-0.875(平均值=0.521)。3个贝克喜盐草种群的HE和HO无显著差异(P＞0.05)。
| 位点 Locus |
广西沙井 GX-SJ |
海南花场湾 HN-HCW |
海南洋浦 HN-YP |
|||||||||||
| 等位基因数 Na |
期望杂合度 HE |
观测杂合度 HO |
多态信息含量 PIC |
等位基因数 Na |
期望杂合度 HE |
观测杂合度 HO |
多态信息含量 PIC |
等位基因数 Na |
期望杂合度 HE |
观测杂合度 HO |
多态信息含量 PIC |
|||
| Hb58 | 1 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 2 | 0.219 | 0.250 | 0.195 | 3 | 0.508 | 0.625 | 0.428 | ||
| Hb124 | 7 | 0.648 | 0.625 | 0.625 | 2 | 0.219 | 0.000 | 0.195 | 6 | 0.688 | 0.625 | 0.654 | ||
| Hb288 | 11 | 0.875 | 0.875 | 0.864 | 6 | 0.758 | 1.000 | 0.720 | 4 | 0.672 | 0.875 | 0.612 | ||
| Hb646 | 3 | 0.617 | 0.750 | 0.544 | 4 | 0.578 | 0.750 | 0.510 | 4 | 0.555 | 0.625 | 0.510 | ||
| Hb850 | 2 | 0.500 | 1.000 | 0.375 | 1 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 1 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | ||
| Hb961 | 1 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 2 | 0.375 | 0.500 | 0.305 | 3 | 0.664 | 0.375 | 0.590 | ||
3个贝克喜盐草种群的遗传分化系数范围为0.131-0.353。海南花场湾和洋浦种群之间的遗传分化系数最小，为0.131，表明分化程度中等；这2个种群间的基因流最大，为1.66。海南花场湾和广西沙井种群之间的遗传分化系数最大，为0.353，表明分化程度极高；这2个种群间的基因流最小，为0.46。广西沙井种群与2个海南种群间的遗传分化系数均大于0.25，表明广西与海南种群间存在极高的遗传分化，反映出贝克喜盐草存在显著的遗传结构。主坐标分析表明广西和海南种群之间存在显著的遗传差异(图 1)。以上结果表明，本研究筛选出的微卫星标记对于检测贝克喜盐草种群的遗传多样性和种群结构非常有效。
|
| 图 1 贝克喜盐草24个个体的主坐标分析 Fig. 1 PCoA of 24 individuals of H. beccarii |
3 讨论
设计出足够数量的微卫星标记是种质资源保护和群体遗传结构分析的基础。前人报道的贝克喜盐草微卫星标记是通过传统克隆测序法开发的，需要经过构建基因组文库、杂交筛选或随机测序、鉴定含微卫星的克隆、设计引物、实验验证这一系列步骤来获得[34]。这种方法的局限性很大，且耗时(需大量克隆筛选和测序)、成功率低(仅5%-20%的克隆含有可用微卫星)。已有的研究仅开发出6个贝克喜盐草微卫星标记，其等位基因数均较低(2-4)，且均为两碱基重复[34]，无法满足贝克喜盐草遗传多样性研究的要求。而单分子实时测序(如PacBio或Oxford Nanopore技术)可获得长读长数据，能直接识别复杂微卫星区域，并据此设计出跨重复单元的引物。本研究基于前期对贝克喜盐草的单分子实时测序研究结果，从中随机挑选60对引物，利用24个贝克喜盐草样本DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。多态性分析结果显示，共有6个位点(占总引物的10.00%)扩增成功且具有多态性(表 3)。从遗传多样性来看，微卫星标记中的杂合度能较好地反映群体中等位基因的丰富程度和均匀程度[40]，本研究获得的6对贝克喜盐草微卫星引物的观测杂合度为0.292-0.917，平均值为0.493，处于较高水平。从片段多态性来看，微卫星标记等位基因数和多态信息含量能从一定程度上反映遗传标记包含或提供的遗传信息含量[40]，本研究获得的6对贝克喜盐草微卫星引物中，等位基因数为3-14，高于Jiang等[34]利用基因组文库构建SSR富集文库后进行杂交测序获得的贝克喜盐草微卫星等位基因数(2-4)，这种差异可能是微卫星标记开发方法不同所致。同时，这6对引物的多态信息含量为0.405-0.843，表明本研究开发的微卫星标记具有较高的多态性，将其用于贝克喜盐草种群遗传多样性研究的可靠性较高。
本研究表明单分子实时测序技术能相对高效地获得目标物种的序列遗传信息，有利于筛选特异性强、多态性高的引物，是一种较为理想可行的技术。本研究对基于单分子实时测序开发的贝克喜盐草微卫星标记进行筛选与验证，可为后续贝克喜盐草种群遗传多样性评估、种质资源保护及管理、遗传连锁图谱构建等工作提供数据基础。
本研究表明广西与海南种群间存在很大的遗传分化，说明贝克喜盐草存在显著的遗传结构。海南花场湾和洋浦种群空间距离较近，因此聚为一类。可以从广西沙井适当迁入一些贝克喜盐草个体到海南花场湾和洋浦，通过两个主要分布区域间的联动来降低贝克喜盐草种群局域绝灭风险。
4 结论本研究为贝克喜盐草提供了丰富的微卫星标记资源，新开发的位点可为贝克喜盐草海草床的管理及保护提供科学依据, 并有望提升对贝克喜盐草种群遗传多样性、种群结构、连接性以及克隆结构的评估精度。
| [1] |
COSTANZA R, D'ARGE R, DE GROOT R, et al. The value of the world's ecosystem services and natural capital[J]. Nature, 1997, 387(6630): 253-260. DOI:10.1038/387253a0 |
| [2] |
ORTH R J, CARRUTHERS T J B, DENNISON W C, et al. A global crisis for seagrass ecosystems[J]. BioScience, 2006, 56(12): 987-996. DOI:10.1641/0006-3568(2006)56[987:AGCFSE]2.0.CO;2 |
| [3] |
SHORT F T, COLES R, WAYCOTT M, et al. The IUCN red list of threatened species: Halophila beccarii[Z/OL]. [2025-02-19]. http://dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2010-3.RLTS.T173342A6995080.en.
|
| [4] |
中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志: 第八卷[M]. 北京: 科学出版社, 1992.
|
| [5] |
KANAL A H M, SHORT F. A new record of seagrass Halophila beccarii Ascherson in Bangladesh[J]. Chiang Mai University Journal of Natural Sciences, 2009, 8(2): 201-206. |
| [6] |
JAGTAP T G. Distribution of seagrasses along the Indian coast[J]. Aquatic Botany, 1991, 40(4): 379-386. DOI:10.1016/0304-3770(91)90082-G |
| [7] |
郑凤英, 邱广龙, 范航清, 等. 中国海草的多样性、分布及保护[J]. 生物多样性, 2013, 21(5): 517-526. |
| [8] |
邱广龙, 苏治南, 钟才荣, 等. 濒危海草贝克喜盐草在海南东寨港的分布及其群落基本特征[J]. 广西植物, 2016, 36(7): 882-889. |
| [9] |
邱广龙, 范航清, 李宗善, 等. 濒危海草贝克喜盐草的种群动态及土壤种子库: 以广西珍珠湾为例[J]. 生态学报, 2013, 33(19): 6163-6172. |
| [10] |
邢福武. 澳门植物志: 第三卷[M]. 澳门: 澳门特别行政区民政总署幽林绿化部. 广州: 中国科学院华南植物园, 2007.
|
| [11] |
FAKHRULDDIN I M, SIDIK B J, HARAH Z M. Halophila beccarii Aschers (Hydrocharitaceae) responses to different salinity gradient[J]. Journal of Fisheries and Aquatic Science, 2013, 8(3): 462-471. DOI:10.3923/jfas.2013.462.471 |
| [12] |
JAGTAP T G, UNTAWALE A G. Ecology of seagrass bed of Halophila beccarii (Aschers) in Mandovi Estuary, Goa[J]. Indian Journal of Marine Sciences, 1981, 10(4): 402-404. |
| [13] |
邱广龙, 苏治南, 范航清, 等. 贝克喜盐草的生物学和生态学特征及其保护对策[J]. 海洋环境科学, 2020, 39(1): 121-126. |
| [14] |
ZAKARIA M H, BUJANG J S, ARSHAD A B. Flowering, fruiting and seedling of annual Halophila beccarii Aschers in Peninsular Malaysia[J]. Bulletin of Marine Science, 2002, 71(3): 1199-1205. |
| [15] |
UDAGEDARA S, FERNANDO D, PERERA N, et al. A first record of Halodule pinifolia Miki den Hartog, and new locality of nationally endangered Halophila beccarii Asch, from the eastern coast of Sri Lanka[J]. International Journal of Aquatic Biology, 2017, 5(5): 328-335. |
| [16] |
DAVISON G W H, NG P K L, HO H C. The Singapore Red Data Book: threatened plants and animals of Singapore[M]. 2nd ed. Singapore: Nature Society, 2008.
|
| [17] |
LIAO L M, GERALDINO P J L. Has Halophila beccarii Ascherson (Alismatales, Hydrocharitaceae) been locally extirpated in the Philippines?[J]. Tropical Natural History, 2020, 20(1): 104-110. DOI:10.58837/tnh.20.1.206130 |
| [18] |
OLSEN J L, STAM W T, COYER J A, et al. North Atlantic phylogeography and large-scale population differentiation of the seagrass Zostera marina L.[J]. Molecular Ecology, 2004, 13(7): 1923-1941. DOI:10.1111/j.1365-294X.2004.02205.x |
| [19] |
HEWITT G M. Genetic consequences of climatic oscillations in the Quaternary[J]. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 2004, 359: 183-195. DOI:10.1098/rstb.2003.1388 |
| [20] |
COYER J A, DIEKMANN O E, SERRÃO E A, et al. Population genetics of dwarf eelgrass Zostera noltii throughout its biogeographic range[J]. Marine Ecology Progress Series, 2004, 281: 51-62. DOI:10.3354/meps281051 |
| [21] |
DIEKMANN O E, COYER J A, FERREIRA J, et al. Population genetics of Zostera noltii along the west Iberian coast: consequences of small population size, habitat discontinuity and near-shore currents[J]. Marine Ecology Progress Series, 2005, 290: 89-96. DOI:10.3354/meps290089 |
| [22] |
ARNAUD-HAOND S, MIGLIACCIO M, DIAZ-ALMELA E, et al. Vicariance patterns in the Mediterranean Sea: east-west cleavage and low dispersal in the endemic seagrass Posidonia oceanica[J]. Journal of Biogeography, 2007, 34(6): 963-976. DOI:10.1111/j.1365-2699.2006.01671.x |
| [23] |
蒋凯, 高辉, 陈小勇. 海南岛海菖蒲种群克隆多样性和遗传结构[J]. 应用生态学报, 2018, 29(2): 397-402. |
| [24] |
HARISHA R, BHADRU D, VANISRI S, et al. SSR and morphological traits based fingerprints and DNA barcodes for varietal identification in rice[J]. Biotechnology & Biotechnological Equipment, 2021, 35(1): 1461-1473. |
| [25] |
孙泽硕, 蒋冬月, 柳新红, 等. 基于SSR标记的42份樱花品种的聚类分析及DNA指纹图谱构建[J]. 园艺学报, 2023, 50(3): 657-668. |
| [26] |
SUN P, JIA H X, YUE Z Q, et al. Genetic identification of 91 poplar cultivars based on SSR markers[J]. Nordic Journal of Botany, 2020, 38(6): 02504. |
| [27] |
MA S N, HAN C Y, ZHOU J, et al. Fingerprint identification of white clover cultivars based on SSR molecular markers[J]. Molecular Biology Reports, 2020, 47(11): 8513-8521. DOI:10.1007/s11033-020-05893-7 |
| [28] |
CASTELLANA S, RANZINO L, BERITOGNOLO I, et al. Genetic characterization and molecular fingerprint of traditional Umbrian tomato (Solanum lycopersicum L.) landraces through SSR markers and application for varietal identification[J]. Genetic Resources and Crop Evolution, 2020, 67(7): 1807-1820. DOI:10.1007/s10722-020-00942-3 |
| [29] |
SERRA I A, INNOCENTI A M, DI MAIDA G, et al. Genetic structure in the Mediterranean seagrass Posidonia oceanica: disentangling past vicariance events from contemporary patterns of gene flow[J]. Molecular Ecology, 2010, 19(3): 557-568. DOI:10.1111/j.1365-294X.2009.04462.x |
| [30] |
HERNAWAN U E, VAN DIJK K J, KENDRICK G A, et al. Historical processes and contemporary ocean currents drive genetic structure in the seagrass Thalassia hemprichii in the Indo-Australian Archipelago[J]. Molecular Ecology, 2017, 26(4): 1008-1021. DOI:10.1111/mec.13966 |
| [31] |
JIANG K, XU N N, TSANG P K E, et al. Genetic variation in populations of the threatened seagrass Halophila beccarii (Hydrocharitaceae)[J]. Biochemical Systematics and Ecology, 2014, 53: 29-35. DOI:10.1016/j.bse.2013.12.004 |
| [32] |
PHAN T T H, DE RAEYMAEKER M, LUONG Q D, et al. Clonal and genetic diversity of the threatened seagrass Halophila beccarii in a tropical lagoon: resilience through short distance dispersal[J]. Aquatic Botany, 2017, 142: 96-104. DOI:10.1016/j.aquabot.2017.07.006 |
| [33] |
阮迎港. 基于RADseq的易危海草贝克喜盐草种群遗传结构与历史动态[D]. 上海: 华东师范大学, 2022.
|
| [34] |
JIANG K, SHI Y S, ZHANG J, et al. Microsatellite primers for vulnerable seagrass Halophila beccarii (Hydrocharitaceae)[J]. American Journal of Botany, 2011, 98(6): e155-e157. |
| [35] |
CHEN S T, QIU G L. Single-molecule real-time sequencing of the full-length transcriptome of Halophila beccarii[J]. Scientific Reports, 2022, 12: 16444. DOI:10.1038/s41598-022-20988-w |
| [36] |
陈石泉, 吴钟解, 王道儒, 等. 海南岛海草床群落种间关系研究[J]. 海洋通报, 2013, 32(1): 78-84. |
| [37] |
郭晋宇, 耿晓晓, 尹雷, 等. 海南儋州湾贝克喜盐草资源分布特征及影响因素分析[J]. 海洋湖沼通报, 2023, 45(2): 123-132. |
| [38] |
GENG X X, CAI Z F, JIA S W, et al. Environmental determinants of the distribution of Halophila beccarii ascherson in Hainan Island, China[J]. Sustainability, 2022, 14(20): 13491. DOI:10.3390/su142013491 |
| [39] |
苗苑, 徐娜娜, 于硕, 等. 海草克隆性及其种群遗传效应[J]. 生态学报, 2009, 29(7): 3846-3853. |
| [40] |
国伟, 沈佐锐. 微卫星DNA的多态性及其应用[J]. 生物技术通讯, 2004, 15(2): 158-159. |