2. 桂林理工大学旅游与风景园林学院, 广西桂林 541006;
3. 桂林理工大学, 广西环境污染控制理论与技术重点实验室, 广西桂林 541006;
4. 陕西开放大学旅游与酒店管理学院, 陕西西安 710119;
5. 桂林理工大学, 漓江保护与发展研究院, 广西桂林 541006
2. College of Tourism & Landscape Architecture, Guilin University of Technology, Guilin, Guangxi, 541006, China;
3. Guangxi Key Laboratory of Theory and Technology for Environmental Pollution Control, Guilin University of Technology, Guilin, Guangxi, 541006, China;
4. College of Tourism and Hotel Management, Shaanxi Open University, Xi'an, Shaanxi, 710119, China;
5. Institute of Protection and Development of the Lijiang River, Guilin University of Technology, Guilin, Guangxi, 541006, China
随着全球旅游业的蓬勃发展，旅游活动带来的生态压力日益显著，游客踩踏、旅游设施运营中产生的废弃物和废水成为生态扰动源[1-3]，这不仅会改变土壤生态结构和功能[4-6]，还可能引发水生生态的连锁反应[7-8]。研究表明，旅游活动对水生生态系统的影响具有空间差异性和隐性累积性特征，Barros等[9]利用地理信息系统将游客活动情况与环境特征数据相结合，量化旅游活动的生态效应，发现高海拔地区旅游活动对水生生态具有潜在影响；Pan等[10]的研究表明，旅游活动对水生生态的影响具有隐性特征，常规水质监测难以捕捉其细微变化，且一旦超过阈值，后果难以逆转。因此，寻求新的研究视角和工具探究旅游水生态响应机制成为亟待解决的科学问题。近年来，研究者从不同空间尺度对旅游水生生态效应展开了研究。在中观尺度上，Cao等[11]通过对湖泊底栖动物群落与旅游指数进行相关性分析，建立了生态系统健康评价的生物指标；Balduino等[12]通过比较发现旅游区鱼类多样性显著高于非旅游区，证实了旅游活动对水生群落的塑造作用；Pan等[10]以底栖硅藻组合的变异性作为预警工具，监测九寨沟国家级自然保护区湖泊的营养富集情况，对湖泊进行了多生境评估；杨海菊等[13]构建的漓江底栖动物多样性指数，为流域生态健康评估提供了有效工具。在微观尺度上，由于河流中微生物群落能够迅速响应水生生态变化，并对水体细微异质性表现出高度敏感性，其重要的生态指示意义引发了学者的关注。现有研究多采用16S rDNA技术分析封闭水体(如洞穴水系)的微生物群落组成，评估旅游活动的影响[14-16]，但是该技术主要用于分析物种组成，对群落功能解释不足。宏基因组学是一种对样本中所有核酸进行测序和分析的技术，无需培养即可进行微生物检测，在展示微生物群落物种和功能组成方面具有其他技术无法比拟的优势[17]，因而在环境胁迫、污染物处理、农业生产、食品加工、医学等领域得到广泛应用，为环境微生物群落功能的探究提供了新的研究视角。Al-awthan等[18]成功应用宏基因组测序技术对沙特塔布克水体沉积物的功能进行分析；Xiao等[19]通过宏基因组测序技术研究了白洋淀沉积物中的病原体群落结构；Jokanovic等[20]对亚得里亚海南部黑山海岸沉积物中的细菌群落进行宏基因组测序，发现细菌群落受营养物质浓度、理化性质和沉积物粒度组成的影响较为明显。尽管旅游生态效应研究日益增多，但是在旅游背景下运用宏基因组技术对开放水体微生物群落结构响应的研究明显不足。
漓江不仅是桂林山水的灵魂，而且具有重要的生态、文化和经济价值。随着桂林旅游业的快速发展，其与漓江水生生态的交互作用逐渐加强，独特的喀斯特地貌决定了漓江具有较高的生态脆弱性，其生态系统更易受到旅游扰动的影响，漓江的水生生态问题亟须引起广泛关注。因此，本研究选取漓江风景名胜区作为研究区域，采集对旅游活动具有显著累积作用的水体和沉积物样本，通过宏基因组测序技术对微生物群落进行深入分析，揭示旅游活动对水生生态的扰动机理，旨在为桂林旅游资源的合理利用提供理论依据，为景区水生生态系统的管理提供数据支持，为漓江保护与发展提供科学建议。
1 材料与方法 1.1 研究区域概况研究区域位于广西漓江流域中下游(24°46′-25°07′N，110°18′-110°30′E)，自桂林市区两江四湖环城水系漓江干流最北端至阳朔观莲码头，包括4个旅游基础设施和游客最集中的代表性区域：桂林市区(涵盖环城水系——两江四湖•象山景区)、阳朔县城(涵盖阳朔西街)、兴坪古镇、遇龙河旅游度假区(图 1)。
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| 图 1 研究区域概况及采样点位置 Fig. 1 Location of the sampling sites in the study area |
1.2 采样点分布
鉴于潜流带沉积物具有较高的环境稳定性，其微生物群落丰富度、均匀度和综合多样性指数均高于水体，因此能更准确地反映旅游活动产生的长期累积生态效应，故本研究采集潜流带的沉积物样品。根据漓江风景名胜区相关景区和游客分布特征，结合当地水文和地理条件，本研究于2024年9月在研究区域设置9个采样点(图 1)，开展表层水和沉积物样品采集。采样点按照受旅游扰动大小划分为上游组(U_24D)和下游组(D_24D)，上游组采样点为桂林上(GL_U)、兴坪上(XP_U)、阳朔上(YS_U)、夏棠码头(YL_XT，夏棠码头与富里桥码头受旅游扰动相当，故分析时将夏棠码头选入上游组)，受旅游扰动较小；下游组采样点为桂林下(GL_D)、兴坪下(XP_D)、阳朔下(YS_D)、工农桥码头(YL_GN)，受旅游扰动较大。由于研究区域为开放式河流，微生物群落受多因素的影响，故设置采样点时充分考虑了以下因素：首先，在研究区域上、下游各200 m内设置采样点，以减少沿河两岸工农业生产的干扰；其次，选取相同沉积物基质(泥、沙、石比例)的点位作为采样点，以减少因基质差异产生的干扰；最后，采样在当天完成，以减少气候变化的干扰。
1.3 样品采集 1.3.1 水样采集使用便携式水质分析仪(YHBJ-262、DDB- 305A、JPB-607A，上海仪电科学仪器股份有限公司)现场测定表层水pH值、溶解氧(DO)、电导率(EC)、水温(T)、浊度(Turb)、总溶解性固体(TDS)。每个采样点采集3份1 L样品，在容器中充分混合后取1 L水样，将其冷藏，当日运回实验室进行后续分析。
1.3.2 沉积物采集在相同采样点采集沉积物样本，每个采样点设置3个重复，共27个样本，去除较大石块后装入50 mL无菌离心管中，用液氮速冻，于-80 ℃冰箱保存，用于环境DNA提取和宏基因组测序。其余样本装入无菌自封袋，当日运回实验室，风干后测定理化参数。
1.3.3 旅游数据采集景区酒店数量(N_H)通过去哪儿网(https://www.qunar.com/)划定范围进行统计，统计数据截至2024年10月15日。游客人数(N_T)数据源自广西桂林市文化广电和旅游局的《2024年前三季度桂林旅游市场数据通报》[21]。由于各区域均为开放式景区，具体游客人数并无官方统计数据，为填补这一数据缺口，本研究结合游客总数，采用专家咨询法和访谈法(包括与当地居民和景区管理人员的访谈)对各景区游客数据进行估算。
1.4 样品测定水质分析共测定5个指标：总氮(W_TN)、总磷(W_TP)、硝态氮(W_NO3_N)、铵态氮(W_NH4_N)、可溶性总磷酸盐(W_TDP)。其中，总氮采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法(HJ 636—2012)测定；总磷采用钼酸铵分光光度法(GB 11893-89)测定；硝态氮采用紫外分光光度法(HJ/T 346-2007)测定；铵态氮采用纳氏试剂分光光度法(HJ 535-2009)测定；可溶性总磷酸盐采用钼酸铵分光光度法(GB 11893-89)测定。
沉积物分析共测定13个指标：pH值(S_pH)、电导率(S_EC)、总碳(S_TC)、总无机碳(S_TIC)、总有机碳(S_TOC)、总氮(S_TN)、总磷(S_TP)、铅(S_Pb)、铬(S_Cr)、锰(S_Mn)、锌(S_Zn)、铜(S_Cu)、铁(S_Fe)。其中，pH值和电导率采用电极法测定；总碳、总无机碳、总有机碳采用TOC总有机碳/总氮分析仪(multi N/C 3100，德国耶拿分析仪器股份公司)测定；总氮采用凯氏定氮法(LY/T 1228-2015)测定；总磷采用钼锑抗分光光度法(GB/T 9837-1988)测定。重金属含量的测定方法如下：沉积物风干后过100目筛，每个样本取0.4 g，滴入10 mL浓盐酸，120 ℃消解4 h后蒸干，按10∶10∶3的比例加入硝酸、氢氟酸、高氯酸，赶酸至3 mL，用去离子水定容至10 mL，用针式滤器(0.45 μm)过滤后，用电感耦合等离子发射光谱仪(Optima7000DV，美国Perkin Elmer公司)测定。
1.5 DNA提取和宏基因组测序分析 1.5.1 DNA提取利用E.Z.N.A®.Soil DNA Kit (美国Omega公司)从土壤样品中抽提DNA。利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。通过Covaris M220将DNA片段化，筛选350 bp的片段，用于构建PE文库。使用NEXTFLEX® Rapid DNA-Seq(美国BiooScientific公司)构建测序文库。使用Illumina NovaSeqTM X Plus (美国Illumina公司)测序平台进行宏基因组测序。
1.5.2 宏基因组测序使用Fastp[22]对reads 3′端和5′端的adapter序列进行剪切，筛选高质量的序列；通过BWA[23]将reads与宿主DNA序列进行比对，并去除比对相似性高的污染reads。使用MEGAHIT[24]对优化序列进行拼接组装，筛选≥300 bp的contigs作为最终的组装结果。使用Prodigal[25]对组装结果中的contigs进行开放阅读框(Open Reading Frame，ORFs)预测，选择核酸长度≥100 bp的基因，将其翻译为氨基酸序列。使用CD-HIT[26]对所有样品预测出的基因序列进行聚类(参数为相似度90%、覆盖度90%)，每类取最长的基因作为代表序列，构建非冗余基因集。使用SOAP[27]分别将每个样品的高质量reads与非冗余基因集进行比对(相似度95%)，统计基因在对应样品中的丰度信息。使用DIAMOND[28]将非冗余(Non-Redundant，NR)基因集的氨基酸序列与NR数据库、京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)数据库进行比对，基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)比对参数设置期望值e-value为1e-5，获得基因对应的物种(功能)及其丰度。样本DNA抽提和高通量测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。
1.6 统计分析采用Bray-Curtis距离算法对样本进行非度量多维尺度(Nonmetric Multidimensional Scaling，NMDS)分析并进行可视化；利用LEfSe软件选择从门到属的分类水平进行线性判别分析(Linear Discriminant Analysis，LDA)，筛选样本组间显著性差异物种；基于宏基因组功能(Metagenomic Functions，MGFs)丰度构建随机森林模型(Random Forest，RF)，根据KEGG数据库level 2层级注释结果，预测上、下游组间特征功能。其他数据分析和可视化主要使用R v3.3.1完成，包括基于门水平和属水平的群落柱形图绘制；使用RF包进行随机森林分析，识别重要的功能类别，即生物标志物(Biomarker)；使用plot ROC包进行受试者工作特征曲线(ROC)分析及联合ROC分析，通过绘制ROC曲线计算曲线下面积(Area Under the Curve，AUC)，量化基于LEfSe软件和RF分析筛选出的生物标志物的准确性；使用vegan v2.4.3包进行方差膨胀因子(Variance Inflation Factor，VIF)分析，筛选出多重共线性较小的环境因子，并进行冗余分析(Redundancy Analysis，RDA)和方差分解分析(Variance Partitioning Analysis，VPA)；通过pheatmap包绘制热图，直观展示环境因子与所选物种之间的相关性系数。所有数据分析均采用RPKM(Reads Per Kilobase per Million mapped reads)丰度计算方法，即将每个基因的读数计数除以基因长度(以千碱基为单位)和每百万映射读数总数，标准化基因表达水平以进行跨基因和跨样本的比较。数据处理和分析在美吉生物云平台完成。
2 结果与分析 2.1 水质与沉积物理化指标特征经检测，各采样点水质指标均达到《地表水环境质量标准》(GB 3838—2002)中的Ⅰ类和Ⅱ类标准；沉积物重金属含量远低于《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准(试行)》(GB 15618-2018)中的污染风险筛选值，且低于李杰等[29]的研究结果。下游组水体铵态氮、溶解氧和pH值以及沉积物锌、铜、总磷的检测值略高于上游组，但均未达到显著水平(表 1)。
| 组别Group | 硝态氮/(mg/L)W_NO3_N/(mg/L) | 铵态氮/(mg/L)W_NH4_N/(mg/L) | 浊度Turb | 溶解氧/(mg/L)DO/(mg/L) | pH值pH value | 总无机碳/(mg/kg)S_TIC/(mg/kg) | 总氮/(g/kg)S_TN/(g/kg) | 总磷/(g/100 g)S_TP/(g/100 g) | 铅/(mg/kg)S_Pb/(mg/kg) | 铬/(mg/kg)S_Cr/(mg/kg) | 锰/(mg/kg)S_Mn/(mg/kg) | 锌/(mg/kg)S_Zn/(mg/kg) | 铜/(mg/kg)S_Cu/(mg/kg) |
| U_24D | 0.95±0.38a | 0.05±0.01a | 7.71±4.92a | 7.49±0.93a | 8.06±0.12a | 3.27±2.13a | 0.93±0.18a | 0.04±0.003a | 35.12±0.39a | 75.00±0.87a | 424.31±4.27a | 97.63±1.19a | 18.97±0.16a |
| D_24D | 0.83±0.28a | 0.06±0.03a | 7.19±3.00b | 8.58±1.35a | 8.15±0.24a | 2.62±1.02a | 0.85±0.09b | 0.05±0.01a | 4.84±0.77a | 8.76±1.17a | 415.14±1.92a | 111.14±1.93a | 19.62±0.18a |
| Note: different lowercase letters indicate significant differences between groups (P < 0.05). | |||||||||||||
2.2 微生物物种组成
门水平上的群落相对丰度结果[图 2(a)]显示，共确定20个优势微生物类群，依据相对丰度大小排序，排名前5的分别为假单胞菌门(Pseudomonadota)、拟杆菌门(Bacteroidota)、放线菌门(Actinomycetota)、硝化螺旋菌门(Nitrospirota)、绿弯菌门(Chloroflexota)，其平均相对丰度分别为4.07%、7.38%、6.92%、5.74%、4.58%。下游组硝化螺旋菌门、绿弯菌门、酸杆菌门(Acidobacteriota)、黏细菌门(Myxococcota)、候选罗库菌门(Candidatus_Rokubacteria)、硝化球菌门(Nitrososphaerota)的相对丰度大于上游组。
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| 图 2 景区上、下游组微生物群落门水平和属水平组成 Fig. 2 Composition of microbial communities at phylum level and genus level between upstream and downstream groups of the scenic areas |
属水平上的群落相对丰度结果[图 2(b)]显示，共确定20个优势微生物类群，相对丰度大小排名前5的分别为硝化螺旋菌属(Nitrospira)、红活菌属(Rubrivivax)、类固醇杆菌属(Steroidobacter)、厌氧绳菌属(Anaerolinea)、芳烃球菌属(Aromatoleum)，其平均相对丰度分别为4.61%、3.37%、1.71%、1.66%、1.67%。下游组硝化螺旋菌属、红活菌属的相对丰度大于上游组。
2.3 微生物物种β多样性NMDS分析结果(图 3)表明，景区上、下游组间微生物门水平和属水平上物种结构存在统计学差异(P < 0.05)，以运行所得Stress值检验NMDS分析结果的优劣，显示图形有一定的解释意义(门水平上Stress=0.108，属水平上Stress=0.128)。通过相似性分析(Analysis of Similarities, ANOSIM)进一步证实了景区上、下游组的微生物群落结构差异显著(门水平上R=0.124，P < 0.05；属水平上R=0.098，P < 0.05)，说明旅游活动对微生物物种结构有显著影响。
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| 图 3 景区上、下游组微生物群落门水平和属水平结构差异 Fig. 3 Differences in microbial community composition at phylum level and genus level between upstream and downstream groups of the scenic areas |
2.4 组间差异分析及生物靶标识别 2.4.1 物种差异分析
为预测能够显著区分上、下游组的宏基因组物种(Metagenomic Species，MGSs)，基于NR注释结果，从门到属进行分类，利用LEfSe软件对上、下游组的样本进行线性判别分析(LDA>2)，共识别出8 818个差异性物种，涵盖古菌、细菌、真菌和病毒四大类群(图 4)。
古菌方面，硝化球菌门、甲烷脱硫菌属(Methanodesulfokores)，以及具有较强耐盐性和耐高温性的苏伊古菌门(Sysuiplasma)、盐二型菌属(Halobiforma)和甲烷盐菌属(Methanohalobium)在下游组中显著富集，提示上、下游组间氮、硫、有机质及盐度存在差异[图 4(a)]。
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| 图 4 微生物群落的线性判别分析分支图与直方图 Fig. 4 Linear discriminant analysis branch chart and histogram of microbial communities |
细菌方面，能够将亚硝酸盐氧化为硝酸盐的硝化螺旋菌门各物种，善于分解复杂有机质的绿弯菌门和黏菌目(Myxococcales)，以及在氮和硫循环中起关键作用[30]的候选罗库菌门均在下游组中明显富集，提示上、下游组间氮、硫、有机质存在差异[图 4(b)]。
真菌方面，能在沉积物中利用有机物生长, 并在有机质累积区域较为常见的枝藻属(Cladocopium)、跃藻属(Halteria)、炭角菌目(Xylariales)、地舌菌纲(Geoglossomycetes)、黏地舌菌属(Glutinoglossum)，以及炭疽菌属(Colletotrichum)、胶孢炭疽菌科(Glomerellaceae)在下游组显著富集，提示上、下游组间有机质存在差异[图 4(c)]。
病毒方面，楚病毒科(Chuviridae)、克诺沙病毒属(Kenoshavirus)、圆环病毒科(Cressdnaviricota)、鱼楚病毒属(Piscichuvirus)、帕克普纳病毒属(Pakpunavirus)等物种在下游组显著富集[图 4(d)]。
2.4.2 标志性物种和功能识别为探寻可作为生物标志物的物种，并验证所选生物标志物对环境预测的准确性，将上述差异物种按类别分别进行联合ROC分析(LDA>3，P < 0.05)，古菌、细菌、真菌、病毒的AUC值分别为0.63、0.81、0.72、0.99(表 2)，古菌AUC值准确性较低，予以剔除。将其余3类微生物(共计51类)的基因集合并，再次进行联合ROC分析，AUC值为0.81(图 5、表 2)，说明本次标志性物种的识别具有一定准确性，所筛选物种能够有效区分旅游扰动下的微生物群落差异，可作为生物标志物(物种)。
| 目的Objective | 验证方法Verification method | 生物靶标Biological target | AUC值AUC value |
| Identification of marker species | Combined ROC analysis | Archaea | 0.63 |
| Bacteria | 0.81 | ||
| Fungi | 0.72 | ||
| Viruses | 0.99 | ||
| Combination of bacteria, fungi, and viruses | 0.81 | ||
| Identification of marker functions | ROC analysis | Functions | 0.80 |
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| 图 5 随机森林分析标志性功能重要性排序图和ROC分析结果图 Fig. 5 Importance ranking of biomarkers based on random forest analysis and ROC analysis results |
ROC分析共获得48个标志性功能，图 5(a)展示的是运用RF预测得到的MGFs相对重要性排序情况，经十折交叉验证，筛选出癌症综述(Cancer: overview)、信号转导(Signal transduction)、其他次级代谢产物的生物合成(Biosynthesis of other secondary metabolites)、辅因子与维生素代谢(Metabolism of cofactors and vitamins)、染色体(Chromosome)、膜转运(Membrane transport)、外源性生物降解与代谢(Xenobiotics biodegradation and metabolism)、氨基酸代谢(Amino acid metabolism)等前8个功能作为样本分类生物标志物(功能)。将其通过ROC分析验证模型的准确性，结果显示AUC值为0.80 [图 5(c)、表 2]，说明筛选的标志性功能对组间差异诊断有一定准确性，能够有效区分旅游扰动下微生物群落功能差异，可作为生物标志物(功能)。
2.5 景区上、下游组间差异的环境主控因子RDA结果显示，第一轴序(RDA1)和第二轴序(RDA2)分别解释了微生物群落总变异的48.25%和37.53%，两轴对沉积物微生物群落变异的总解释度为85.78%[图 6(a)]。环境因子中沉积物锌的解释度为57.50%(P=0.002)，是影响景区微生物群落分布最显著的环境因子。沉积物总氮、总无机碳、铬以及游客数量的解释度依次为47.80%(P=0.004)、38.66%(P=0.007)、26.96%(P=0.044)和23.88%(P=0.046)，是影响微生物群落分布的次要环境因子。
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| In fig. 6(b), red indicates a positive correlation, blue indicates a negative correlation, * indicates 0.01 < P≤0.05, ** indicates 0.001 < P≤0.01, *** indicates P≤0.001. 图 6 景区上、下游组间差异物种环境主控因子分析 Fig. 6 Main environmental factors contributing to species differences between upstream and downstream groups of the scenic area |
基于Spearman秩相关系数探究微生物门水平物种与环境因子的相关性，热图分析结果[图 6(b)]显示，酒店数量、游客数量与绿弯菌门、黏球菌门、酸杆菌门、放线菌门呈显著正相关，表明这些微生物在旅游活动频繁的地区丰度增加。沉积物总磷、锰、总氮、铅以及溶解氧、浊度与酸杆菌门呈显著正相关，表明这些环境因子对酸杆菌门富集具有促进作用。
为进一步明确旅游活动对微生物群落影响的贡献度，将环境因子中的游客数量和酒店数量划分为“Tourism”组，将其他因子划分为“Physicochemical”组，对样本进行VPA，结果显示旅游因子的单独解释度为4.52%，与理化因子的共同解释度为34.44%[图 6(c)]。
3 讨论 3.1 景区上、下组间微生物物种差异分析基于LEfSe组间差异分析的结果表明，景区下游组水体中存在共同富集物种，这些微生物群落结构特征与上游组相比呈现出显著的共性差异，具有重要的生态指示意义。由于采样点的设置充分考虑到旅游活动的影响，因此水体微环境的改变与旅游活动的开展密切相关，氮源输入、水体底泥物理扰动、塑料圈形成以及盐度、重金属浓度差异等驱动的环境变化可能是导致上、下游微生物群落差异的关键驱动因素。
3.1.1 氮源有机物输入旅游活动引发的氮源输入是影响漓江水体沉积物微生物群落变化的重要因素。景区下游组富集的微生物群落主要参与氮循环和有机物分解过程：氮氧化细菌通过氨氧化作用将铵盐转化为亚硝酸盐或硝酸盐，同时释放能量；有机物中较高浓度的蛋白质和氨类物质，为硝化球菌门中的古菌、氮氧化细菌以及枝藻属、炭疽菌属等微生物提供了丰富的氮源；此外，绿弯菌门和黏菌目细菌也因参与有机物的降解和氮、硫的代谢而富集。同时，帕克普纳病毒属、克诺沙病毒属等在景区下游也呈现富集状态。这些标志性物种的富集结果表明，相较于上游组，景区下游组水体环境中的含氮化合物积累更为显著[31]。虽然景区配备了符合标准的污水处理设施，可确保排放水质达标，但长期旅游活动产生的污染源(如餐饮废水、住宿排放物、游客丢弃的食物残渣及包装物)仍会持续输入水体，导致有机负荷升高，这些污染物最终富集于沉积物中，其累积效应更为显著，此观点与Andolina等[7]和Pan等[10]的研究结果一致。
3.1.2 水体底泥物理扰动物理扰动不仅加剧了沉积物的释放，还可能通过影响微生物的环境适应性进而导致群落结构的异质性。除了有机物质的直接输入，物理扰动也是影响沉积物微环境的重要因素。旅游活动中的游船航行、沙滩娱乐等人类行为会频繁扰动水体沉积物，引发其物理化学性质改变，这种扰动不仅促使沉积物中的有机质和矿物质重新释放，还会显著改变水体-沉积物界面的溶解氧及营养盐分布格局，最终形成特殊的微环境，进而对沉积物微生物群落的结构与功能产生深远影响[32-33]。
3.1.3 塑料圈形成景区内居民日常生活污水排放和游客活动产生的废水及塑料废弃物(如食品包装袋)是微塑料的重要来源，通过改变水体沉积物的性质和组成，从而间接影响微生物群落结构。例如，景区居民和旅游住宿设施排放的生活污水中含有大量的微塑料，包括化纤衣物在洗涤过程中脱落的纺织纤维[34-35]、化妆品中的微塑料颗粒[36]以及塑料包装经外力作用下产生的次生微塑料碎片等。这些原生和次生微塑料虽然90%以上可以通过污水处理设施清除[37]，但残留在污泥中的微塑料通过农业回用、空气迁移等途径重新进入水环境，最终在水体沉积物中形成塑料圈。塑料圈的形成不仅可为微生物提供特殊的定植环境[38]，还能影响生物地球化学循环，改变微生物群落演替过程和代谢活动[37, 39-40]。
3.1.4 环境变化由生存环境异质性所引发的自然选择可能是某些微生物在景区下游富集的重要因素。盐二型菌属和甲烷盐菌属等耐盐性古菌在高盐或波动盐度环境中具备生存优势，表明其富集现象可能与水体盐度的变化有关。旅游活动中，游客的水上活动、住宿餐饮废水排放、垃圾的丢弃都能对水体盐度的分布产生影响，进而改变微生物的分布和富集模式。此外，特定微生物类群与微环境中重金属(如锌、铬)的空间分布特征存在显著关联。其中，硝化螺旋菌门的部分菌株展现出对重金属的耐受特性；而绿弯菌门和黏菌目则通过生物吸附和富集机制参与重金属的迁移转化过程[41-42]。微环境中的盐含量与重金属浓度对微生物群落的影响并非独立存在，而是存在协同作用机制。具体而言，氯化钠可通过调节细胞内重金属的代谢过程以及改变细胞表面吸附特性，从而改变微生物对锰、铅、锌、铬等重金属的耐受性[43]。
3.2 景区上、下游组间微生物功能差异分析本研究基于KEGG数据库level 2层级注释结果进行随机森林分析，不仅系统揭示了不同样本组间的代谢功能差异特征，而且反映了旅游活动对微生态的潜在机制。结果显示，景区下游组在外源性生物降解与代谢、膜转运、信号转导、染色体、氨基酸代谢等功能上显著富集，可能与旅游活动中有机物输入以及微生物对这些物质的代谢响应有关。
外源性生物降解与代谢功能的富集表明，旅游活动可能通过改变生存环境进而调控微生物代谢网络的潜在机制。有机物和营养盐的沉积为微生物提供了丰富的碳源和氮源，从而激发了微生物多种代谢功能。例如，微生物在分解餐饮废水和食品残渣时，可能触发与氮循环相关代谢策略的变化，其中氨基酸代谢功能的富集显著支持了这一观点[44-45]。
膜转运功能的富集也进一步提示了旅游活动对微生物群落功能的影响。景区中游船波浪扰动和游客活动使水体中营养物质浓度增加，加之外源性物质输入，使水环境更复杂，微生物需要通过膜运输系统高效摄取外部营养物，调节其细胞内的营养状态以适应环境变化[46]。这种适应性反应不仅提高了微生物的生存能力，还体现了以微生物为主导的微生态系统对外部扰动的响应机制。
信号转导和染色体相关功能的变化表明微生态变化可能对微生物群落的生物过程和基因表达产生影响。信号转导功能变化体现了微生物群落对环境变化的响应，包括应激反应、代谢调节以及细胞间的通讯机制。染色体功能变化则表明微生物的遗传特性伴随旅游活动的扰动而演变。另外，本研究测序结果还提示癌症综述功能也出现富集现象，反映了微生物群落中存在与癌症相关的代谢通路、信号转导机制和特定的微生物物种，可能与癌症的发生、发展或微环境的变化有关，其相关机制需要在后续研究中进一步关注。
旅游活动的持续开展对水循环产生了复杂影响，尽管氮、磷营养物质含量等传统水质指标未出现显著波动，但微生物群落的物种组成、代谢模式和功能表现却呈现出明显的区域差异性，能敏感地指示环境变化，表明微生物靶标的识别是研究旅游微生态的有力工具。
3.3 关键环境因子识别和旅游贡献量化RDA结果表明，沉积物总氮、总无机碳、铬以及游客数量是影响微生物群落分布的主要环境因子，这与前人的研究结果[47-49]一致。需要指出的是，RDA所采用的环境因子经过严格筛选，在排除高度自相关因子的基础上，确保了指标体系的代表性。因此，上述主要环境因子不是单一指标，而是一类指标，涵盖了沉积物中的营养盐、有机物和重金属等因素，这些因素对微生物的代谢和群落结构具有显著影响[50-51]。沉积物中的锌和铬具有较高的解释度，表明它们在微生态系统中起着重要作用。锌和铬既是微生物代谢所必需的元素，又具有一定的毒性，通过对物种的选择进而影响微生物群落的组成。重金属含量的差异既可能源自环境本底值的空间异质性，也可能与旅游设施建设和运营过程中释放的化学物质(如建筑废料、化妆品、洗涤剂等)有关。
本研究统计分析显示，游客数量作为关键影响因子，对微生物群落结构具有显著影响(解释度23.88%，P=0.046)，这进一步证实了人类活动对微生物群落的扰动作用。值得注意的是，虽然旅游活动相关因子(如游客数量)的直接解释度较弱(单独解释度4.52%)，但是VPA显示通过与理化因子的协同作用，可共同解释34.44%的群落变异，表明旅游活动主要通过改变环境理化性质来间接影响微生物群落。另外，热图显示的酒店数量、游客数量与多个物种的相关关系也进一步验证了这一观点。
4 结论本研究采用宏基因组测序技术，以漓江风景名胜区为研究对象，按照相关景区上、下游进行分组采样，系统分析表层水体和沉积物的理化性质及其微生物群落组成特征，得出以下结论。
(1) 物种方面，在景区下游区域，与氮循环、硫循环及有机物降解相关的微生物群落(包括古菌、细菌、真菌)以及部分病毒种群呈现显著富集特征。功能方面，氨基酸代谢、外源性生物降解及信号转导等8个生物标志物(功能)在下游区域富集，反映了该区域氮源和有机负荷增加，改变了微生物物种结构和群落代谢功能。
(2) ROC分析结果表明，所识别的硝化球菌门、硝化螺旋菌门、枝藻属等51类微生物标志性物种以及信号转导、膜转运、氨基酸代谢等8个生物标志物(功能)具备较高的预测准确性，能有效区分因旅游扰动导致的微生物群落物种和功能差异，可作为旅游扰动的生物标志物(物种)。
(3) 沉积物锌、总氮、总无机碳、铬以及游客数量是影响微生物群落分布的主要环境因子。旅游活动通过改变水体和沉积物的理化性质，间接影响微生物群落的组成和功能多样性。
本研究揭示了漓江水体微生态对旅游扰动的响应机制，表明基于宏基因组技术的微生态分析在旅游水生生态研究中的潜力与应用价值。未来应加强对不同扰动强度下水生生态响应的研究，重点关注营养物质输入对水生生态系统的影响，加强旅游基础设施与水生生态的交互关系，同时还探究宏基因组学技术在非喀斯特地区生态研究中的适用性，为旅游可持续发展提供科学依据。
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