2. 中国科学院武汉病毒研究所, 湖北武汉 430207
2. Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan, Hubei, 430207, China
鹿衔草(Pyrola calliantha H.Andres)为鹿蹄草科(Pyrolaceae)鹿蹄草属(Pyrola)植物鹿蹄草的干燥全草，广泛分布于我国江西、安徽以及湖南等地[1]。药理学研究表明，鹿衔草具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗肿瘤、神经保护、扩张血管以及促进成骨细胞增殖等作用[2-3]。但对其抗病毒活性研究较少，仅有Yang等[4]报道鹿衔草的乙酸乙酯提取物能显著抑制流感病毒神经氨酸酶活性，从而发挥抗流感病毒作用。鹿衔草中的成分众多，黄酮类主要包括山柰酚、槲皮素、槲皮苷等，萜类主要包括熊果酸、白桦脂醇、铁冬青酸等，醌类主要包括鹿蹄草素、邻甲基苯醌等，还包括鞣质和多糖类化合物等[1, 5-6]。综合近年来国内外有关天然产物抗病毒的研究发现，黄酮、萜类等天然产物有较好的抗病毒潜力[7]，故可以挖掘鹿衔草中单体化合物的潜在抗病毒活性。
裂谷热病毒(Rift Valley Fever Virus，RVFV)属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)白蛉病毒属(Phlebovirus)，是一种负链RNA病毒，具有高致病性和传播性，其与埃博拉病毒、寨卡病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒等一起被列入世界卫生组织(WHO)的蓝点名单(Bluepoint list)，是全球重点研发病原体之一[8-9]。由RVFV引起的裂谷热(Rift Valley Fever，RVF)是一种人畜共患的传染病。感染RVFV使成年反刍动物的死亡率达20%，而患病幼崽的死亡率近100%。人类在感染RVFV后会出现发热、头痛、背痛、头晕等症状，严重时会导致脑炎、出血热甚至死亡[10]。抗病毒药物利巴韦林曾被用来治疗RVF，但由于其可能导致溶血性贫血和炎症等副作用，已被临床限制使用，目前针对RVF尚无疫苗和特异有效的治疗药物[11]。关于抗RVFV的研究主要集中在抗体方面。Hao等[12]利用恒河猴免疫表达RVFV糖蛋白Gn和Gc的重组人腺病毒4型，分离得到两种Gn的单克隆抗体，并证明了这两种抗体可能阻止RVFV糖蛋白重排，从而阻碍Gc中的融合环暴露于内体膜。Wang等[13]从RVF康复患者体内分离得到了Gn和Gc的单克隆抗体，其中Gn单克隆抗体可以干扰可溶性Gn与细胞的结合，并阻断病毒与宿主细胞的附着。Allen等[14]和恽佳蕾等[15]利用家兔或小鼠免疫RVFV糖蛋白Gn，分离得到Gn的单克隆抗体或多克隆抗体。另有研究表明，一些小分子化合物也有抗RVFV活性。Alkan等[16]通过计算机对小分子化合物库进行靶向RVFV糖蛋白Gc的筛选，得到了3种抗RVFV的小分子化合物，其中RGc-F06能够抑制病毒的进入。Geerling等[17]证明了金属配位抑制剂AG-Ⅱ-18-P和AG-Ⅰ-183-P可以抑制RVFV的复制。Islam等[18]对1-N-[2-(联苯-4-基氧基)乙基]丙烷-1, 3-二胺进行修饰，发现化合物 13a可能在RVFV进入后或复制阶段起作用，并可能影响K+通道。天然产物结构独特、来源广泛，在抗病毒药物研究方面有着独特的优势，然而在天然产物抗RVFV方面，仅有Narayanan等[19]的研究提到姜黄素能够抑制RVFV在人细胞中的复制。
作为高致病性病毒，在进行RVFV活病毒相关实验时存在安全隐患，需要在生物安全三级实验室中操作，对实验设施要求较高[20]。由S节段编码的非结构NSs蛋白能够抑制宿主的先天免疫应答，并被证明是病毒的主要毒力因子[21]。本研究将NSs蛋白基因替换为增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)基因，构建表达EGFP的裂谷热病毒模型(RVFV-EGFP)。由该模型模拟的活病毒感染过程不会自主传播，可在生物安全二级实验室中操作。基于本课题组前期研究中从鹿衔草分离得到的单体化合物，本研究利用该模型筛选具有抗RVFV性能的有效成分，并评价其安全性、抗病毒作用和抑制机制，旨在为天然产物抗RVFV药物的研发提供参考。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 单体化合物、细胞与质粒本研究中单体化合物均由本课题组前期提取分离得到[3, 22-23]。人肝癌细胞(Huh7)、人胚肾细胞(293T)、金黄仓鼠肾细胞(BSR-T7)、仓鼠肾成纤维细胞(BHK-21)和质粒(pUC19-L、pUC19-S-EGFP、pCAGGS-M、pCAGGS-RdRp、pCAGGS-NP)均由中国科学院武汉病毒研究所龚睿研究员学科组提供。
1.1.2 主要试剂及仪器二甲基亚砜(DMSO)，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、磷酸盐缓冲液(PBS，pH值为7.4)、0.25% 胰蛋白酶、LipofectamineTM 3000转染试剂，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；PEI转染试剂，美国Polyscience公司；冰乙酸，国药集团化学试剂有限公司。
台式低速离心机，湖南可成仪器设备有限公司；二氧化碳培养箱，德国Memmert公司；多功能酶标仪，瑞士Tecan公司；DM IL LED倒置显微镜，德国Leica公司；Operetta CLSTM高内涵成像分析系统，美国PerkinElmer公司。
1.2 方法 1.2.1 Huh7细胞培养将冻存于-80 ℃的Huh7细胞于37 ℃快速融化，750 r/min离心5 min，弃除上清液后用含10% 胎牛血清的DMEM培养基重新悬浮，并在5%二氧化碳培养箱37 ℃培养，待其长至单层时使用0.25% 胰蛋白酶消化传代备用。
1.2.2 RVFV-EGFP病毒模型建立及荧光检测根据文献[24]，使用LipofectamineTM 3000转染试剂分别将pUC19-L∶pUC19-S-EGFP∶pCAGGS-M∶pCAGGS-RdRp∶pCAGGS-NP以20∶9∶16∶20∶10的比例共转染至BSR-T7细胞，将pCAGGS-M转染至Huh7细胞，在BSR-T7细胞可见少量绿色荧光时，将BSR-T7和Huh7细胞混匀后接种至6孔板，培养4 d后，收集上清液，记为P1代上清液。将pCAGGS-M转染至BHK-21细胞，12 h后，去除上清液，并加入P1代上清液感染BHK-21细胞，继续培养4-5 d后再次转染pCAGGS-M，培养72 h后收集上清病毒液，放至-80 ℃保存备用。将待测病毒原液使用含2% FBS的DMEM培养基进行101倍梯度稀释，稀释倍数为101-106倍，每个浓度设置3个复孔。每孔加入100 μL病毒稀释液，用于感染宿主细胞，24 h后，使用高内涵成像分析系统对EGFP进行计数，得到细胞的EGFP阳性率。
1.2.3 鹿衔草中单体化合物的抗RVFV活性筛选将单体化合物与稀释101倍的病毒稀释液混合，使单体化合物铁冬青酸、水晶兰苷、原儿茶酸、槲皮素、积雪草酸、金丝桃苷和具栖冬青苷的最终浓度梯度为12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L，白桦脂醇、胡萝卜苷、齐墩果酸、β-谷甾醇、蒲公英萜醇和熊果酸的最终浓度梯度为1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 μmol/L，并设置模型组(不添加药物)和空白组(不添加病毒和药物)，每个浓度设置3个复孔。每孔加入100 μL混合液以感染Huh7细胞，24 h后，使用高内涵成像分析系统进行EGFP计数，得到细胞的EGFP阳性率，并绘制抑制率(Inhibition ratio)曲线，确定具有抗RVFV性能的活性化合物。抑制率(%)计算公式如下：
| $ \text { 抑制率 }=\left[1-\frac{T-B}{M-B}\right] \times 100 \% \text {, } $ |
其中，T为实验组的EGFP阳性率，B为空白组的EGFP阳性率，M为模型组的EGFP阳性率。
1.2.4 活性化合物细胞半数中毒浓度、半数抑制浓度和选择指数的测定将活性化合物溶液的浓度稀释至6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00、400.00、800.00 μmol/L，并设置模型组(不添加药物)和空白组(不接种细胞)。在每个孔里添加100 μL活性化合物稀释液作用于宿主细胞，培养24 h后使用CCK-8试剂盒进行检测，绘制细胞活力的剂量依赖曲线，并计算细胞半数中毒浓度(Median cytotoxic concentration，CC50)。细胞活力(%)计算公式如下：
| $ \text { 细胞活力 }=\left(\frac{A_{\text {实验 }}-A_{\text {空白 }}}{A_{\text {模型 }}-A_{\text {空白 }}}\right) \times 100 \%, $ |
其中，A实验为实验组细胞的吸光度值，A空白为空白组细胞的吸光度值，A模型为模型组细胞的吸光度值。
按照1.2.3节的实验方法，检测活性化合物浓度在6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00、400.00、800.00 μmol/L时的抗病毒活性，绘制抑制率曲线，并计算半数抑制浓度(Median inhibitory concentration，IC50)和选择指数(Selection Index，SI)。SI是综合判断药物毒性和有效性的指标，SI越大，安全范围越大，SI＞2表示低毒高效[25]，其计算公式如下：
| $ \mathrm{SI}=\frac{\mathrm{CC}_{50}}{\mathrm{IC}_{50}} 。$ |
将Huh7细胞以3.0×104个/孔的密度接种到96孔板，培养过夜使细胞完全贴壁。使用稀释101倍的病毒稀释液感染细胞。分别在病毒感染细胞前2 h，感染后0、2、4、6、8 h加入槲皮素。病毒感染24 h后，使用高内涵成像分析系统进行EGFP计数，得到细胞的EGFP阳性率。
1.2.6 不同阶段给药实验(1) 药物预处理病毒实验：将高浓度的病毒原液与槲皮素在37 ℃预孵育3 h，分别稀释101倍后作用于Huh7细胞；同时设置对照组(槲皮素和病毒分别在37 ℃预孵育3 h，各自稀释5倍后混合)、模型组(不添加药物)和空白组(不添加病毒和药物)，24 h后使用高内涵成像分析系统进行EGFP计数，得到细胞的EGFP阳性率。
(2) 药物预处理细胞实验：Huh7细胞与槲皮素在37 ℃预孵育2 h后移除上清液，用PBS冲洗3遍去除残存药物。加入101倍稀释的病毒稀释液在4 ℃感染细胞1 h后，PBS冲洗3遍去除残存病毒。加入含2% FBS的DMEM，24 h后使用高内涵成像分析系统进行EGFP计数，得到细胞的EGFP阳性率。
(3) 吸附期给药实验：将Huh7细胞在4 ℃预冷1 h后，同时加入101倍稀释的病毒稀释液和槲皮素混合液，4 ℃孵育1 h，使用预冷PBS冲洗3遍，去除残存病毒和药物。加入含2% FBS的DMEM，24 h后使用高内涵成像分析系统进行EGFP计数，得到细胞的EGFP阳性率。
(4) 感染后给药实验：将Huh7细胞在4 ℃预冷1 h，加入使用101倍稀释的病毒稀释液，感染细胞1 h后，使用预冷PBS冲洗3遍去除残存病毒，并加入含2% FBS的DMEM，分别在感染后0、2、4、6、8 h后加入槲皮素，感染24 h后使用高内涵成像分析系统进行EGFP计数，得到细胞的EGFP阳性率。
1.2.7 细胞-细胞膜融合实验待24孔板培养293T细胞至汇合度为70%-80%，将pCAGGS-M、EGFP分别以每孔0.5 μg和0.25 μg进行混合，使用PEI转染试剂进行转染。24 h后，分别加入200、400、800 μmol/L的槲皮素于37 ℃孵育1 h，使用经PBS稀释的冰乙酸(pH值为5)进行诱导融合10 min，同时设置模型组(不添加药物)和空白组(不添加药物并使用pH值为7的PBS诱导)，弃去PBS，添加含2% FBS的DMEM继续培养2 h，荧光倒置显微镜观察细胞融合情况。
1.2.8 分子对接实验在TCMSP数据库(https://tcmsp-e.com/tcmsp.php)中下载槲皮素的mol2格式文件，导入Chem3D 18.0软件中得到其3D结构，并进行能量最小化处理，再导入AutoDockTools 1.5.7软件中，进行加氢、计算电荷和检测扭转中心及扭转键。在PDB数据库(https://www.rcsb.org/)中获取RVFV糖蛋白Gn、Gc的3D结构，PDB ID分别为5Y0Y和6EGT，在PyMOL 2.4.0软件上去除水分子和重复的结构，再导入AutoDockTools 1.5.7软件中，进行加氢处理。将槲皮素和RVFV糖蛋白Gn、Gc在AutoDock软件中进行对接，对接能量越低，表明结合越稳定，对接结果越好。并在PyMOL 2.4.0软件中进行可视化分析。
1.2.9 数据统计分析使用GraphPad Prism 9.5.0软件对化合物的抗RVFV活性、细胞毒性及处理前后相对病毒产量等实验数据进行处理和对比，采用单因素方差(One-way ANOVA)方法进行差异显著性分析。实验结果以平均值±标准差表示，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果与分析 2.1 RVFV-EGFP病毒模型荧光检测将稀释倍数为101-106的RVFV病毒稀释液接种至细胞后，培养24 h，使用高内涵成像分析系统进行荧光检测及计数。结果表明，病毒原液稀释101倍时，EGFP阳性细胞密度较好，因此选择此稀释倍数进行后续实验(图 1)。
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| 图 1 经不同浓度RVFV感染后的EGFP阳性细胞数(a)及绿色荧光(b) Fig. 1 Number of EGFP-positive cells (a) and green fluorescence demonstration (b) after infection with different concentrations of RVFV dilutions |
2.2 鹿衔草中单体化合物的抗RVFV活性筛选
对鹿衔草中13个单体化合物进行抗RVFV活性初步筛选。结果显示，被病毒感染的细胞数量随积雪草酸、铁冬青酸和槲皮素浓度增加而降低，表明这些化合物对病毒具有抑制作用，其余化合物则无明显抗RVFV活性(图 2)。
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| 图 2 鹿衔草中单体化合物对RVFV的抑制率 Fig. 2 Inhibition ratios of monomer compounds from Pyrola calliantha H.Andres against RVFV |
2.3 活性化合物的IC50、CC50、SI测定
通过SI评估化合物的有效性及安全性。积雪草酸、铁冬青酸和槲皮素IC50分别为50.34、179.0、122.2 μmol/L，CC50分别为76.31、140.1、571.3 μmol/L，计算得到SI分别为1.52、0.78和4.68(图 3)。槲皮素SI为4.68，表明其低毒高效，且在其浓度为200 μmol/L时细胞活力无明显变化，因此后续选择槲皮素进行抗RVFV活性研究。
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| 图 3 积雪草酸(a)铁冬青酸(b)和槲皮素(c)对RVFV的抑制率和宿主细胞活性 Fig. 3 Inhibition ratios of asiatic acid (a), rutundic acid (b), and quercetin (c) on RVFV and host cell viability |
2.4 全时长抑制实验
为了探究槲皮素对RVFV复制周期的影响，分别在感染前2 h和感染后0、2、4、6、8 h给药。结果显示，随着槲皮素添加时间的延后，Huh7细胞的EGFP阳性率逐渐升高，提示病毒的相对含量逐渐升高，而槲皮素对RVFV的抑制作用逐渐减小。其中，在感染前2 h和感染0 h时给药，其抑制率分别为29.35%和41.60%，表明在此阶段给药能显著抑制病毒对Huh7细胞的感染(P＜0.000 1)，提示槲皮素主要作用于RVFV感染宿主细胞的早期阶段(图 4)。
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| Compared with the blank group, #### means P < 0.000 1. Compared with the model group, *** means P < 0.001, **** means P < 0.000 1. 图 4 在不同时间点添加槲皮素细胞的EGFP阳性率(a)及绿色荧光(b) Fig. 4 EGFP-positive rates (a) and green fluorescence fields (b) in the groups with quercetin added at different time points |
2.5 不同阶段给药实验
为了探究槲皮素作用于病毒感染的具体阶段，分别在预处理病毒、预处理细胞、吸附期、感染后阶段给药，检测EGFP的阳性率，结果如图 5所示。在预处理病毒阶段，与模型组相比，给药组中宿主细胞EGFP阳性率显著降低，为48.8%(P＜0.000 1)。在预处理细胞阶段，给药组宿主细胞的EGFP阳性率无显著变化，说明槲皮素没有阻止RVFV感染细胞。在吸附期和感染后阶段给药，槲皮素均显示出对RVFV有抑制作用，其中吸附期阶段给药组的抑制率达38.8%(P＜0.01)，在感染后0 h给药的抑制效果最好，抑制率达83.6%(P＜0.000 1)。RVFV在细胞内的复制周期可以分为吸附、膜融合、脱壳、复制、组装、释放阶段[26]。结果表明，槲皮素直接作用于病毒而非宿主细胞上的受体，其主要作用于病毒感染宿主细胞的早期，即吸附和膜融合阶段(图 6)。
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| Compared with the blank group, **** means P < 0.000 1, ** means P < 0.01, ns means P > 0.05. 图 5 槲皮素在不同阶段给药对RVFV的抑制作用 Fig. 5 Inhibitory effects of quercetin against RVFV at different stages |
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| 图 6 槲皮素在不同阶段给药对RVFV抑制作用的绿色荧光 Fig. 6 Green fluorescence field demonstration of the inhibitory effects of quercetin against RVFV at different stages |
2.6 细胞-细胞膜融合实验
通过Gc介导的细胞-细胞融合实验来探究槲皮素能否抑制病毒与宿主细胞的膜融合。与空白组相比，模型组中出现较大范围的膜融合现象。与模型组相比，槲皮素在浓度为400、800 μmol/L时能够有效抑制融合泡的形成。结果表明槲皮素可以抑制RVFV与宿主细胞的膜融合(图 7)。
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| 图 7 槲皮素抑制Gc介导的细胞-细胞膜融合 Fig. 7 Quercetin inhibits Gc-mediated cell-cell membrane fusion |
2.7 分子对接
将槲皮素和RVFV糖蛋白Gn、Gc分别进行分子对接，得到对接的3D模式图。槲皮素与Gn、Gc结合能分别为-8.5、-5.2 kcal/mol，均小于-5 kcal/mol，表现出良好的亲和力。槲皮素与Gn的5个氨基酸残基(GLY-10、THR-30、ASP-217、CYS-221、PHE-244)，以及Gc的3个氨基酸残基(CYS-691、LYS-748、ASN-1077)之间存在氢键相互作用。
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| Green zone is domain Ⅰ; purple zone is domain Ⅱ; pink zone is domain Ⅲ. 图 8 槲皮素与RVFV糖蛋白Gn (a)、Gc (b)之间的相互作用 Fig. 8 Interactions between quercetin and RVFV proteins Gn (a) and Gc (b) |
3 讨论
槲皮素作为一种天然产物，具有广谱的抗病毒活性，对单纯疱疹病毒、埃博拉病毒、登革病毒、严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型、丙型肝炎病毒、阿尼昂-尼昂病毒、诺如病毒、肠炎病毒、狂犬病病毒等都有较好的抑制作用[27]，但目前暂无有关槲皮素对布尼亚病毒科病毒抑制的研究。布尼亚病毒科病毒的吸附与多种宿主细胞表面分子相关，包括DC-SIGN、L-SIGN、HSPG和LRP 1等[8]，且病毒的膜融合受pH值影响，pH值较低的环境能够诱导糖蛋白Gc驱动病毒和囊泡膜的融合[28]。此外，阻断K+通道也能够抑制RVFV对宿主细胞的融合和进入[18]。
本研究对槲皮素抗RVFV的活性进行了评价和机制研究，发现槲皮素作用于RVFV感染细胞的早期阶段，并与RVFV糖蛋白Gn和Gc的关键氨基酸残基进行相互作用。RVFV糖蛋白Gn和Gc在RVFV的复制周期中发挥关键作用，其与细胞表面因子的结合促进了病毒附着和摄取到细胞中，并在低pH值下介导病毒和囊泡膜的融合[28]。分子对接显示槲皮素和RVFV糖蛋白Gn、Gc存在较强的结合能，并且通过氢键作用与多个Gn、Gc的氨基酸残基相互结合。其中，与槲皮素结合的Gn氨基酸残基GLY-10、THR-30位于Gn的结构域Ⅰ，而ASP-217、CYS-221、PHE-244位于Gn的结构域Ⅲ[29]。有研究表明，结构域Ⅰ中存在阻断病毒吸附细胞的结合位点，而结构域Ⅲ是Gn免疫的优势部位[12-13]。因此，推测槲皮素通过与Gn的氨基酸残基相互作用，来阻断病毒对细胞的吸附。与槲皮素结合的Gc氨基酸残基CYS-691、LYS-748、ASN-1077均位于Gc的结构域Ⅰ[30]。ASN-1077可糖基化形成Gc N-聚糖，而形成的N-聚糖可以通过DC-SIGN使病毒感染细胞[31]。因此，推测槲皮素可通过与Gc的氨基酸残基ASN-1077相互作用，来抑制病毒对细胞的感染。综上所述，槲皮素通过与RVFV糖蛋白Gn、Gc的关键残基相互作用，抑制了RVFV对细胞的吸附和膜融合，但有关槲皮素与Gn、Gc的相互作用还需进一步实验验证。
4 结论本研究基于RVFV-EGFP模型，对鹿衔草中具有抑制RVFV活性的单体化合物进行筛选，发现槲皮素能作用于病毒感染宿主细胞的早期阶段，即吸附和膜融合阶段，该作用与RVFV糖蛋白Gn和Gc密切相关，表明槲皮素是具有抑制RVFV活性的潜在药物。本研究为抗RVFV药物研发提供了理论依据。
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