龟甲作为传统补益类中药，早在《神农本草经》中就有“滋阴潜阳、益肾强骨”的记载^[1]。现代研究表明其具有抗骨质疏松^[2]、骨关节炎^[3]、延缓衰老^[4]、抗癌^[5]等多种药理活性。龟甲富含胶原蛋白、氨基酸及微量元素，其免疫调节作用尤为突出，可通过激活淋巴细胞亚群、调控炎症因子分泌等途径实现机体免疫稳态^[6-7]。

多肽是由氨基酸和氨基酸残基组成的具有生物活性的分子，是相对安全且耐受性好的候选药物，具有高度选择性和有效性，目前大约有140种多肽疗法正在临床试验中进行评估^[8]。已有研究在多种物种中鉴定出具有生物活性的多肽，这些肽在治疗炎症、氧化损伤、糖尿病、高血压和肝损伤方面具有巨大潜力^[9]。免疫肽是生物活性肽中的一种，具有多种免疫调节功能，协调促炎和抗炎反应，在癌症、自身免疫性疾病和炎症研究中发挥积极作用^[10]。龟甲活性肽属于药食同源性的动物蛋白天然肽，其序列与内源性肽相似，不仅具有良好的消化吸收特性，而且还具有更有效的生理功能作用。然而，龟甲活性成分复杂，传统水煎工艺提取效率低，且脂溶性杂质、矿物质等共存成分易干扰其活性评价，导致其物质基础研究长期滞后，限制了龟甲活性肽的发现及其免疫调控机制的解析^[11-12]。在活性成分提取方面，现有研究多聚焦于龟甲胶的制备工艺优化。研究表明，高温高压法可提高胶原蛋白得率，但会导致三螺旋结构破坏，影响功能活性；而酸法提取虽然能保留Ⅰ型胶原完整性，但其得率仅为0.45%-0.51%，难以满足工业化需求^[11]。近年来，酶解-超滤联用技术为动物源性活性肽的开发提供了新思路，超滤分级可有效富集具有特定生物活性的低分子量肽段，使牛骨蛋白水解度提升至21.63%^[13]。基于酶解技术的生物活性肽制备为中药现代化提供了新思路，其通过特异性切割获得分子量明确、功能可溯源的活性组分，已成为中药活性成分研究的重要方向^[14]。基于质谱的蛋白质组学和多肽组学技术可以鉴定样品中的蛋白质和肽段信息，是生物活性肽研究的优选策略，可为中药机理的解析提供更明确的分子作用成分^[15]。

本研究以石金钱龟(Mauremys mutica)龟甲为研究对象，通过制备活性肽组分，系统评价龟甲活性肽对小鼠脾脏细胞、巨噬细胞的调控作用，并对多肽组分进行鉴定，初步预测龟甲活性肽的免疫活性，拟为阐释龟甲药效的科学内涵提供实验证据，并为中药活性肽的制备与功能导向开发提供参考。

1 材料与方法 1.1 材料

石金钱龟(购自广西南宁市淡村市场)，1-2 kg，6只，雌雄各半；C57BL/6小鼠(购自广东维通利华实验动物有限公司)，8-10周，雄性，3只，体重20-22 g，许可证号：SCXK(粤)2022-0063。

复合蛋白酶(ST2301)购自南宁穗肽生物技术有限公司，石油醚(P816693)购自上海麦克林生化科技股份有限公司，CCK-8检测试剂盒(K1018)购自APEXbio技术有限责任公司，RAW264.7巨噬细胞(CL-0190)、RPMI 1640完全培养基(PM150110B)均购自武汉普诺赛生命科技有限公司，红细胞裂解液(R1010)、脂多糖(LPS，L8880)、中性红(G1310)均购自北京索莱宝科技有限公司；一氧化氮(NO)检测试剂盒(S0021S)购自上海碧云天生物技术股份有限公司。

液相色谱(Nano LC)、质谱仪(Q-Exactive)、细胞培养箱(Heracell 150i GP)、离心机(Multifuge X1 R Pro)，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；酶标仪(LogPhase 600)，美国Biotek公司。

1.2 方法 1.2.1 龟甲总蛋白提取

将处理后的石金钱龟剔除内脏、血液及鳞片后，将龟甲洗净并打碎放入锅中，加入纯水熬煮12 h，重复3次。将3次熬煮得到的汤汁合并，过滤残渣，在55 ℃下旋转蒸发浓缩至无冷凝液流出。将浓缩物用石油醚萃取3次除去脂溶性杂质，用截留分子量为10 000 D的透析袋过滤除去部分水溶性小分子，放入真空冷冻干燥箱中冷冻干燥。将干燥物粉碎后按6%添加量加入0.6 moL/L的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液中，搅拌30 min以脱去蛋白中结合的钙，过滤，滤液再次冷冻干燥，得到粗蛋白提取物。

1.2.2 多肽制备

称取粗蛋白提取物，以1∶25(g∶mL)的固液比加入pH值为7.5的NaOH溶液；加入复合蛋白酶，使溶液中的酶浓度为1.8%，55 ℃恒温条件下水浴酶解3 h；放入95 ℃热水浴中，持续搅拌15 min使酶灭活；4 ℃，10 000 r/min离心10 min，收集离心液；将离心液通过截留分子量小于6 000 D的超滤膜过滤，除去灭活酶和未水解的大分子蛋白，然后放入真空冷冻干燥箱冻干，粉碎后得到多肽粉末。

1.2.3 小鼠脾脏细胞存活率检测

小鼠安乐死后，解剖小鼠，分离其脾脏并迅速放入装有RPMI 1640完全培养基的培养皿，用1 mL注射器内芯底部研磨脾脏。用70 μm尼龙细胞滤网过滤细胞，研磨过程中用RPMI 1640完全培养基冲洗细胞滤网和培养皿，最终将滤液和冲洗液收集至50 mL离心管。在20 ℃，3 000 r/min条件下离心细胞悬液10 min。小心弃去上清液，加入2 mL红细胞裂解液，重悬细胞，常温静置2 min，加入10 mL RPMI 1640完全培养基，在20 ℃，3 000 r/min条件下离心细胞悬液10 min。小心弃去上清液，加入培养基重悬细胞，计数细胞并调整浓度为5×10⁴个/mL。在96孔板中每孔接种100 μL细胞悬液。将培养板放入37 ℃，5% CO₂的培养箱中培养24 h。向孔中加入10 μL不同质量浓度(0.00、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75、0.90、1.05 mg/mL)的龟甲活性肽，将培养板放入培养箱中孵育48 h。使用CCK-8检测试剂盒向96孔板每孔中加入10 μL CCK-8溶液，将培养板放入培养箱中孵育3 h，然后使用酶标仪测量450 nm处的吸光度，检测细胞存活率。

1.2.4 巨噬细胞培养与免疫调节验证

将RAW264.7巨噬细胞复苏，在96孔板每孔中接种5 000个细胞，每孔终体积为100 μL。细胞干预实验分为两部分：(1)免疫活性验证部分，用不同终质量浓度(0.00、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75、0.90、1.05 mg/mL)的龟甲活性肽处理48 h；(2)炎症缓解验证部分，用终质量浓度为1 μg/mL的LPS和不同质量浓度(0.00、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75、0.90、1.05 mg/mL)的龟甲活性肽共同处理48 h。LPS是革兰氏阴性菌细胞壁的关键组分，可以诱导巨噬细胞的炎症反应。本研究利用LPS诱导巨噬细胞建立炎症模型，以验证龟甲活性肽对免疫调节的双向作用。

1.2.5 巨噬细胞存活率检测

用龟甲活性肽处理RAW264.7巨噬细胞48 h后，使用CCK-8检测试剂盒向96孔板每孔中加入10 μL CCK-8溶液，将培养板放入培养箱中孵育3 h，然后测量450 nm处的吸光度，检测巨噬细胞存活率。

1.2.6 中性红吞噬能力检测

龟甲活性肽处理RAW264.7巨噬细胞48 h后，小心弃去培养基，每孔加入100 μL中性红溶液，孵育30 min。用200 μL的聚丁二酸丁二醇酯(PBS)洗涤细胞2次，去除残留的中性红。再加入100 μL的细胞裂解缓冲液(冰醋酸和乙醇体积比为1∶1)并在室温下缓慢振摇2 h，在540 nm波长处测定吸光度(OD)，计算不同浓度龟甲活性肽处理的RAW264.7巨噬细胞对中性红的吞噬率。吞噬率(%)=[(OD_处理组－OD_空白组)/(OD_对照组－OD_空白组)]×100%。巨噬细胞对中性红的吞噬率越高则表明其吞噬能力越强。

1.2.7 NO含量检测

龟甲活性肽处理RAW264.7巨噬细胞48 h后，使用NO检测试剂盒收集细胞培养上清液，按50 μL/孔将标准品和样品加入96孔板，于室温下在各孔中加入Griess Reagent Ⅰ和Griess Reagent Ⅱ，在540 nm波长处测定吸光度。

1.2.8 肽段鉴定

使用液相色谱对龟甲活性肽进行分离，缓冲液A液为2%乙腈和0.1%甲酸水溶液，缓冲液B液为98%乙腈和0.1%甲酸水溶液。流速为250 NL/min，梯度洗脱条件：0-5 min，2%-6%缓冲液B；5-32 min，6%-15%缓冲液B；32-49 min，15%-23%缓冲液B；49-51 min，23%-98%缓冲液B；51-56 min，98%-2%缓冲液B；56-61 min，2%缓冲液B。采用质谱仪进行检测，质谱参数设置如下：一级质谱分辨率为70 000；归一化碰撞能量为27；质谱扫描范围为300-2 000 m/z；二级质谱分辨率为17 500；碰撞模式为高能碰撞解离(High-energy Collision Dissociation, HCD)；动态排除持续时间为20 s。使用Proteome Discoverer 2.1软件进行质谱数据分析，检索条件如下：一级质量误差为±20×10^-6，二级质量误差为±0.02 Da，最大漏切位点数2个。蛋白质、肽段鉴定的假阳性率(FDR)设置为1%。

1.2.9 免疫活性肽预测分析

参考Wen等^[16]的研究方法，对经过质谱鉴定后得到的肽序列进行分析，采用NetMHCⅡpan-4.1在线服务器(https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetMHCⅡpan-4.1/)预测所得肽序列的潜在免疫活性，其原理是计算肽段与体内免疫受体主要组织相容性复合体Ⅱ类(MHC-Ⅱ)分子的结合能力，其中MHC-Ⅱ分子参与外源性抗原的呈递，激活辅助性T细胞，进而调控体液免疫和细胞免疫应答。与MHC-Ⅱ分子的结合能力可反映肽段的免疫活性，结合能力介于2%-10%说明肽段可能具有免疫活性。通过PepDraw工具(http://pepdraw.com/)计算肽序列的疏水性、等电点和静电荷。

1.2.10 数据分析

所有的实验数据采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析及可视化处理，通过单因素方差分析(One-way ANOVA)进行组间比较，P＜0.05具有统计学差异。

2 结果与分析 2.1 小鼠脾脏细胞存活率

检测不同浓度龟甲活性肽对小鼠脾脏细胞存活率的影响，结果显示, 不同浓度龟甲活性肽均能显著提高小鼠脾脏细胞存活率，加入0.75 mg/mL的龟甲活性肽时小鼠脾脏细胞存活率最高(图 1)。

2.2 巨噬细胞存活率

检测不同浓度龟甲活性肽对巨噬细胞存活率的影响，结果显示，加入0.60、0.75 mg/mL的龟甲活性肽时，RAW264.7巨噬细胞存活率显著提高(图 2)。检测不同浓度龟甲活性肽对LPS诱导的巨噬细胞炎症状态下的细胞存活率的影响，结果显示，浓度为1.05 mg/mL的龟甲活性肽能显著抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症反应(图 3)。

2.3 中性红吞噬能力

检测不同浓度龟甲活性肽对RAW264.7巨噬细胞吞噬中性红能力的影响，结果显示, 不同浓度龟甲活性肽均能显著提高巨噬细胞的吞噬能力(图 4)。检测不同浓度龟甲活性肽对LPS诱导的炎症巨噬细胞吞噬能力的影响，结果显示, 浓度为0.75、0.90、1.05 mg/mL的龟甲活性肽均能显著降低LPS对巨噬细胞吞噬能力的影响(图 5)。

2.4 NO含量

检测不同浓度龟甲活性肽激活RAW264.7巨噬细胞释放NO的影响，结果显示，浓度大于0.15 mg/mL的龟甲活性肽均能显著提高NO的释放量(图 6)。检测不同浓度龟甲活性肽对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞释放NO的影响，结果显示，0.90、1.05 mg/mL的龟甲活性肽浓度能显著降低LPS对RAW264.7巨噬细胞炎症释放NO的影响(图 7)。

2.5 肽段鉴定

利用质谱鉴定龟甲活性肽的序列，共鉴定出179条肽段，肽段序列如图 8所示。通过NetMHCⅡpan-4.1在线服务器预测具有免疫活性的肽段，筛选到结合亲和力最高的9条肽段序列，这9条肽段的理化性质分析结果见表 1。

3 讨论

本研究通过熬煮提取、石油醚脱脂、透析除杂，采用复合蛋白酶酶解结合超滤纯化，制备得到多肽组分，通过实验证实龟甲活性肽具有显著的免疫调节作用，其机制可能涉及促进免疫细胞增殖、增强吞噬功能以及调控炎症因子释放等多重途径。

前人在油莎豆(Cyperus esculentus)多肽的体外免疫调节研究中发现，油莎豆多肽能显著增强小鼠脾淋巴细胞增殖情况^[17]。本研究结果表明，0.75 mg/mL龟甲活性肽能显著增加小鼠脾脏细胞的存活率，这一脾脏细胞增殖结果与前人研究结果一致，说明在部分物种中可能存在调节小鼠脾脏细胞的多肽。本研究结果显示，0.75 mg/mL的龟甲活性肽可使小鼠脾脏细胞存活率达到峰值，这与RAW264.7巨噬细胞的最佳刺激浓度为0.60-0.75 mg/mL的结果一致。此外，中性红吞噬实验结果表明所有测试浓度均能显著提升RAW264.7巨噬细胞的吞噬能力，提示龟甲活性肽可能通过免疫活性机制发挥作用。在LPS诱导的炎症模型中，1.05 mg/mL龟甲活性肽表现出最强的抗炎效果，反映龟甲活性肽具有免疫稳态调节功能。

大量研究表明，多种物种中均具有免疫活性多肽。其中，裸体方格星虫(Sipunculus nudus)免疫活性肽能够增强小鼠细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能和自然杀伤(NK)细胞活性^[18]。金枪鱼蛋白水解产物中的免疫活性组分可以显著增加小鼠RAW264.7巨噬细胞的相对增殖率、吞噬能力、NO生成能力^[19]。甲鱼(Pelodiscus sinensis)水解肽能够调节Caco-2细胞免疫相关分子TLR4、NF-κB、MD2的表达，促进促炎细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α，以及抑炎细胞因子IL-10的表达，进而激活细胞免疫；对于细胞炎症模型，甲鱼水解肽能够下调促炎细胞因子IL-6、IL-1β的表达，上调抑炎细胞因子IL-10的表达，降低iNOS的表达量，进而缓解细胞的炎症反应^[20]。本研究所选用的龟甲活性肽的免疫效果与前人研究一致，表明其具有作为免疫活性肽的潜力。

本研究在质谱鉴定获得的179条肽段中，通过NetMHCⅡpan-4.1在线服务器预测筛选，筛选出具有与MHC-Ⅱ分子结合能力的9条肽段。研究表明，通过NetMHCⅡpan筛选大米免疫活性多肽，在LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中，可通过调控巨噬细胞NO的产生，及TNF-α、IL-6、IL-1β的释放进行免疫活性调节^[16]，以此推断本研究筛选到的免疫活性肽段可能具有相同的作用效应。然而本研究仍存在不足，没有对筛选到的免疫活性肽段进行功能验证，解析其调控的具体分子机制，因此仍需对其进行深入研究。

4 结论

本研究通过体外实验系统评估了龟甲活性肽对免疫细胞的调节作用，鉴定并筛选了其潜在活性肽段。通过对小鼠脾脏细胞的干预，发现龟甲活性肽具有促进适应性免疫的潜力；在巨噬细胞功能验证中，发现其能有效激活先天免疫反应；在LPS诱导的炎症模型中，发现其具有抗炎作用，说明龟甲活性肽可能通过调控巨噬细胞来发挥免疫稳态调节功能。通过鉴定和分析发现潜在免疫活性肽段与MHC-Ⅱ分子具有高结合亲和力，表明龟甲活性肽可能通过抗原提呈途径激活T细胞免疫应答。