2. 广西科学院, 非粮生物质能技术全国重点实验室, 广西南宁 530007
2. National Key Laboratory of Non-food Biomass Energy Technology, Guangxi Academy of Sciences, Nanning, Guangxi, 530007, China
几丁质是一种广泛存在于自然界中的高分子含氮多糖[1]，常见于昆虫、甲壳类动物的外骨骼以及某些真菌的细胞壁中。由于几丁质具有高结晶性和不溶于水的特性，限制了其在多个领域的应用[2]。几丁质脱乙酰酶(Chitin deacetylase, CDA)的发现为几丁质的转化提供了一种新途径，几丁质脱乙酰酶能够催化几丁质或几丁寡糖中的N -乙酰氨基葡萄糖胺的乙酰基水解，生成具有生物活性的壳聚糖或壳寡糖[3]，这类壳聚糖和壳寡糖具有较好的生物相容性、生物可降解性以及多种生理活性，如抗肿瘤、抑菌、提高免疫力等，在农业、食品、医药等领域具有重要的应用价值和商业前景[4]。
目前，壳聚糖通常采用化学法制备，即采用浓碱对几丁质进行脱乙酰处理。然而，化学法制备壳聚糖会产生大量高碱度废水，而且获得的壳聚糖具有随机的乙酰化模式，从而影响其理化性质。相比之下，采用几丁质脱乙酰酶法制备壳聚糖是一种更为绿色、高效且环境友好的方法。酶法制备的壳聚糖具有非随机的乙酰化模式，反应条件温和，产物得率高且均一性好[5]。尽管酶法具有许多优点，但在实际应用中仍面临一些挑战。例如，重组酶在表达过程中可能形成无活性的包涵体，这限制了其在工业生产中的应用。因此，开发不同微生物来源的几丁质脱乙酰酶，以获得大量具有活性的重组酶，对推动酶法制备壳聚糖的工业化具有现实意义。
几丁质脱乙酰酶的来源研究主要集中在真菌和昆虫，如鲁氏毛霉(Mucor rouxii)[6]、蓝色犁头霉(Absidia coerulea)[7]、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)[8]、家蚕(Bombyx mori)[9]、黄粉虫(Tenebrio molitor)[10]和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)[11]等。目前来源于细菌的几丁质脱乙酰酶报道较少，仅有霍乱弧菌(Vibrio cholerae)[12]、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[13]和红球菌(Rhodococcus sp.)[14]等。几丁质脱乙酰酶的自然来源很丰富，但天然获得的几丁质脱乙酰酶存在很多问题：野生型微生物产酶量低，粗酶液杂质多，且多为胞内酶，不易分离纯化[15]。目前几丁质脱乙酰酶的异源表达主要为大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统、酵母表达系统和昆虫细胞表达系统等，其中，大肠杆菌表达系统以其生长迅速、易于培养、遗传操作简便、蛋白质表达量高等特点，成为多种酶蛋白大规模生产的理想选择[16-17]。本研究利用大肠杆菌表达系统，对几丁质脱乙酰酶产生菌Chitinilyticum aquatile CSC-1[18]中的几丁质脱乙酰酶Ca CDA1及其截短突变体Ca CDA1_CD进行异源表达，拟为该酶的进一步研究和利用奠定理论基础，也为开发新型的几丁质转化技术提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 材料本研究采用的的菌株C.aquatile CSC-1由实验室保藏。E.coli DH5α、E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL购于上海吐露港生物科技有限公司；限制性内切酶Nco Ⅰ、Hin dⅢ、Nde Ⅰ、Xho Ⅰ购于宝日医生物技术(北京)有限公司；Direct-Load StarMarker D2000、StarPrep DNA纯化/胶回收试剂盒、StarPrep质粒快速小提试剂盒购于北京康润诚业生物科技有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司；2×ClonExpress Mix和2×Phanta Max Master Mix购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司。
LB液体培养基：酵母粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L，121 ℃灭菌20 min。LB固体培养基：酵母粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L、琼脂粉15 g/L，121 ℃灭菌20 min。
1.2 方法 1.2.1 C.aquatile CSC-1总DNA的提取使用细菌基因组DNA提取试剂盒对C.aquatile CSC-1的总DNA进行提取，具体步骤参照试剂盒说明书。
1.2.2 蛋白质结构的生物信息学预测分析从Uniprot数据库(https://www.uniprot.orgl)和美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中调取若干目前已知的细菌来源脱乙酰酶的氨基酸序列，将不同微生物来源的脱乙酰酶的氨基酸序列进行比对，并绘制系统进化树。使用NCBI数据库分析目标蛋白质的结构域，使用SignalP 5.0网站(https://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测分析蛋白质表达中的信号肽，跨膜结构区的预测分析通过TMHMM网站(https://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)完成。
1.2.3 引物设计根据不同的载体，使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司CE Design在线网站设计Ca CDA1及Ca CDA1_CD的特异性引物以扩增目的基因，引物序列详见表 1。
| 基因名称Name of the gene | 引物名称Primer name | 引物序列(5′→3′)Primer sequences(5′→3′) |
| Ca CDA1 | 22b-Ca CDA1-F | cccagccggcgatggccatggATATGACCGCTATTGCCCTGAG |
| 22b-Ca CDA1-R | ctcgagtgcggccgcaagcttGGGGAAAAGCGGCCCTTG | |
| 28a-Ca CDA1-F | gtgccgcgcggcagccatatgATGACCGCTATTGCCCTGAG | |
| 28a-Ca CDA1-R | gtggtggtggtggtgctcgagGGGGAAAAGCGGCCCTTG | |
| 32a-Ca CDA1-F | acgacgacgacaaggccatggCTATGACCGCTATTGCCCTGA | |
| 32a-Ca CDA1-R | ctcgagtgcggccgcaagcttGGGGAAAAGCGGCCCTTG | |
| Ca CDA1_CD | 28a-Ca CDA1_CD-F | gtgccgcgcggcagccatatgATGACCGCTATTGCCCTGAG |
| 28a-Ca CDA1_CD-R | gtggtggtggtggtgctcgagGCCTTCCGTGGCCGAAAC | |
| 32a-Ca CDA1_CD-F | acgacgacgacaaggccatggCTATGACCGCTATTGCCCTGA | |
| 32a-Ca CDA1_CD-R | ctcgagtgcggccgcaagcttGCCTTCCGTGGCCGAAAC | |
| Note: the lowercase letters in the primer sequences represent homologous arms. | ||
1.2.4 重组质粒的构建
以C.aquatile CSC-1的总DNA为扩增模板，利用本研究设计的特异性引物对22b-Ca CDA1-F/R、28a-Ca CDA1-F/R、32a-Ca CDA1-F/R，及针对截短体设计的特异性引物对28a-Ca CDA1_CD-F/R、32a-Ca CDA1_CD-F/R(表 1)，通过PCR技术对目的基因分别进行扩增。PCR反应体系：模板1 μL；上、下游引物各1 μL；2×Phanta Max Master Mix 25 μL；无菌水补充体系至50 μL。PCR反应条件：预变性95 ℃ 5 min；变性95 ℃ 30 s，退火65 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 2 min，35个循环后72 ℃，延伸10 min。PCR产物经琼脂凝胶电泳检测并进行纯化回收。采用Nco Ⅰ、Hin dⅢ酶对实验室保藏的pET-22b和pET-32a质粒分别进行双酶切，采用Nde Ⅰ、Xho Ⅰ酶对pET-28a进行双酶切，37 ℃孵育15 min，分别纯化、回收线性化的载体，利用同源重组酶将目的片段和线性化的载体于50 ℃同源重组5 min，同源重组产物转化至E.coli DH5α感受态细胞，转化子进行菌落PCR鉴定，将阳性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。
1.2.5 目的蛋白的诱导表达测序正确的重组质粒pET22b-Ca CDA1、pET28a-Ca CDA1、pET32a-Ca CDA1、pET28a-Ca CDA1_CD和pET32a-Ca CDA1_CD分别转化至表达宿主E.coli BL21 CodonPlus(DE3)-RIPL，获得表达菌株pET22b-Ca CDA1/RIPL、pET28a-Ca CDA1/RIPL、pET32a-Ca CDA1/RIPL、pET28a-Ca CDA1_CD/RIPL和pET32a-Ca CDA1_CD/RIPL, 其对应抗生素的选择详见表 2。
| 重组质粒Recombinant plasmid | 抗生素Antibiotics |
| pET22b-Ca CDA1 | Amp+Cm |
| pET28a-Ca CDA1 | Km+Cm |
| pET32a-Ca CDA1 | Amp+Cm |
| pET28a-Ca CDA1_CD | Km+Cm |
| pET32a-Ca CDA1_CD | Amp+Cm |
| Note: Amp means ampicillin, Cm means chloromycetin, Km means kanamycin. | |
表达菌株接种于LB液体培养基(添加对应抗生素)中，37 ℃、220 r/min过夜培养，按1%接种量转接至10 mL LB液体培养基(添加对应抗生素)中培养至OD600=0.6-0.8，加入0.1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，16 ℃诱导表达24 h，取2 mL菌液，12 000 r/min离心3 min后收集菌体，破胞，再次离心得到的上清液即为重组蛋白的粗酶液，分别取样进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测目的蛋白的表达情况。
1.2.6 几丁质脱乙酰酶的酶活测定首先称取0.01 g的对硝基苯胺，放入烧杯中，加100 mL的双蒸水(ddH2O)溶化该粉末，配制成标准溶液。取10个2 mL EP管，配制对硝基苯胺浓度分别为0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mg/mL的系列稀释液，以ddH2O作空白对照，测定各稀释液在400 nm处的吸光度(A400)。然后，对浓度与吸光度数据进行线性回归，建立标准曲线。
几丁质脱乙酰酶的酶活测定：取45 ℃预保温的浓度为0.05 mol/L(pH值=7.0)的Tris-HCl缓冲溶液3 mL、浓度为200 mg/L的4-硝基乙酰苯胺溶液1 mL、几丁质脱乙酰酶溶液1 mL，45 ℃水浴反应15 min，沸水浴终止酶促反应，用ddH2O定容至10 mL，混匀，3 000 r/min离心10 min，测定上清液的A400。对照中加入的酶液经过沸水浴灭活。
几丁质脱乙酰酶的酶活单位定义为在相同底物浓度、相同时间和温度条件下，每小时几丁质脱乙酰酶催化底物产生1 μg对硝基苯胺所需要的酶液的体积，几丁质脱乙酰酶活性(EA)计算公式为EA ＝(A′400－A0)/K ×t。式中，A′400为几丁质脱乙酰酶反应体系在400 nm处的吸光度；A0为空白对照的吸光度；K为线性系数；t为酶催化反应时间(h)[19]。
1.2.7 温度和pH值对几丁质脱乙酰酶活性的影响根据上述酶活测定方法，采用pH值为7.0的Tris-HCL缓冲液，在温度分别为20、30、35、40、45、50、55、60、70 ℃下进行酶活测定，考察温度对几丁质脱乙酰酶活性的影响。
根据上述酶活测定方法，在45 ℃下，在pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的Tris-HCl缓冲液中进行酶活测定，考察pH值对几丁质脱乙酰酶活性的影响。
2 结果与分析 2.1 几丁质脱乙酰酶的同源序列比对与结构预测图 1为不同微生物来源的脱乙酰酶的系统进化树。基于氨基酸序列比对构建的系统进化树表明，在已报道的壳聚二糖脱乙酰酶中，Ca CDA1与来自类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)的几丁质脱乙酰酶(GenBank number RAQ91804.1)[20]亲缘关系最为接近，氨基酸序列一致性为26.54%；与来自大肠杆菌K12(E.coli K12)的GlcNAc-6-P脱乙酰酶(UniProt number P0AF18)[21]亲缘关系最远。
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| 图 1 不同微生物来源的脱乙酰酶的系统进化树 Fig. 1 Phylogenetic relationship of deacetylase genes in different species |
同源基因的氨基酸序列分析结果表明，功能相同的脱乙酰酶基因序列在进化上具有很高的保守性(图 2)。
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| 图 2 不同物种脱乙酰酶基因的氨基酸序列比对 Fig. 2 Amino acid sequence alignment between deacetylase genes in different species |
Ca CDA1蛋白质结构域预测结果显示，Ca CDA1仅由1个几丁质脱乙酰酶催化结构域构成。为优化Ca CDA1的表达并研究其催化结构域，对其进行截短处理，得到截短突变体CaCDA1_CD(图 3)。
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| 图 3 Ca CDA1及其截短突变体结构域示意图 Fig. 3 Schematic diagram of structural domains of Ca CDA1 and its truncated mutant |
2.2 Ca CDA1目的基因的扩增
根据设计引物确定的基因基本信息如表 3所示。琼脂凝胶电泳结果显示，基因大小符合实际理论大小(图 4), 说明基因扩增成功，纯化后可进行后续的实验。
| 名称Name | 来源Source | 基因大小/bpGenome size/bp | 氨基酸数量Number of amino acids | 蛋白理论分子量/kDaTheoretical molecular weight of protein/kDa | 等电点(pI)Isoelectric point (pI) |
| Ca CDA1 | Chitinilyticum aquatile CSC-1 | 861 | 286 | 31.44 | 6.08 |
| Ca CDA1_CD | C.aquatile CSC-1 | 501 | 167 | 18.58 | 8.06 |
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| M：Marker；1：Ca CDA1 gene；2：Ca CDA1_CD gene. 图 4 几丁质脱乙酰酶目的基因的扩增结果 Fig. 4 Target gene amplification of chitin deacetylase |
2.3 重组质粒的构建
Ca CDA1、Ca CDA1_CD的菌落PCR鉴定结果如图 5所示，基因大小与实际理论大小相符。随后通过质粒酶切验证，采用限制性内切酶均能重新切下相应大小的条带，如图 6所示，表明成功构建了重组质粒。
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| M: Marker; 1:Results of colony PCR for Ca CDA1 and Ca CDA1_CD; (a) Positive clone of pET-22b-Ca CDA1/DH5α; (b) pET28a-Ca CDA1/DH5α; (c) Positive clone of pET-32a-Ca CDA1/DH5α; (d) Positive clone of pET-28a-Ca CDA1_CD/DH5α; (e) Positive clone of pET-32a-Ca CDA1_CD/DH5α. 图 5 克隆宿主菌落的PCR结果 Fig. 5 PCR results for host colonies |
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| M: Marker, 1:pET-22b-Ca CDA1;2:pET28a-Ca CDA1;3:pET-32a-Ca CDA1;4:pET-28a-Ca CDA1_CD; 5:pET-32a-Ca CDA1_CD. 图 6 酶切质粒验证的PCR结果 Fig. 6 PCR results for verification plasmid restriction enzyme digestion |
2.4 几丁质脱乙酰酶的诱导表达
表达菌株pET22b-Ca CDA1/RIPL、pET28a-Ca CDA1/RIPL、pET32a-Ca CDA1/RIPL、pET28a-Ca CDA1_CD/RIPL与pET32a-Ca CDA1_CD/RIPL的SDS-PAGE分析表明，pET28a-Ca CDA1/RIPL、pET28a-Ca CDA1_CD/RIPL均为可溶性表达(图 7)。
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| M: Marker; 1:Total protein; 2:Supernatant.The red box represents the target protein.(a) pET-22b-Ca CDA1/RIPL; (b) pET28a-Ca CDA1/RIPL; (c) pET-32a-Ca CDA1/RIPL; (d) pET28a-Ca CDA1_CD/RIPL; (e) pET32a-Ca CDA1_CD/RIPL. 图 7 Ca CDA1、Ca CDA1_CD的SDS-PAGE电泳图 Fig. 7 SDS-PAGE electropherograms of Ca CDA1 and Ca CDA1_CD |
由于pET-22b-Ca CDA1/RIPL、pET-32a-Ca CDA1/RIPL、pET32a-Ca CDA1_CD/RIPL无明显表达，分别对pET28a-Ca CDA1/RIPL和pET28a-Ca CDA1_CD/RIPL诱导表达后的粗酶液进行酶活测定。粗酶液酶活测定结果显示全长蛋白的酶活性高于截短体，因此，后续实验仅对pET28a-Ca CDA1/RIPL编码酶进行最适温度和最适pH值酶学性质研究。
2.5 几丁质脱乙酰酶Ca CDA1的酶学性质 2.5.1 标准曲线绘制以对硝基乙酰苯胺浓度为横坐标，400 nm处的吸光度为纵坐标绘制标准曲线。线性方程为y =0.6267x +0.0431，R 2为0.999 8，吻合度较高。
2.5.2 温度对Ca CDA1酶活性的影响pET28a-Ca CDA1/RIPL在20-70 ℃的温度范围内均表现出酶活性(图 8)。Ca CDA1在45 ℃时达到最高酶活性。在30-50 ℃的温度范围内，Ca CDA1的酶活性仍然保持在65%以上。此外，酶活性的变化趋势呈现出先上升后下降的特点。在较低温度(20-45 ℃)时，酶活性随着温度的升高而逐渐增高；而温度＞45 ℃、＜70 ℃时，酶活性则随着温度的升高而逐渐降低。
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| 图 8 温度对Ca CDA1粗酶活性的影响 Fig. 8 Influence of temperature on the crude enzyme activity of Ca CDA1 |
2.5.3 pH值对Ca CDA1酶活性的影响
pET28a-Ca CDA1/RIPL在pH值3.0-8.0内均表现出酶活性(图 9)。在pH值＜5.0时，Ca CDA1的酶活性较低，表明酸性环境对其酶活性有一定的抑制作用。随着pH值逐渐升高，Ca CDA1的酶活性开始上升并在pH值为5.0时达到峰值，此时Ca CDA1的催化效率最佳，由此可知该酶为弱酸性酶。但当pH值＞5时，酶活性开始下降，表明碱性环境同样不利于Ca CDA1的酶活性保持。
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| 图 9 pH值对Ca CDA1粗酶活性的影响 Fig. 9 Influence of pH value on the crude enzyme activity of Ca CDA1 |
2.5.4 最适条件下Ca CDA1与Ca CDA1_CD的酶活性
按上述最适温度45 ℃、最适pH值5.0分别对pET28a-Ca CDA1/RIPL和pET28a-Ca CDA1_CD/RIPL诱导表达后的粗酶液进行几丁质脱乙酰酶活性测定。结果显示，Ca CDA1的酶活性为(7.70±0.47) U/mL，其截短突变体Ca CDA1_CD的酶活性为(6.12±0.57) U/mL。
3 讨论利用基因工程技术，本研究从前期获得的具有几丁质降解能力的新颖菌株C.aquatile CSC-1中成功克隆得到Ca CDA1及Ca CDA1_CD的基因。Ca CDA1的编码基因大小低于1 000 bp，易于克隆表达[22]。Ca CDA1的结构域分析结果表明，Ca CDA1属于糖酯酶4大家族[Carbohydrate esterase 4 (CE4) superfamily]，这一家族包括多种具有重要生物催化功能的酶，如几丁质脱乙酰酶(EC 3.5.1.41)、细菌的糖肽N -乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶(EC 3.5.1.-)和乙酰木糖酯酶(EC 3.1.1.72)等[23-26]。这些酶在生物降解和生物合成过程中发挥着关键作用。通过信号肽结构序列和跨膜结构区的预测分析发现，Ca CDA1不含信号肽结构序列和跨膜结构区。这一结果表明Ca CDA1不属于分泌型蛋白质，而是可能定位于胞质内以发挥脱乙酰作用，同时也为后续在原核系统中实现异源表达和获得可溶性蛋白提供了理论依据。
大肠杆菌表达系统因其操作简单且能在廉价的培养基中实现高密度培养等优势，在大多数科研应用中已成为高效表达异源蛋白的常用工具[27]。本研究采用大肠杆菌表达系统进行异源表达，可能由于Ca CDA1和Ca CDA1_CD在pET22b和pET32a载体中稳定性较差或无法正确折叠，导致其陷入常见的包涵体表达问题; 而本研究将其更换到合适的pET28a载体中，成功获得了可溶性表达，这可能是由于pET28a载体N端携带有His/T7蛋白标签，这一标签有助于促进蛋白质的可溶性表达。然而大肠杆菌表达系统依然存在表达量低的问题。为获得更高的表达量，未来的研究可以尝试酵母表达系统。酵母菌拥有完整的分泌表达体系，能够促使异源蛋白正确折叠，并分泌至胞外，不仅能提高异源蛋白的稳定性，而且对其酶活性提升也会有所帮助[19, 28]。
根据酶活测定结果，与Ca CDA1相比，Ca CDA1_CD的活性有所降低，这种现象可能是因为截短体影响了酶的三维结构，导致活性位点发生变化，进而影响了酶的活力[29]。Ca CDA1的最适反应温度为45 ℃，略低于已报道的大多数脱乙酰酶的最适反应温度(通常为50 ℃)[30]，但高于霍氏红球菌(Rhodococcus hoagii)来源的同功能酶(最适反应温度40 ℃)[31]。这一差异可能源于不同物种间酶蛋白的热稳定性或底物结合域的结构特征差异。此温度特性使Ca CDA1在中温反应体系等工业应用中具有潜在优势。然而，长时间暴露于高温环境时仍需谨慎，以避免酶活性的持续衰减。未来可通过定点突变或固定化技术进一步优化其热稳定性，拓宽应用场景。Ca CDA1最适pH值为5.0，与枯草芽孢杆菌来源的几丁质脱乙酰酶(最适pH值为4.5-5.0)相似[32]，但低于申氏不动杆菌MCDA01(Acinetobacter schindleri MCDA01)来源的As CDA01(最适pH值为7.0)[33]。这一差异可能源于不同物种间酶活性中心电荷分布或质子化状态的调控机制差异。此嗜酸特性使Ca CDA1在弱酸性反应体系等工业应用中具有潜在优势，未来可通过定点突变或分子动力学模拟，探究关键残基对pH敏感性的调控机制，以优化其在工业应用中的稳定性。
本研究成功克隆表达了Ca CDA1，丰富了现有的细菌几丁质脱乙酰酶种类，但对Ca CDA1的酶学性质仍需进一步探究，并可尝试使用酵母表达系统对其进行更深入的研究。
4 结论本研究成功克隆了来自C.aquatile CSC-1的几丁质脱乙酰酶Ca CDA1的编码基因及其截短突变体Ca CDA1_CD，并构建了重组质粒pET22b-Ca CDA1、pET28a-Ca CDA1、pET32a-Ca CDA1α、pET28a-Ca CDA1_CD、pET32a-Ca CDA1_CD。对克隆的几丁质脱乙酰酶进行诱导表达，发现pET28a-Ca CDA1/RIPL与pET28a-Ca CDA1_CD/RIPL有可溶表达，对其粗酶液进行酶活测定，确定了Ca CDA1和Ca CDA1_CD的粗酶液活性分别为(7.70±0.47) U/mL和(6.12±0.57) U/mL，Ca CDA1粗酶液的最适温度为45 ℃，最适pH值为5.0。研究结果为该基因的进一步研究和利用奠定了基础，并为进一步开发新型生物催化剂提供了科学依据。
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