2. 广西科学院, 非粮生物质能技术全国重点实验室, 广西南宁 530007;
3. 南宁学院, 食品与质量工程学院, 广西南宁 530299
2. National Key Laboratory of Non-food Biomass Energy Technology, Guangxi Academy of Sciences, Nanning, Guangxi, 530007, China;
3. College of Food and Quality Engineering, Nanning University, Nanning, Guangxi, 530299, China
几丁质，亦称甲壳素，是一种由N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)通过β-1, 4糖苷键紧密连接而构成的不溶性线性生物大分子聚合物，广泛存在于昆虫和甲壳类动物的外骨骼中[1]。这种独特的生物大分子不仅展现出丰富的生物活性(如增强免疫力、抗氧化、促进伤口愈合等)，而且还蕴藏着巨大的工业应用潜力(如吸附重金属、作为药物载体等)[2]。然而，由于其高度不溶性，传统的化学和物理方法处理效率较低[3]。因此，深入探索几丁质的生物降解途径，特别是发掘新颖多功能的几丁质酶，对推动几丁质的绿色、高效降解及其高值化利用具有重要的意义。
几丁质酶(EC 3.2.1.14)是一类能够水解几丁质β-1, 4糖苷键从而产生几丁寡糖或单糖的糖苷水解酶。根据水解位置不同，几丁质酶可分为内切几丁质酶和外切几丁质酶。内切几丁质酶随机作用于几丁质的β-1, 4糖苷键，使几丁质链断裂，从而释放GlcNAc和几丁寡糖(NCOS)；外切几丁质酶则分为几丁二糖外切酶和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.52)。其中，几丁二糖外切酶可以作用于几丁质的还原端或非还原端，逐渐释放几丁二糖，而β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶能够将NCOS水解为GlcNAc[4]。近年来，由于GlcNAc和NCOS具有多种经济效益，几丁质酶受到了越来越多的关注[5]。例如，几丁质酶在食品工业中可以通过绿色途径将几丁质转化为NCOS和GlcNAc[6]；在能源工业中，可以将几丁质废物转化为生物乙醇[7]；在农业领域中，则可用于真菌病原体的生物防控[8]。
根据氨基酸序列的相似性，几丁质酶主要分为糖苷水解酶家族18(GH18)和家族19(GH19)，其中GH18在结晶几丁质的降解中发挥着至关重要的作用[9]。由于结晶几丁质结构致密、难以降解，因此多结构域几丁质酶在催化效率上更具优势。多结构域几丁质酶通常由以下功能域协同发挥作用：催化结构域(Catalytic Domain，CD)直接水解几丁质链，几丁质结合域(Chitin-Binding Domain，ChBD)靶向结合底物，而辅助结构域(如Ⅲ型纤维连接蛋白，Fibronectin type Ⅲ)则通过加强底物接触或增强机械稳定性来进一步提升降解效率[10]。
笔者所在实验室从广西多种生态环境中分离出一株高效几丁质降解菌，经鉴定为Chitinilyticum aquatile CSC-1[11](与Chitinilyticum aquatile c14T[12]相似性最高)。Chitinilyticum属的Chitinilyticum litopenaei c1T[13]和Chitinilyticum aquatile c14T[12]都有较强的几丁质水解能力，但该属的几丁质酶水解模式和催化机制尚不完全清晰。目前已报道的Chitinilyticum aquatile CSC-1中的几丁质酶仅有CaChi18A及其截短突变体CaChi18A_ΔChBD1、CaChi18A_ΔChBDs[11]进行了酶学性质研究。因此，本研究以从Chitinilyticum aquatile CSC-1挖掘出的新型几丁质酶基因CaChi18B为研究对象，模拟分析该基因所表达酶的分子结构，并进一步克隆该基因及其截短突变体CaChi18B_ΔChBD1，同时实现异源表达；另外，通过纯化CaChi18B_ΔChBD1并分析其酶学性质，进一步解析该酶的水解模式，拟为几丁质酶的结构-功能关系解析提供新思路，同时为高效制备高附加值产物GlcNAc、减少生物资源浪费提供潜在技术方案。
1 材料与方法 1.1 材料与试剂Chitinilyticum aquatile CSC-1，Escherichia coli DH5α，E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL与质粒pET-22b(+)，均为本实验室保藏。限制性内切酶QuickCut NcoⅠ、QuickCut HindⅢ购于宝日医生物技术(北京)有限公司；DNA分子质量标准物(Star Marker D2000)、质粒快速小提试剂盒购于北京康润诚业生物科技有限公司(Genstar)；2× ClonExpress Mix、2× Phanta Max Master Mix购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司(Vazyme)。LB液体培养基：酵母粉5 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1、NaCl 10 g·L-1，121 ℃灭菌20 min。LB固体培养基：酵母粉5 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1、NaCl 10 g·L-1、琼脂粉15 g·L-1，121 ℃灭菌20 min。Tris-NaCl平衡液：Tris 20 mmol·L-1，NaCl 300 mmol·L-1。
1.2 几丁质酶CaChi18B的生物信息学分析采用Expasy[14](https://web.expasy.org/compute_pi/)分析蛋白质的理化性质，使用SignalP 6.0[15](https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0)预测信号肽，用SMART[16] (https://smart.embl.de/)分析结构域，使用DOG 1.0[17]对结构域作图，用MEGA 11[18]构建系统发育树，用ChiPlot(https://chiplot.online/)里的TVBOT[19]美化系统发育树。
1.3 CaChi18B及其截短突变体基因的克隆与表达目的基因的克隆：以pET-22b(+)为载体，选择NcoⅠ和HindⅢ为限制性酶切位点，使用南京诺维赞生物科技股份有限公司的CE Design(https://crm.vazyme.com/cetool/simple.html)在线网站设计无信号肽的几丁质酶基因CaChi18B及其截短突变体CaChi18B_ΔChBD1的引物以扩增目的基因，引物序列如表 1所示。
| 引物Primer | 序列Sequence |
| CaChi18B-F | 5′- cccagccggcgatggccatggGCCGACTGGCAAGAAGGC-3′ |
| CaChi18B-R | 5′- ctcgagtgcggccgcaagcttCTGCTTGACCTTGCTCATGGC-3′ |
| CaChi18B_ΔChBD1-F | 5′- cccagccggcgatggccatggGGCGCCTGCTCCGGCAGC-3′ |
| CaChi18B_ΔChBD1-R | 5′- ctcgagtgcggccgcaagcttCTGCTTGACCTTGCTCATGGC-3′ |
| Note: the lowercase letters in the primers represent the homologous arms, while the uppercase letters indicate the specific amplification sequences.The underline indicated the restriction sites of QuickCut NcoⅠ(ccatgg) and QuickCut HindⅢ(aagctt). | |
目的基因扩增及纯化：以Chitinilyticum aquatile CSC-1总DNA为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)对目的基因CaChi18B、CaChi18B_ΔChBD1进行扩增。PCR反应体系：模板1 μL，上、下游引物各1 μL，2× Phanta Max Master Mix 25 μL，无菌水补充总体积至50 μL。PCR反应条件：预变性95 ℃ 5 min；变性95 ℃ 30 s，退火65 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 2 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，选择目的条带正确的PCR反应产物并利用DNA纯化试剂盒进行纯化。
载体质粒的酶切及纯化：培养含有pET-22b (+) 的E.coli DH5α菌株，并使用质粒提取试剂盒提取质粒。提取的质粒经1%琼脂糖凝胶电泳验证后用限制性内切酶QuickCut Nco Ⅰ和QuickCut HindⅢ酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测无误后用DNA纯化试剂盒进行纯化回收。
重组质粒的构建及转化：将纯化后的酶切载体与目的基因进行同源重组，将同源重组产物转化至E.coli DH5α感受态细胞中，挑选阳性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
1.4 CaChi18B及其截短突变体的表达与纯化重组表达菌株的构建：从测序正确的阳性重组菌中获取重组质粒，将其转入表达宿主E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL中。
重组蛋白的诱导表达与纯化：将上述菌株在37 ℃培养至OD600为0.8时，于16 ℃诱导20 h，然后在8 000 r·min-1下离心10 min收集菌体，使用Tris-NaCl平衡液重悬菌体，并采用超声破碎法裂解细胞，获得破胞液。将破胞液置于4 ℃下以12 000 r·min-1离心30 min，收集上清液。使用Ni-NTA Beads 6FF对上清液进行亲和层析纯化，得到的洗脱液即为纯酶[使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对酶进行验证]。使用超滤离心管浓缩蛋白洗脱液到相应浓度，以便后续进行酶学性质的研究。
1.5 酶活力测定参考Gao等[20]的方法，利用DNS法测定几丁质酶的活力，并在该方法基础上进行细微改动。反应体系包含400 μL 2%胶体几丁质(pH值为7)和100 μL 0.1 mg·mL-1酶溶液。将上述混合物在50 ℃下反应10 min，随后在沸水浴中处理10 min以终止反应，在冰水中冷却至室温。每管加入500 μL DNS溶液，随后在沸水浴中加热5 min显色，最后冷却至室温。将此混合物在12 000 r·min-1下离心5 min，吸取200 μL上清液置于96孔酶标板中，并在540 nm处测定吸光度。空白对照为400 μL 2%胶体几丁质(pH值为7)和100 μL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液在相同反应条件下反应所得的上清液。根据实验组和对照组吸光度的差值计算所产生的还原糖的量，并根据标准曲线计算几丁质酶的酶活力。每个实验组重复3次。几丁质酶酶活力(U)定义为在上述反应条件下每分钟释放1 μmol N-乙酰-D-氨基葡萄糖所需要的酶量。比活力(U·mg-1)则定义为每毫克(mg)几丁质酶所具有的酶活力单位数。
1.6 CaChi18B_ΔChBD1酶学性质的研究根据Chen等[11]的方法，对CaChi18B_ΔChBD1的酶学性质进行研究。
1.6.1 CaChi18B_ΔChBD1的最适温度及温度稳定性充分混合400 μL 2%胶体几丁质与100 μL酶液，分别置于5、10、20、30、40、45、50、60、70 ℃下反应10 min，以测定不同温度下几丁质酶的酶活力。作为对照组，采用等量的100 mmol·L-1柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液代替酶液，并向其中加入等量的胶体几丁质。反应结束后，根据标准曲线计算酶活力。设定测得的最高酶活力为100%酶活，并以此为基准，将其他温度下的酶活力进行相对百分比的换算。
将纯化的CaChi18B_ΔChBD1分别置于0、5、10、20、30、40、50、60、70 ℃下孵育30 min。孵育完成后，将不同温度下放置的几丁质酶与底物充分混匀，并在该酶的最适反应温度下进行反应。根据标准曲线计算反应后剩余的酶活力，设定未经过任何温度孵育的几丁质酶酶活力为100%，计算CaChi18B_ΔChBD1在不同温度条件下的相对剩余酶活力。
1.6.2 CaChi18B_ΔChBD1的最适pH值及pH稳定性将不同pH值(pH值为3-12)的胶体几丁质与CaChi18B_ΔChBD1混合均匀，在最适温度下检测酶活力，以确定该酶的最适pH值。根据标准曲线计算酶活力，酶活力最高的pH值即为该酶的最适pH值。
将纯化后的酶稀释于pH值为3-8的100 mmol·L-1柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液和pH值为8-12的100 mmol·L-1甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中，于4 ℃环境下孵育3 h。孵育后，将不同pH值下放置的CaChi18B_ΔChBD1与底物均匀混合，并在最适pH值条件下检测其残余的酶活力。将未经过任何缓冲液孵育的几丁质酶酶活力设为100%，以此计算各pH值下的相对酶活力。
1.6.3 CaChi18B_ΔChBD1的半衰期(t1/2)将CaChi18B_ΔChBD1在最适温度下孵育不同时间(0、5、10、15、20、25、30 min)，将孵育不同时间后的几丁质酶液与底物混匀，并置于最适温度下反应10 min，检测其剩余酶活力。将最高酶活力设为100%，从而计算在最适温度下孵育不同时间后的相对酶活力，并绘制相应曲线。利用GraphPad 9软件计算其t1/2。
1.6.4 CaChi18B_ΔChBD1对化学试剂的耐受性向反应体系中分别加入终浓度5 mmol·L-1的NiCl2、NaCl、CoCl2、FeCl3、KCl、CuCl2、MgCl2、CaCl2、BaCl2、NH4Cl、ZnCl2、MnCl2、LiCl，置于最适反应条件下反应10 min，测定酶活力，以未添加任何化学试剂的几丁质酶酶活力为100%，计算相对酶活力，从而得出上述试剂对CaChi18B_ΔChBD1活性的影响。
向反应体系中加入终浓度为5%的尿素、EDTA、Tris、SDS、甲酸、三氯甲烷、甘油、吐温-20、吐温-80、乙酸乙酯、乙腈、甲醇、乙醇，在最适反应条件下检测酶活力。以未添加任何化学试剂的几丁质酶酶活力为100%，计算相对酶活力，以检测上述试剂对CaChi18B_ΔChBD1活性的影响。
1.6.5 CaChi18B_ΔChBD1的底物特异性和动力学参数的测定为评估酶对不同底物的催化效率，分别选用浓度为2%的α-几丁质、β-几丁质、微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、壳聚糖和胶体几丁质作为底物，按照1.5节步骤测定酶对每种底物的催化活性。将酶活力最高的底物所对应的酶活力设为100%，并以此计算其他底物相对于该最适底物的相对酶活力。
在CaChi18B_ΔChBD1的最适温度和pH值条件下，将浓度为0.1%至5%的胶体几丁质与几丁质酶液混合均匀并反应5 min，检测酶活力，并以最高酶活力为100%，计算相对酶活力。利用GraphPad 9软件进行动力学参数分析，计算出米氏常数(Km)、最大反应速率(Vmax)、转换频率(kcat)。
1.7 酶解产物分析将2 mL胶体几丁质和1 mL几丁质酶液混合均匀，30 ℃下分别反应1、3、6、12、24 h，反应后在沸水浴中灭活10 min，随后自然冷却至室温。将反应混合物在12 000 r·min-1下离心5 min，所获得的上清液即为酶催化反应的产物。采用UltiMate 3000系列高效液相色谱(HPLC)系统对酶催化反应产物进行分析，色谱条件如下：Luna® 5 μm NH2色谱柱(250 mm× 4.6 mm)，示差折光检测器(RID)，流动相为70%乙腈，流速0.5 mL·min-1。
1.8 分子对接采用AlphaFold2[21]预测CaChi18B催化域的蛋白质三维结构模型，并使用AutoDock4[22]进行分子对接。从来源于Vibrio harveyi的几丁质酶Chitinase A (PDB ID：3B9A)的晶体结构中获取乙酰壳六糖三维分子结构[23]，并将其和CaChi18B催化结构域的三维立体结构进行分子对接模拟。采用PyMOL(The PyMOL Molecular Graphics System, Version 3.0;Schrödinger, LLC)对CaChi18B催化结构域和乙酰壳六糖对接的三维结构进行可视化分析。
1.9 数据处理所有定量实验(包括酶活力测定、动力学分析、pH稳定性和温度稳定性实验)均独立重复3次，数据以平均值±标准差呈现；分子对接分析基于最优构象进行；酶解产物分析通过3次技术重复验证。使用Origin 2021软件和GraphPad 9软件进行数据分析并作图。
2 结果与分析 2.1 CaChi18B的生物信息学分析对CaChi18B进行生物信息学分析[图 1(a)]。全长的CaChi18B包含信号肽(位于第1-19位氨基酸之间)、两个几丁质结合结构域(ChBD)和1个催化结构域(CD)，其中ChBD1位于第20-68位氨基酸之间，ChBD2位于第114-157位氨基酸之间，CD位于第233-647位氨基酸之间。基于此结构特征，构建了截短突变体CaChi18B_ΔChBD1[图 1(a)]，该突变体截短ChBD1结构域及相邻的连接区(第20-113位氨基酸)。
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| 图 1 CaChi18B及其截短突变体的序列分析 Fig. 1 Sequence analysis of CaChi18B and its truncated mutant |
对催化结构域的氨基酸序列进行分析[图 1(b)]，结果显示CaChi18B属于GH18。通过系统发育树进一步分析显示，CaChi18B与来自Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1(ATN39892.1)的几丁质酶同源度最高[24]，其次是与来源于同一菌株CSC-1的另一几丁质酶CaChi18A[11]的亲缘关系最为接近。
CaChi18B基因全长编码开放阅读框(ORF)为1 926 bp，编码642个氨基酸；CaChi18B理论分子量为70.68 kDa，理论等电点(pI)为4.85。截短突变体CaChi18B_ΔChBD1的ORF为1 644 bp，编码548个氨基酸，CaChi18B_ΔChBD1理论分子量为59.16 kDa，理论等电点为4.92(表 2)。
| 酶Enzyme | 氨基酸位点Amino acid position | 分子量/kDaMolecular mass/kDa | 等电点Isoelectric point (pI) |
| CaChi18B | 20-662 | 70.68 | 4.85 |
| CaChi18B_ΔChBD1 | 114-662 | 59.16 | 4.92 |
2.2 几丁质酶的纯化
通过SDS-PAGE分析发现，CaChi18B主要以包涵体的形式存在，因此选择CaChi18B_ΔChBD1进行纯化分析(图 2)。利用镍亲和层析法对CaChi18B_ΔChBD1进行纯化，SDS-PAGE分析显示重组蛋白为单一条带(图 3)，其分子量约为60 kDa，与理论分子量一致。CaChi18B_ΔChBD1纯化倍数为66.3，回收率为54.68%，比活力为3.05 U·mg-1(表 3)。由此可见，重组酶CaChi18B_ΔChBD1能够满足下一步酶学性质研究的需求。
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| M: molecular mass markers (15-150 kDa)；1：cell lysates of CaChi18B；2：the crude enzyme in the supernatant of lysates of CaChi18B；3：precipitation of CaChi18B；4：cell lysates of CaChi18B_ΔChBD1；5：the crude enzyme in the supernatant of lysates of CaChi18B_ΔChBD1；6：precipitation of CaChi18B_ΔChBD1 图 2 CaChi18B和CaChi18B_ΔChBD1的SDS-PAGE分析 Fig. 2 SDS-PAGE analysis of CaChi18B and CaChi18B_ΔChBD1 |
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| M：molecular mass markers (15-150 kDa)；1：purified CaChi18B_ΔChBD1 图 3 纯化CaChi18B_ΔChBD1的SDS-PAGE分析 Fig. 3 SDS-PAGE analysis of purified CaChi18B_Δ ChBD1 |
| 纯化步骤Purification step | 总酶活力/UTotal enzyme activity/U | 总蛋白/mgTotal protein/mg | 比活力/(U·mg-1)Specific activity/(U·mg-1) | 纯化倍数Purification factor | 回收率/%Recovery yield/% |
| Crude enzyme | 47.86 | 1 040.58 | 0.046 | 1.0 | 100.00 |
| Ni-NTA-chromatography | 26.17 | 8.58 | 3.050 | 66.3 | 54.68 |
2.3 温度对CaChi18B_ΔChBD1的影响
如图 4(a)所示，CaChi18B_ΔChBD1的最适作用温度为50 ℃。CaChi18B_ΔChBD1在0-40 ℃内表现出较高的稳定性，其酶活力能够稳定维持在初始酶活力的80%及以上。当孵育温度提升至45 ℃时，尽管酶活力略有所降低，但是仍能保留75%以上的活性。经50 ℃孵育30 min后，该酶相对活力显著降低至初始值的20%左右，表明其在此温度下的热稳定性明显降低。尤为显著的是，当孵育温度达到60 ℃和70 ℃时，经过30 min的孵育，CaChi18B_ΔChBD1几乎完全失活[图 4(b)]。因此，在50 ℃下进一步对CaChi18B_ΔChBD1的热稳定性进行分析，发现其t1/2为19.19 min[图 4(c)]。
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| 图 4 温度对CaChi18B_ΔChBD1活性和稳定性的影响 Fig. 4 Effects of temperature on the activity and stability of CaChi18B_ΔChBD1 |
2.4 CaChi18B_ΔChBD1的最适pH值及pH稳定性
由图 5(a)可知，CaChi18B_ΔChBD1最适pH值为7，这一特征与多数细菌来源几丁质酶的催化特性一致[25]。在很宽的pH值(3-11)条件下，CaChi18B_ΔChBD1仍保持约50%的酶活力[图 5(b)]，展现出良好的酸碱耐受性，尤其在酸性条件下活力仍能维持较高水平。
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| 图 5 pH值对CaChi18B_ΔChBD1活性及稳定性的影响 Fig. 5 Effects of pH value on the activity and stability of CaChi18B_ΔChBD1 |
2.5 CaChi18B_ΔChBD1的底物特异性和动力学参数
如图 6所示，CaChi18B_ΔChBD1对胶体几丁质展现出最优的水解能力，其次依次为β-几丁质和α-几丁质，表现出一定的水解活性；对羧甲基纤维素钠和壳聚糖的水解能力则相对较低，其相对酶活力仅分别为胶体几丁质水解酶活力的2%和5%，显示出CaChi18B_ΔChBD1在底物上的偏好性。另外，未检测到该酶对微晶纤维素和磷酸溶胀纤维素的水解活性，进一步证实了其在底物上的选择性。
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| 图 6 CaChi18B_ΔChBD1的底物特异性 Fig. 6 Substrate specificity of CaChi18B_ΔChBD1 |
在CaChi18B_ΔChBD1的最适温度和pH值下，以不同浓度的胶体几丁质为底物进行酶活力测定，可知CaChi18B_ΔChBD1对胶体几丁质的Km值为0.662 6 mg·mL-1，Vmax为1.104 μmol·L-1·min-1·mg-1(图 7)，kcat为11.04 s-1，催化效率kcat /Km为16.661 6。该酶对胶体几丁质的Km值较低，可见其对胶体几丁质的亲和力较高。综上所述，CaChi18B_ΔChBD1不仅与胶体几丁质紧密结合，而且能够迅速且有效地催化其水解。
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| 图 7 CaChi18B_ΔChBD1的Km和Vmax Fig. 7 Km and Vmax of CaChi18B_ΔChBD1 |
2.6 CaChi18B_ΔChBD1对化学试剂的耐受性
检测不同化学试剂对CaChi18B_ΔChBD1酶活力的影响，结果发现Li+可提高CaChi18B_ΔChBD1的酶活性；而Cu2+会对其酶活力产生明显的抑制作用，在添加终浓度为5 mmol·L-1时，其酶活力仅保留10%左右[图 8(a)]。此外，甘油、乙酸乙酯、乙腈和乙醇对该酶活性也有促进作用，而SDS和甲酸则表现出明显的抑制作用[图 8(b)]。
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| 图 8 化学试剂对CaChi18B_ΔChBD1的影响 Fig. 8 Effect of chemical reagents on CaChi18B_ΔChBD1 |
2.7 CaChi18B_ΔChBD1的酶解产物分析
通过HPLC对CaChi18B_ΔChBD1的酶解产物进行分析，发现在酶解前期，反应体系主要产生几丁二糖，说明CaChi18B_ΔChBD1具有几丁二糖外切酶的活性；随着反应的进行，GlcNAc的含量逐渐升高，说明CaChi18B_ΔChBD1同时具有β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的活性(图 9)。
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| Standard: reference standard; 1 h: hydrolysis products after 1 h enzymatic reaction; Other labels indicate hydrolysis products at corresponding time points. 图 9 CaChi18B_ΔChBD1的酶解产物分析 Fig. 9 Analysis of hydrolysis products of CaChi18B_ΔChBD1 |
2.8 三维结构预测及分子对接
利用AlphaFold2[21]对CaCh18B催化结构域进行三维结构预测，结果显示CaCh18B的催化结构域呈现出经典的(β/α)8 TIM桶状结构，由8个α螺旋和8个β折叠并经无规则卷曲(Loop)区域紧密相连组成。尤为引人注目的是，在序列第554位至618位氨基酸之间(即Phe554至Tyr618)存在一个插入结构域(图 10)，这一特征明确地提示CaCh18B几丁质酶属于GH18中的A亚家族。进一步分析显示，2个关键氨基酸残基(W74和W93)位于催化裂隙入口处，它们共同构成了一个延伸的表面。此外，催化结构域内还包含了一个高度保守的基序，由D175、D177和E179这3个氨基酸残基组成，这一基序对几丁质酶的催化活性至关重要。为深入探究CaChi18B与底物的相互作用机制，进一步进行分子对接模拟，将乙酰壳六糖作为底物对接至CaChi18B的底物裂隙中。如图 10(a)所示，可以清晰地观察到乙酰壳六糖分子被嵌入到裂隙内。通过分子对接分析，预测到催化残基E179位于亚位点-1与亚位点+1之间的糖苷键附近[图 10(b)]，这一位置对参与水解反应、断裂糖苷键至关重要。
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| 图 10 CaChi18B催化结构域的三维结构及其分子对接 Fig. 10 3D structural diagram of CaChi18B catalytic domain and its molecular docking |
3 讨论
本研究通过镍亲和层析法获得了重组几丁质酶CaChi18B_ΔChBD1纯酶，其最适反应温度为50 ℃，最适pH值为7，这与已有文献中报道的大多数几丁质酶的最适温度及pH值相近。例如，来源于V.harveyi的几丁质酶VhChit2和VhChit6的最适温度均为50 ℃，最适pH值为7.0[26]；来自Chitinilyticum meiyuanensis的几丁质酶CmChi3的最适温度为50 ℃，最适pH值为6.0[27]。CaChi18B_ΔChBD1展现出优良的温度稳定性和pH稳定性。在0-45 ℃下孵育30 min后，该酶仍能保持约80%的相对酶活力，其温度稳定性优于大多数已报道的几丁质酶，例如来自Pseudoalteromonas sp.DL-6的几丁质酶ChiA在45 ℃孵育30 min后，酶活力仅剩余40%[28]；而来自Trichoderma gamsii R1的几丁质酶ChiTg在45 ℃孵育30 min后，其酶活力也仅剩45%[29]。另外，大多数几丁质酶在中性pH条件下表现出较好的稳定性。例如，来自Chitinilyticum meiyuanensis的几丁质酶CmChi3，在以pH值为5-8的胶体几丁质作为底物时，可保持60%以上的相对酶活力[27]，而来自Shewanella khirikhana JW44的几丁质酶SkChi65在以pH值为5-8的胶体几丁质作为底物时，也保留了55%的相对酶活力[30]。在以pH值为3-11的胶体几丁质作为底物时，CaChi18B_ΔChBD1的相对酶活力仍维持在50%以上，表明其具有较高的pH耐受性。在化学试剂耐受性实验中，SDS和Cu2+对CaChi18B_ΔChBD1有明显的抑制作用。Cu2+是大多数细菌来源几丁质酶的抑制剂[31-33]。最近的研究表明，Cu2+可能与几丁质酶活性位点的半胱氨酸残基的硫醇基团配位，导致酶构象变化和酶活性受损[33]。而SDS为表面活性剂，它会破坏蛋白质的结构，使其变性。CaChi18B_ΔChBD1对胶体几丁质的水解能力最好，其次依次为β-几丁质和α-几丁质，这与其他来源的几丁质酶相似。例如，来自Serratia marcescens的rCHI-2[34]和来自Paenicibacillus barengoltzii的PbChi67[35]对胶体几丁质的水解活性均较好，这与胶体几丁质结构较为疏松有密切关系。CaChi18B_ΔChBD1对胶体几丁质的Km值为0.662 6 mg·mL-1，与同样来源于Chitinilyticum aquatile CSC-1的几丁质酶CaChi18A(其Km值为0.94[11])相比，CaChi18B_ΔChBD1的Km值较小，对底物的亲和力更高。
通过序列比对发现，CaChi18B与来源于Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1的几丁质酶CmChi1 (NCBI登录号：ATN39892.1)的相似性最高[24]，序列一致性达到64.53%；其次是与同源菌株来源的双功能几丁质酶CaChi18A的相似性为61.67%[11]。由于CmChi1和CaChi18A均具有几丁二糖外切酶和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的活性，因此推测CaChi18B可能也是一种双功能酶。本研究通过HPLC检测其水解产物，发现CaChi18B_ΔChBD1水解胶体几丁质初期产物主要为几丁二糖，随着反应的进行，GlcNAc生成量逐渐增多，最终产物为GlcNAc。这一实验结果验证了CaChi18B_ΔChBD1确实具有几丁二糖外切酶和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的双功能活性。
CaChi18B_ΔChBD1具有GH18保守催化序列DxxDxDxE，同时展现出典型的GH18 A亚家族几丁质酶的结构特征。对GH18 A亚家族酶的研究表明[36]，催化裂隙入口处保守的暴露芳香族残基在水解几丁质链中起关键作用，它可以引导底物进入活性位点。CaChi18B催化裂隙入口处的芳香族残基W74和W93，与来自Bacillus thuringiensis[37]和V.harveyi[23]的几丁质酶中相应残基具有相似功能，可以引导底物进入活性位点。残基W74和W93位于CaChi18B催化裂隙入口处的延伸表面，表明该几丁质酶作为持续型几丁质酶，可以从几丁质的还原端开始水解，主要在+1和+2亚位点释放双糖和单糖，这与本实验产物分析结果一致，表明对CaChi18B来说，与亚位点+1和+2共价结合的残基分别为W123和W260。
4 结论本研究成功克隆和表达了来自Chitinilyticum aquatile CSC-1的新颖几丁质酶基因CaChi18B及其截短突变体CaChi18B_ΔChBD1，且经镍亲和层析法获得了重组几丁质酶CaChi18B_ΔChBD1，该酶在降解几丁质过程中具有良好的环境耐受性和水解能力。特别的是，序列分析与水解产物鉴定证实CaChi18B_ΔChBD1兼具几丁二糖外切酶与β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶双重功能，可直接催化几丁质转化为β-N-乙酰氨基葡萄糖。上述发现为开发高效几丁质生物转化工艺提供了新型酶制剂，下一步可通过蛋白质工程手段优化CaChi18B_ΔChBD1的热稳定性，以提升其对海洋甲壳类废弃物的降解效率，为其资源化利用提供理论支撑与技术基础。
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