2. 桂林医学院智能医学与生物技术学院, 广西桂林 541004;
3. 广西医科大学基础医学院, 广西南宁 530021
2. School of Intelligent Medicine and Biotechnology, Guilin Medical University, Guilin, Guangxi, 541004, China;
3. School of Basic Medical Sciences, Guangxi Medical University, Nanning, Guangxi, 530021, China
前列腺癌(Prostate Cancer，PCa)是全球男性第二常见的恶性肿瘤，也是男性因癌症死亡的主要原因[1]。近年来，我国前列腺癌发病率明显增加，是男性泌尿系统中发病率增长最快的恶性肿瘤[2]。雄激素剥夺疗法(Androgen Deprivation Therapy，ADT)是治疗晚期PCa患者的基本方法，但研究证实几乎所有的PCa患者都会对雄激素阻断产生耐药性，发展为去势抵抗性前列腺癌(Castration-Resistant Prostate Cancer，CRPC)[3]，发生转移的CRPC(Metastatic Castration-Resistant Prostate Cancer，mCRPC)患者的中位生存期仅为16-24个月[4]，目前尚无有效治疗mCRPC的药物[5]。现有用于治疗mCRPC的药物主要为雄激素受体靶向药物，如阿比特龙及恩杂鲁胺，但约20%的mCRPC患者会出现原发性耐药，导致治疗缓解期短[6]，因此亟需研发治疗mCRPC的新兴药物。
中医药能够改善中晚期肿瘤患者的临床症状，稳定肿瘤病灶及提高患者生存质量[7]。有研究表明，中医药在治疗PCa及改善患者生存质量方面具有独特的优势[8]。据报道，女贞子(Ligustrum lucidum)-黄芪(Astragalus membranaceus)在乳腺癌保乳术后调强放射治疗及胃癌辅助治疗中起重要作用，可以明显改善患者的生活质量，降低放疗与化疗的毒副作用，提高患者生存率[9, 10]。但女贞子-黄芪是否可以作为治疗mCRPC的潜在药物，目前尚无相关研究报道。本研究拟利用网络药理学方法，对女贞子-黄芪治疗mCRPC的作用靶点与潜在机制进行探讨，为mCRPC药物研发提供参考。
1 材料与方法 1.1 活性成分及作用靶点筛选基于中药系统药理学(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP) 数据库与分析平台，以口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%和类药性(Drug-Like，DL)≥0.18为标准[11]，筛选女贞子-黄芪的活性成分及作用靶点。
1.2 mCRPC相关的差异表达基因分析从GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载芯片数据集GSE77930表达谱数据及相应的临床信息，该芯片数据集包含171个样本，其中CRPC样本22个，mCRPC样本149个。利用limma包对数据进行分析，以差异倍数的绝对值(|Fold Change，FC|)≥1.5倍，且P＜0.05为标准[12]，筛选mCRPC与CRPC之间差异表达的基因，并绘制热图及火山图。
1.3 女贞子-黄芪活性成分-药物靶点网络的构建对筛选得到的女贞子-黄芪作用靶点和mCRPC相关的差异表达基因取交集，获得女贞子-黄芪治疗mCRPC的潜在作用靶点，利用Cytoscape 3.8.0软件构建女贞子-黄芪活性成分-mCRPC作用靶点网络。利用Cytoscape 3.8.0软件中Bisogenet和CytoNCA插件，选取HRPD、BIND、DIP、BIOGRID、INTACT和MINT 6个数据库，构建女贞子-黄芪活性成分与mCRPC靶点的蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-Protein Interaction，PPI) 网络。以度中心性(Degree Centrality，DC)>61，介数中心性(Betweenness Centrality，BC)>600为标准[13]，筛选核心网络。
1.4 核心靶点GO富集分析将筛选得到的交集靶点导入clusterProfiler包，进行GO富集分析，包括分子功能(Molecular Function，MF)、生物过程(Biological Process，BP)和细胞组分(Cellular Component，CC)3个方面[14]。
1.5 KEGG分析及靶点-通路网络构建使用R语言，根据基因富集的数量和显著性，将富集得到信号通路结果导入Cytoscape 3.8.0软件，根据度值(Degree)的大小进行排序，显示前20条通路。利用Perl 5.30.0和Cytoscape 3.8.0构建靶点-通路网络[15]，进一步分析女贞子-黄芪治疗mCRPC的核心靶点与信号通路。
2 结果与分析 2.1 女贞子-黄芪的活性成分及作用靶点在TCMSP数据库与分析平台中，依据OB≥30% 和DL≥0.18筛选女贞子和黄芪的活性成分及作用靶点，获得女贞子的活性成分13个、黄芪的活性成分20个，包括槲皮素(Quercetin)、山奈酚(Kaempferol)、木犀草素(Luteolin)、异鼠李素(Isorhamnetin)、芒柄花黄素(Formononetin)、圣草酚(Eriodictyol)和女贞果苷D (Lucidumoside D)等，其中山奈酚和槲皮素是女贞子和黄芪两种中药共有的活性成分(表 1)。女贞子作用靶点1 025个，黄芪作用靶点968个。
| 药物 Drug |
分子编号 Molecular ID |
名称 Name |
口服生物利用度 (OB)/% Oral Bioavailability (OB)/% |
类药性(DL) Drug-Like (DL) |
| A.membranaceus | MOL000211 | Mairin | 55.38 | 0.78 |
| A.membranaceus | MOL000239 | Jaranol | 50.83 | 0.29 |
| A.membranaceus | MOL000296 | Hederagenin | 36.91 | 0.75 |
| A.membranaceus | MOL000033 | (3S, 8S, 9S, 10R, 13R, 14S, 17R)-10, 13-dimethyl-17-[(2R, 5S)-5-propan-2-yloctan-2-yl]-2, 3, 4, 7, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 16, 17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol | 36.23 | 0.78 |
| A.membranaceus | MOL000354 | Isorhamnetin | 49.60 | 0.31 |
| A.membranaceus | MOL000371 | 3, 9-di-O-methylnissolin | 53.74 | 0.48 |
| A.membranaceus | MOL000374 | 5′-hydroxyiso-muronulatol-2′, 5′-di-O-glucoside | 41.72 | 0.69 |
| A.membranaceus | MOL000378 | 7-O-methylisomucronulatol | 74.69 | 0.30 |
| A.membranaceus | MOL000379 | 9, 10-dimethoxypterocarpan-3-O-β-D-glucoside | 36.74 | 0.92 |
| A.membranaceus | MOL000380 | (6aR, 11aR)-9, 10-dimethoxy-6a, 11a-dihydro-6H-benzofurano[3, 2-c] chromen-3-ol | 64.26 | 0.42 |
| A.membranaceus | MOL000387 | Bifendate | 31.10 | 0.67 |
| A.membranaceus | MOL000392 | Formononetin | 69.67 | 0.21 |
| A.membranaceus | MOL000398 | Isoflavanone | 109.99 | 0.30 |
| A.membranaceus | MOL000417 | Calycosin | 47.75 | 0.24 |
| A.membranaceus | MOL000422 | Kaempferol | 41.88 | 0.24 |
| A.membranaceus | MOL000433 | Folic acid | 68.96 | 0.71 |
| A.membranaceus | MOL000438 | (3R)-3-(2-hydroxy-3, 4-dimethoxyphenyl) chroman-7-ol | 67.67 | 0.26 |
| A.membranaceus | MOL000439 | Isomucronulatol-7, 2′-di-O-glucosiole | 49.28 | 0.62 |
| A.membranaceus | MOL000442 | 1, 7-dihydroxy-3, 9-dimethoxy pterocarpene | 39.05 | 0.48 |
| A.membranaceus | MOL000098 | Quercetin | 46.43 | 0.28 |
| L.lucidum | MOL000358 | β-sitosterol | 36.91 | 0.75 |
| L.lucidum | MOL000422 | Kaempferol | 41.88 | 0.24 |
| L.lucidum | MOL004576 | Taxifolin | 57.84 | 0.27 |
| L.lucidum | MOL005146 | Lucidumoside D | 48.87 | 0.71 |
| L.lucidum | MOL005147 | Lucidumoside D_qt | 54.41 | 0.47 |
| L.lucidum | MOL005169 | (20S)-24-ene-3β, 20-diol-3-acetate | 40.23 | 0.82 |
| L.lucidum | MOL005190 | Eriodictyol | 71.79 | 0.24 |
| L.lucidum | MOL005195 | Syringaresinol diglucoside_qt | 83.12 | 0.80 |
| L.lucidum | MOL005209 | Lucidusculine | 30.11 | 0.75 |
| L.lucidum | MOL005211 | Olitoriside | 65.45 | 0.23 |
| L.lucidum | MOL005212 | Olitoriside_qt | 103.23 | 0.78 |
| L.lucidum | MOL000006 | Luteolin | 36.16 | 0.25 |
| L.lucidum | MOL000098 | Quercetin | 46.43 | 0.28 |
2.2 mCRPC相关的差异表达基因
与未发生转移的CRPC相比，在mCRPC患者中差异表达的基因一共有1 067个，其中表达上调的基因424个，表达下调的基因643个(图 1)。
|
| 图 1 mCRPC相关的差异表达基因 Fig. 1 Differentially expressed genes associated with mCRPC |
2.3 女贞子-黄芪活性成分-mCRPC作用靶点网络
按不同靶点对应有效成分的数目分类展示，共获得女贞子-黄芪治疗mCRPC的潜在作用靶点18个(图 2)。对应的女贞子-黄芪有效成分11个(图 3，其中绿色表示女贞子的有效成分，黄色表示黄芪的有效成分，红色为女贞子-黄芪两者共有的有效成分，蓝色表示靶点基因)，槲皮素的作用靶点最多，为15个；β-谷甾醇、圣草酚和女贞果苷D(苷元)的作用靶点最少，只有1个作用靶点。
|
| 图 2 女贞子-黄芪治疗mCRPC的靶点韦恩图 Fig. 2 Venn diagram of targets for L.lucidum-A.membranaceus in the treatment of mCRPC |
|
| 图 3 女贞子-黄芪的活性成分与关键作用靶点网络 Fig. 3 Active ingredients and key target networks of L.lucidum-A.membranaceus |
2.4 女贞子-黄芪治疗mCRPC的作用靶点PPI网络
将女贞子-黄芪作用靶点与mCRPC相关的差异基因取交集后，利用Cytoscape 3.8.0中的Bisogenet插件绘制PPI网络图，得到一个由1 629个节点和40 875条边组成的网络(图 4)。在此网络图的基础上，利用Bisogenet和CytoNCA插件，以DC>61作为初级筛选条件，获得一个由435个节点和17 187条边组成的网络[图 5(a)中的黄色色块，即图 5(b)]。将BC>600作为第二次筛选条件，最终得到一个由64个节点和941条边组成的核心网络[图 5(b)中的黄色色块，即图 5(c)]，主要包括雄激素受体(Androgen Receptor，AR)、增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA)和血管细胞黏附因子(Vascular Cell Adhesion Molecule 1，VCAM1)等关键靶点(图 5中的红色色块)。
|
| 图 4 女贞子-黄芪治疗mCRPC的作用靶点PPI网络 Fig. 4 PPI network of targets by L.lucidum-A.membranaceus in the treatment of mCRPC |
|
| 图 5 PPI网络拓扑图 Fig. 5 Network topology map of PPI |
2.5 作用靶点GO富集分析
利用R语言对女贞子-黄芪治疗mCRPC的核心靶点进行GO富集分析，共得到GO条目82个。BP条目75个，主要参与酮体反应(Response to ketone)、对金属离子的反应(Response to metal ion)、伤口愈合(Wound healing)等生物学过程[图 6(a)]。CC条目4个，主要富集在核染色体(Nuclear chromosome)、染色体区(Chromosomal region)、凝集的染色体(Condensed chromosome)和复制叉处(Replication fork)[图 6(b)]。MF条目3个，涉及氧化还原酶活性(Oxidoreductase activity)和组蛋白激酶活性(Histone kinase activity)[图 6(c)]，提示女贞子-黄芪可能通过调节多种生物学过程发挥其治疗mCRPC的功效。
|
| 图 6 核心靶点GO富集分析 Fig. 6 GO enrichment analysis for key targets |
2.6 KEGG信号通路与核心靶点互作网络
KEGG分析结果表明，女贞子-黄芪治疗mCRPC的作用靶点主要涉及乙型肝炎(Hepatitis B)、前列腺癌、细胞周期(Cell cycle)、Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)信号通路(VEGF signaling pathway)和细胞衰老(Cellular senescence)等通路(图 7)。对获得的信号通路和作用靶点构建相互作用网络，结果发现，PRKCA、E2F1、E2F2和PPP3CA等核心靶点与多条信号通路密切相关，分别涉及了14、12、11及7个信号通路(图 8)，提示女贞子-黄芪可能通过多种有效成分作用于多个靶点，通过多个信号通路发挥其治疗mCRPC的作用。
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| 图 7 靶点的KEGG分析 Fig. 7 KEGG analysis for key targets |
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| 图 8 KEGG信号通路与核心靶点相互作用网络 Fig. 8 Interaction network between KEGG signaling pathways and key targets |
3 讨论
网络药理学基于系统生物学和大数据分析，通过构建药物-靶点-疾病网络，探索药物发挥作用的机制，为中医药的现代化研究提供了新途径和新依据[16]。本研究将GEO芯片数据挖掘与网络药理学相结合，探讨女贞子-黄芪治疗mCRPC的作用靶点及潜在作用机制，结果发现女贞子-黄芪的有效成分包括槲皮素、山奈酚、木犀草素、异鼠李素和芒柄花黄素等，其中槲皮素在拓扑网络中的度值较大，作用靶点最多。有研究报道，槲皮素在体外可抑制前列腺癌、宫颈癌、乳腺癌、肝癌、肺癌以及食管癌等多种肿瘤细胞的增殖与转移，诱导肿瘤细胞凋亡[17]。因此，槲皮素可能是女贞子-黄芪治疗mCRPC的核心成分。
通过构建蛋白互作拓扑网络图，可知女贞子-黄芪治疗mCRPC的18个潜在作用靶点中，在PPI网络发挥关键调控作用的靶点为AR、PCNA和VCAM1。Qiu等[18]研究证实，AR在PCa的发展、进展和转移中起着重要作用。PCNA是细胞增殖的标志物，其表达上调与肿瘤细胞的恶性增殖密切相关[19]。Juríková等[20]研究报道，PCNA高表达增加乳腺癌细胞的迁移和侵袭的危险性。Huang等[21]发现，VCAM1高表达与高级别浆液性卵巢癌的发生和预后不良密切相关。Ding等[22]发现VCAM1与肿瘤血管生成密切相关，胃癌中VCAM1阳性组织的微血管密度高于VCAM1阴性组织。Zhang等[23]报道，VCAM1高表达促进结直肠癌细胞的侵袭和转移。上述研究结果证实, AR、PCNA、VCAM1与肿瘤的发生、进展密切相关，表明女贞子-黄芪可能通过靶向mCRPC关键基因发挥治疗作用。
对女贞子-黄芪治疗mCRPC的作用靶点进行KEGG分析发现，作用靶点主要富集在乙型肝炎、前列腺癌、细胞周期、VEGF信号通路和细胞衰老等通路。Krystyna等[24]研究报道，有肝炎的男性患前列腺癌风险显著增加。Sarkar等[25]发现，乙型肝炎病毒感染与前列腺癌的发展有密切的关系，乙型肝炎病毒能促进AR信号传递。闫浩等[26]发现，前列腺癌信号通路激活能够促进AR靶基因的转录，促进细胞的增殖和转移。Ghafouri-Fard等[27]认为，槲皮素通过调节p21 CDK抑制剂和抑制pRb磷酸化，抑制细胞增殖。另外，槲皮素可通过靶向VEGFR-2介导的血管生成途径，抑制下游调节因子AKT的表达，从而抑制肿瘤生长[28, 29]。这些研究提示女贞子-黄芪可能通过调控以上信号通路发挥其治疗mCRPC的作用，表明女贞子-黄芪在治疗mCRPC方面极具潜力，但结果仍需进一步的实验验证。
4 结论槲皮素、山奈酚、木犀草素、异鼠李素和芒柄花黄素等成分可能是女贞子-黄芪治疗mCRPC的重要药效物质。女贞子-黄芪可能通过影响与mCRPC相关的多个信号通路发挥其治疗mCRPC的作用。本研究利用GEO芯片数据挖掘与网络药理学相结合的方法系统探讨女贞子-黄芪治疗mCRPC的作用机制，为临床应用提供了一定的依据，但本研究中只纳入一个mCRPC数据集进行分析，研究结果还有待进一步证实。
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