近年来，工农业生产、人类活动和红壤自身发育等情况致使土壤的酸化不断加剧，使得植物遭受低磷和酸铝胁迫^[1]。植物出现缺磷现象是由于在酸性环境下植物可吸收利用的有效磷被铁、铝氧化物等固定成磷酸化合物，而且溶解度低，再加上磷易随土壤水运动而流失，导致环境中的有效磷不足以支撑植物的正常生长发育^[2]。同时，酸性土壤还会引起铝的活化，当土壤pH值＜5时，铝易被活化成Al³⁺，该形态铝极具植物毒性^[3]。我国南方各省区土壤主要为低磷酸铝红壤，土壤酸化日益严重，致使磷元素流失并加剧植物铝毒害程度，导致作物品质和产量下降，经济效益严重下滑^[4]。马尾松(Pinus massoniana Lamb.)是我国南方重要工业用材树种，具有生长快、用途广、蓄积量大等优良特点^{[5, 6]}。但南方土壤普遍为低磷酸铝红壤，是影响马尾松林生长、导致马尾松大面积衰退和减产的主要原因^{[7, 8]}。因此，研究磷铝胁迫下马尾松的生长变异情况，筛选出耐低磷酸铝特性的马尾松优良家系，提高马尾松的耐低磷酸铝能力，增加马尾松人工林的经济效益，已成为亟需解决的科学问题。

低磷条件下杉木(Cunninghamia lanceolata)、油茶(Camellia oleifera)和玉米(Zea mays)根的活力显著下降，根系的吸收能力减弱，植物生长发育受到限制，导致植株生长缓慢、矮小，根系发育差等，充足的磷营养可增强植物对外界不利环境条件的抵抗能力^[9-19]。高浓度铝对杉木、油茶和玉米均具有较强毒性，其通过抑制植物根、茎生长，致使根系坏死，减少根系对养分的吸收利用，从而减少植物的干物质积累^[20-26]。马尾松的磷铝胁迫研究，多数为低磷或酸铝胁迫下的生长变化规律和优良家系筛选研究，而低磷、酸铝两者耦合胁迫的研究较少，且众多单一低磷或酸铝胁迫研究只停留在种源之间，对高世代尤其是以二代优良家系马尾松作为材料的研究仍有所欠缺^[10-26]。不同种源、种质的马尾松具有丰富的遗传多样性，对低磷酸铝环境的敏感性差异较大，其株高、地径和主根长等各指标都会存在差异，且各指标对植物生长发育的指示作用存在重叠现象^[10-12]。为此，本研究以二代种子园54个优良家系马尾松为材料，采用沙培方式进行酸性环境下不同浓度磷铝胁迫处理，并对各家系的耐低磷酸铝系数进行因子分析；再利用模糊数学中的模糊隶属函数法，计算出可综合评价各家系耐低磷酸铝能力的综合评价值——D值，探明马尾松幼苗在低磷酸铝胁迫下的生长变异规律并筛选出耐低磷酸铝的优良家系马尾松，为其推广应用提供理论基础和优良材料。

1 材料与方法 1.1 材料

试验材料为54个家系马尾松(编号1-55号，其中23号缺失)，种子采自广西壮族自治区国有派阳山林场马尾松二代种子园，于2022年5月初在广西壮族自治区林业科学研究院马尾松良种繁育苗圃(广西南宁)玻璃温室棚中进行试验。选取各家系饱满种子，清洗干净，经灭菌、催芽后于育种盘中发芽。发芽后，将其转移至装有石英砂的无纺纤维布容器中(直径8 cm，高12 cm)，每杯1株，每个家系140株。正常培养30 d，期间每3 d浇灌1次1/5霍格兰氏完全营养液(其配方如表 1所示)，以维持马尾松幼苗正常生长，直至营养液同砂粒接触24 h内pH值基本无变化为止。缓苗14 d后选择各家系生长基本一致的苗木60株进行胁迫试验。

1.2 胁迫试验设计

按家系与磷铝水平两因素设置完全随机区组试验，每个家系分别设置不同磷、铝浓度共4种处理，记为CK、-P、+Al、(-P、+Al)，其中CK为对照，-P为低磷处理，+Al为酸铝处理，(-P、+Al)为低磷酸铝处理，各处理浓度如表 2所示。将KH₂PO₄、AlCl₃和KCl添加至1/5缺磷霍格兰营养液中(稀释5倍且缺KH₂PO₄的霍格兰完全营养液)，为胁迫溶液。每个处理3次重复，每个重复20株幼苗。用KH₂PO₄、AlCl₃控制磷和铝的含量，根据设计分别供给不同水平的磷和铝；用NaOH和HCl调整土壤pH值，使得pH值维持在4.00±0.05水平，每3 d浇胁迫溶液1次，每次200 mL，中间酌情补充水分并适当补充KCl以维持各处理K⁺平衡，处理50 d后采样，测定各指标。

1.3 生长指标的测定

胁迫处理50 d后，用游标卡尺和钢直尺测量每株马尾松幼苗的地径(精确到0.01 mm)、株高和主根长(均精确到0.01 cm)。上述指标测量完成后用自来水不断冲洗沙杯，小心取出整株幼苗并冲洗干净，然后将幼苗分成地下部和地上部，105 ℃杀青5 min后再于65 ℃条件下烘干至恒重，测量各组分(地下部和地上部)的干重(精确到0.001 g)，并计算根冠比(根冠比=地下部干重/地上部干重)。

1.4 数据分析

采用WPS 4.6.1和SPSS 26.0软件进行数据的统计与分析，Origin Pro 2021软件进行作图。

1.4.1 耐低磷酸铝胁迫系数

耐低磷系数^[10]是同一家系同一指标(如株高、地径和主根长等)在低磷处理下的测量值除以对照处理下的测量值所得，可将各指标归一化，使得各指标之间具有可比性。本研究以耐低磷系数为参考，计算各家系马尾松各指标的耐低磷酸铝胁迫系数，并进行相关性分析。耐低磷酸铝胁迫系数计算公式如下：

$ 耐低磷酸铝胁迫系数/ \%=\\\frac{\text { 低磷酸铝处理测定值 }}{\text { 对照处理测定值 }} \times 100 \%。$

1.4.2 隶属函数值

利用马尾松各指标(株高、地径、主根长，地上部干重、地下部干重、单株干重和根冠比)进行耐低磷酸铝特性综合评价。由于指标之间存在正负相关性，且对胁迫所反映出的信息存在重叠现象，利用因子分析可通过降维手段将多个指标归类为几个彼此相对独立的综合指标。本研究将7个指标的耐低磷酸铝胁迫系数进行因子分析，得出主因子及各主因子方差贡献率，并计算各家系马尾松主因子的隶属函数值，算法如下：

$ U\left(C l_i\right)=\frac{C l_i-C l_{\min }}{C l_{\max }-C l_{\min }}, \quad i=1, 2, 3, \cdots, n, $

式中，U(Cl_i)为第i个主因子的隶属函数值，Cl_min、Cl_max分别为所有家系第i个主因子的最小值和最大值。

1.4.3 指标权重

根据因子分析得到各主因子的方差贡献率，计算各家系马尾松不同主因子的指标权重，算法如下：

$ W_i=P_i / \sum\nolimits_{i=1}^n\left|P_i\right|, \quad i=1, 2, 3, \cdots, n, $

式中，W_i表示第i个主因子在所有主因子中的重要程度，即权重；P_i为各家系第i个主因子的贡献率。

1.4.4 综合值D值

根据各家系马尾松各主因子的隶属函数值U(Cl_i)和指标权重值W_i计算综合值D值(D值为各家系马尾松在低磷酸铝胁迫条件下耐低磷酸铝能力的大小，D值越大表示其耐低磷酸铝能力越强，即耐低磷酸铝特性越好)，算法如下：

$ D=\sum\nolimits_{i=1}^n\left[U\left(C l_i\right) \times W_i\right], { }_i=1, 2, 3, \cdots, n。$

2 结果与分析 2.1 磷铝胁迫对不同家系马尾松幼苗生长的影响

如图 1所示，家系、磷铝处理及两者间的交互作用对马尾松幼苗株高、地径和主根长均具有极显著影响(P < 0.001)。马尾松幼苗株高、地径和主根长变异系数为10.96%-14.86%，变异系数平均值大小顺序为主根长(14.44%)>地径(12.33%)>株高(11.23%)。从各生长指标可看出，CK处理下马尾松幼苗长势最好，株高、地径和主根长平均值分别为13.35 cm、1.04 mm和9.80 cm；低磷酸铝胁迫下的长势最差，株高、地径和主根长平均值分别为12.85 cm、1.01 mm和9.43 cm，株高、地径和主根长均受到明显抑制，分别较CK减少了4.00%、3.00%和4.00%；低磷胁迫下的株高、地径和主根长平均值分别为12.95 cm、1.02 mm和9.78 cm，株高和地径的生长受抑制程度较高，分别较CK减少了3.00%、2.00%；酸铝胁迫下的株高、地径和主根长平均值分别为13.17 cm、1.03 mm和9.61 cm，主根的生长受抑制程度较高，较CK减少了2.00%。

2.2 磷铝胁迫对马尾松幼苗干重的影响

如图 2所示，家系对马尾松幼苗地上部干重、地下部干重、单株干重和根冠比均具有极显著影响(P < 0.001)。磷铝处理对马尾松幼苗地下部干重具有非常显著的影响(P < 0.01)，对单株干重具有显著影响(P < 0.05)，但对地上部干重和根冠比无显著影响。马尾松幼苗地上部干重、地下部干重、单株干重和根冠比变异系数为16.06%-35.51%，变异系数平均值大小顺序为地下部干重(32.61%)>单株干重(23.34%)>地上部干重(21.91%)>根冠比(19.45%)。CK处理下马尾松幼苗干物质的积累最多，地上部干重、地下部干重、单株干重和根冠比平均值分别为0.108、0.032、0.140 g和0.296。低磷酸铝胁迫下马尾松幼苗地上部干重、地下部干重、单株干重的积累明显受到抑制，分别较CK减少4.00%、8.00%和5.00%，根冠比较CK减少4.00%；低磷胁迫下，马尾松地上部干重、地下部干重、单株干重的积累所受到的抑制相比低磷酸铝胁迫要轻，分别较CK减少3.00%、6.00%和4.00%，根冠比较CK减少3.00%；酸铝胁迫主要抑制马尾松幼苗地下部干重积累，较CK减少6.00%，根冠比较CK减少5.00%。

2.3 不同家系马尾松耐低磷酸铝特性评价 2.3.1 耐低磷酸铝胁迫系数

如表 3所示，在低磷酸铝胁迫下，不同家系马尾松幼苗的相同指标和同一家系的不同指标的耐低磷酸铝胁迫系数差别较大，且各指标的胁迫系数变化区间各有不同。其中，株高的胁迫系数为0.859-1.082，地径的为0.864-1.067，主根长的为0.850-1.086，地上部干重的为0.736-1.159，地下部干重的为0.574-1.364；单株干重的为0.700-1.138；根冠比的为0.634-1.293。

2.3.2 不同家系马尾松耐低磷酸铝指标的相关性分析

相关性分析(表 4)表明，低磷酸铝胁迫下，株高与根冠比负相关，与主根长、地下部干重正相关，与地径、地上部干重、单株干重极显著正相关；地径与根冠比正相关，与地下部干重显著正相关，与主根长、地上部干重、单株干重极显著正相关；主根长与地上部干重、单株干重正相关，与地下部干重、根冠比显著正相关；地上部干重与根冠比负相关，与地下部干重、单株干重极显著正相关；地下部干重与单株干重、根冠比显著正相关，单株干重与根冠比显著正相关。

2.3.3 不同家系马尾松耐低磷酸铝的因子分析

前3个因子的累计贡献率达到96.62%，可作为有效的数据分析成分，其中载荷的高低反映主因子与各指标的相关程度(表 5)。第1主因子与地上部干重(因子载荷：0.091)、地下部干重(因子载荷：0.071)和单株干重(因子载荷：0.086)相关性相对较大，主要反映各家系马尾松在低磷酸铝胁迫下对物质积累的能力，称为生物量因子；第2主因子与根冠比(因子载荷：0.156)相关性最大，主要反映各家系马尾松为适应低磷酸铝胁迫对地上部和地下部物质积累进行分配，称为调节因子; 第3主因子与主根长(因子载荷：0.060)相关性最大，主要反映各家系马尾松在低磷酸铝胁迫下主根长的生长情况，可称为根长因子。因此，干重、根冠比和主根长可作为马尾松耐低磷酸铝种质的鉴定指标。

2.3.4 不同家系马尾松耐低磷酸铝的隶属函数分析

54个家系马尾松耐低磷酸铝能力的D值为0.155-0.919 (图 3)。排名前3的是17号(D值为0.919)、15号(D值为0.843)和12号(D值为0.752)；排名后3的是25号(D值为0.155)、26号(D值为0.193)和33号(D值为0.241)。由此可知，在实验家系中，17号家系具有最强的耐低磷酸铝能力，其次是15号和12号，而25号家系对低磷酸铝胁迫抗性最弱。

2.3.5 不同家系马尾松耐低磷酸铝特性的系统聚类分析

采用欧式距离对低磷酸铝胁迫下所有家系马尾松的D值进行系统聚类分析(图 4)。在欧氏距离为15时，将54个家系按耐低磷酸铝能力的强弱划分为3类：3号、7号、8号、12号、15号、17号、46号、47号、52号、53号、54号共11个家系具有较强的耐低磷酸铝特性，聚为第一类，属于高抗型；5号、9号、19号、20号、25号、26号、27号、32号、33号、36号、37号、49号共12个家系耐低磷酸铝特性较差，聚为第三类，属于敏感型；其余31个家系耐低磷酸铝能力一般，聚为第二类，属于中等型。

3 讨论 3.1 磷铝胁迫对马尾松幼苗生长的影响

近年来，人类的不合理施肥和工厂的酸性物质排放等行为，致使全球酸性土壤面积不断扩大，给植物带来的低磷和酸铝胁迫现象日益普遍和严重，导致植物减产和品质低下，造成严重的经济损失。作为我国南方重要经济用材之一的马尾松，其林地为富含铁、铝物质的酸性土壤，经常遭受低磷和酸铝的影响^[27]。低磷胁迫下马尾松幼苗的株高和地径生长受到抑制，致使主根伸长，干物质的积累减少^{[14, 26]}；酸铝胁迫抑制马尾松幼苗的生长，致使地径生长，主根的生长受抑制，干物质的积累减少^[23]。从家系、低磷酸铝处理及两者共同作用对马尾松幼苗生长的相互关系结果可以看出，家系本身对马尾松幼苗的胁迫生长影响最大，磷铝处理次之，两者共同作用影响最小。本研究结果与谢钰容^[26]的研究结果一致，低磷胁迫促使马尾松幼苗主根生长，提高了其从外界汲取资源的能力，但抑制了马尾松幼苗地上部干物质积累，致使马尾松幼苗矮小瘦弱；酸铝胁迫抑制了马尾松幼苗主根的生长，造成马尾松矮小干粗，但加强了其地上部干物质的积累；低磷酸铝胁迫使马尾松幼苗矮小瘦弱效果加剧，地上部、地下部和单株干物质积累均受到抑制。

现有研究发现植物受到胁迫时根冠比增大：在受到胁迫时植物会进行适应性生长，将更多的资源运输给根部，增强其对外界资源的汲取能力，因此根冠比得以增大，其生存能力进一步提高^[14]。而与对照相比，本研究中低磷、酸铝和低磷酸铝胁迫的马尾松幼苗根冠比均减小，是否是本研究所采用的胁迫浓度较低或者胁迫时间不够长，导致马尾松幼苗胁迫生长还处于抑制期，还未对胁迫环境做出足够的适应性调节，使得地下部和地上部先后受到抑制，根冠比减小，该现象有待在后续实验中进一步验证。

3.2 耐磷铝胁迫优良家系的评价和筛选

目前，在众多马尾松胁迫研究中缺乏对不同家系耐低磷酸铝能力的评价与筛选。马尾松的抗性评价指标主要是生长指标，但单一生长指标并不能准确反映其耐低磷酸铝胁迫的能力，且生长指标之间存在正负相关性，无法客观准确地评价不同家系马尾松的耐低磷酸铝特性。因此，在一定程度上利用马尾松株高、地径、主根长和干重作为评价和筛选的指标，基于家系的各耐胁迫系数进行因子分析，再利用模糊数学中的模糊隶属函数法，计算出可综合评价各家系的耐低磷酸铝能力的D值，使得各家系耐低磷酸铝特性的差异具有可比性^[10-12]。该方法不仅可以大规模筛选优良家系品种并能节约成本，还能快速有效地分析其在磷铝胁迫下的生长变化^[10]。本研究综合评价54个马尾松家系，将其分为高抗型、中等型和敏感型3类，但本研究仅对马尾松幼苗期的生长指标进行分析和综合评价，并不能代表各家系未来的生长状况，需要在以后的试验中结合生理指标进一步佐证，或者追踪高抗型、中等型和敏感型家系在未来的生长状况，以最终确定各家系的耐低磷酸铝能力。

4 结论

在低磷酸铝胁迫下，马尾松幼苗的各项生长指标均受到抑制，特别是主根的生长发育受影响最大，株高次之，地径最小。低磷胁迫主要抑制马尾松幼苗的株高和地径，使得马尾松幼苗长势特征为体矮径细；酸铝胁迫主要抑制马尾松幼苗的主根长，使得马尾松幼苗长势特征为体矮径粗；低磷酸铝胁迫则使马尾松幼苗体矮径细效果加剧。马尾松幼苗在磷铝胁迫下干物质的积累受到一定的抑制: 低磷胁迫主要抑制马尾松幼苗地下部干物质的积累，地上部干物质积累所受影响次之，造成根冠比减小；酸铝胁迫主要抑制马尾松幼苗地下部的干物质积累，造成根冠比较大幅度减少；低磷酸铝胁迫则使马尾松幼苗地上部和地下部物质积累的抑制加剧，使其根冠比大幅度减小。本研究综合评价54个马尾松家系，将其分为高抗型、中等型和敏感型3类，为今后低磷、酸铝和低磷酸铝家系马尾松推广应用、生理机制解析，以及耐低磷酸铝优良家系的遗传改良提供材料。