结直肠癌(Colorectal Cancer，CRC)是发病率位列全球第三的恶性肿瘤，也是导致癌症相关死亡的第二大原因，且CRC的预后与早期诊断密切相关，多数早期CRC可以治愈，5年生存率可达90%，而晚期CRC生存率则不足10%^[1]。因此，研究CRC癌前病变的发生、发展及其早期诊治，对CRC防治具有重要意义。其中，具有高度恶性潜能的结直肠侧向发育型肿瘤(Laterally Spreading Tumor，LST)逐渐成为研究热点。LST是一类直径大于或等于10 mm，并侧向扩展生长的表浅型病变。根据内镜形态可划分为颗粒型(Granular Type，LST-G)和非颗粒型(Non-Granular Type，LST-NG)，其中颗粒型包括颗粒均一型(Homogeneous Type，LST-GH)和结节混合型(Nodular-Mixed，LST-GM)，非颗粒型包括扁平隆起型(Flat Elevated Type，LST-F)和假凹陷型(Pseudo Depressed Type，LST-D)^{[2, 3]}。

目前关于LST侧向生长和癌变倾向的分子机制尚未明了。有研究提示Wnt信号通路的激活可能与LST的发生、发展相关^[4]，但具体机制尚未阐明，仍需进一步探讨Wnt信号通路对LST的影响。LST作为一种恶变潜能较高的癌前病变，通过研究其发生、发展及恶变的机制，可为结直肠癌的防治提供思路。Wnt信号通路相关分子富含亮氨酸重复序列G蛋白偶联受体5(Leucine-rich repeat-containing G protein-coupled Receptor 5，LGR5)、细胞周期蛋白依赖性激酶5(Cyclin-Dependent Kinase 5，CDK5)和β-连环蛋白(β-catenin)均与肿瘤生物学行为关系紧密，并与多种肿瘤的不良预后有关^[5-7]。已有研究表明，β-catenin在LST的发生、发展中具有重要意义，但尚无LGR5和CDK5在LST中的相关研究。本研究通过分析Wnt信号通路相关分子LGR5、CDK5和β-catenin在正常组织、隆起型腺瘤(Protruded-type colorectal Adenoma，PA)、LST和CRC中的表达水平，为探讨LST的发生、发展及临床诊治提供一定的参考依据。

收集2017年1月至2021年11月在广西医科大学第二附属医院行内镜治疗患者的LST组织标本56例，其中男性32例，女性24例；年龄为27-80岁；LST直径：＞20 mm 14例，≤20 mm 42例；LST部位：近端结肠27例，远端结肠17例，直肠12例；LST病理分型：LST-GH 14例，LST-GM 26例，LST-F 15例，LST-D 1例，因为LST-D只有1例，故将LST-F和LST-D合并统计。收集经内镜切除的PA 58例，其中男性41例，女性17例；年龄为25-63岁；直径：＞20 mm 5例，≤20 mm 53例；病变部位：近端结肠14例，远端结肠30例，直肠14例。收集外科手术治疗CRC及相应正常组织44例，其中男性31例，女性13例；年龄为34-81岁；肿瘤部位：近端结肠15例，远端结肠18例，直肠11例。所有标本均经病理证实。

SP-9000免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒、柠檬酸修复液均购自北京中衫金桥生物技术有限公司，免疫组化一抗来源：β-catenin (8480T-100 μL)购自CST公司、LGR5(ab273092-100 μL)和CDK5(ab40773-100 μL)均购自Abcam公司。

用甲醛固定和石蜡包埋组织标本，切片，厚度约2 μm；将组织切片置于60 ℃恒温烤箱中烘烤30 min；二甲苯脱蜡后，使用不同浓度的酒精(浓度从高到低)进行水化，最后用蒸馏水清洗切片，依次经组织抗原修复、灭活内源性过氧化物酶、正常山羊血清封闭、一抗孵育。湿盒内4 ℃冰箱过夜。过夜后复温、二抗孵育、滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素，DAB显色、苏木素复染、盐酸酒精分化、自来水冲洗，返蓝后用中性树脂封片。

采用10倍放大倍数扫描染色组织，获得细胞分布的整体印象。评估阳性细胞，以更高的放大率进行半定量分析，并确定最终分数。根据细胞染色强度、阳性细胞比例得出最终评分。免疫染色强度评分如下：0(无免疫染色)、1(弱免疫染色)、2(中等免疫染色)和3(强免疫染色)。细胞的阳性比例评分如下：0(阳性细胞＜5%)、1(阳性细胞5%-25%)、2(阳性细胞26%-50%)和3(阳性细胞＞50%)。最终染色分数为染色强度分数乘以阳性细胞染色比例分数。0-2分被定义为阴性(－)表达，3分及以上被定义为阳性(+)表达。

数据分析采用R语言软件进行统计(版本：4.0.3)。两组计量资料的比较采用t检验或Wilcoxon秩和检验，多组计量资料的比较采用方差分析或Kruskal-Wallis H检验，计数资料采用卡方检验或Fisher确切概率法分析。所有结果检验取双侧P值，P＜0.05为差异有统计学意义。

LST各亚型之间在性别、年龄、病变部位及病理类型上差异无统计学意义(P＞0.05)，在病变大小上差异具有统计学意义(P＜0.05)(表 1)。通过对LST和PA的临床病理资料进行比较，发现两者性别差异没有统计学意义(P＞0.05)，而年龄、病变部位、病理类型和病变大小差异具有统计学意义(P＜0.05)。本研究中LST主要位于近端结肠(48.21%)，而PA主要位于远端结肠(51.72%)，LST的病变大小比PA更大(P＜0.05)，并且LST相对PA具有更高的癌变率(表 2)。

免疫组织化学染色显示，LGR5、CDK5和β-catenin在正常组织中的表达较弱，在PA、LST和CRC组织中升高，LGR5和CDK5主要表达于质膜中，呈淡黄色、棕黄色甚至褐色颗粒；β-catenin表达于细胞质膜及细胞核中，呈淡黄色、棕黄色甚至褐色颗粒(图 1-图 3)。

图 1 LGR5在不同组织中的表达(400×) Fig. 1 Expression of LGR5 in different tissues (400×)

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图 2 CDK5在不同组织中的表达(400×) Fig. 2 Expression of CDK5 in different tissues (400×)

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图 3 β-catenin在不同组织中的的表达(400×) Fig. 3 Expression of β-catenin in different tissues (400×)

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LGR5在正常组织、PA、LST和CRC中的阳性率分别是61.36%、51.72%、80.36%和97.73%，CDK5在正常组织、PA、LST和CRC中的阳性率分别是27.27%、55.17%、78.57%、90.91%，β-catenin在正常组织、PA、LST和CRC中的阳性率分别是31.82%、48.28%、89.29%、88.64%。LGR5、CDK5及β-catenin在LST中的表达均高于正常组织和PA，差异具有统计学意义(P＜0.05, 表 3)。LGR5、CDK5和β-catenin在不同LST亚型之间的表达差异均无统计学意义(P＞0.05, 表 4)。

LST作为一类特殊类型的癌前疾病，癌变率明显高于PA^[8]。本研究中LST癌变率为14.29%，明显高于PA，因此LST作为一种具有较高恶变潜能的结直肠病变受到越来越多的关注，但其特殊生长方式的分子机制及恶变机制尚不清楚。研究表明Wnt/β-catenin信号通路参与多种肿瘤的进程^[9]，并且研究发现Wnt/β-catenin信号通路参与LST发生、发展，甚至与恶变过程密切相关^[10]，然而该信号通路调控LST的具体机制尚未完全阐明。

Wnt/β-catenin信号通路是一条保守的信号轴，参与各种生理过程，如增殖、分化、凋亡、迁移、侵袭和组织稳态^[11]。β-catenin作为Wnt经典信号通路中最关键的传递分子，其通过促进癌基因的转录导致肿瘤的发生^{[12, 13]}。有研究发现β-catenin在LST组织中的表达水平明显高于PA^[14]，并且Wnt/β-catenin信号通路的激活与LST发生、发展，甚至恶变过程密切相关^[15]。本研究证实β-catenin在正常组织、PA、LST和CRC中的阳性表达率逐渐增高，且β-catenin在LST与CRC中的表达无明显差异，也表明Wnt/β-catenin信号通路的激活可能参与LST发生、发展与恶变^[10]。

CDK5、LGR5均是Wnt信号通路的重要蛋白^{[5, 6]}。研究表明，CDK5参与多种癌症的肿瘤增殖、迁移和侵袭过程^[16]。在本研究中，LST组织中CDK5的表达高于正常组织及PA组织，提示CDK5可能与LST的特殊生长方式相关。研究报道CDK5可影响E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白等表达，导致细胞黏附能力的改变，从而促进上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)^[17]，并且已经证明CDK5可以通过激活Wnt信号通路介导EMT过程促进CRC的进展^[18]。本研究中，CDK5在LST中与CRC组织表达无明显差异，提示LST和CRC可能有相似的Wnt信号通路活动水平，CDK5与恶变潜能密切相关。

LGR5是Wnt信号传导的一部分，可以调节Wnt信号通路的表达水平，并且对肿瘤的发生、发展和转移起至关重要的作用^[19]。本研究发现LGR5在LST组织表达水平低于CRC组织而高于PA组织。有研究发现LGR5在正常组织、炎性息肉、腺瘤、腺癌中的阳性表达呈现逐渐增高趋势，考虑其表达与异型增生程度相关^[20]。提示LGR5可能参与LST的特殊生长方式或恶变潜能，是促进结直肠黏膜组织异性增生并进一步导致LST癌变进展的重要分子。

已有研究表明LST的生长特征可能与细胞极性密切相关^[21]，正常结直肠上皮组织良好的结构与顶端和基底外侧极性相关，细胞极化是指细胞内有组织地建立不对称性^[22]，EMT是指上皮细胞顶端-基底极性的丧失和间质细胞前-后极性的重新启动^[23]。在某些特殊情况下，细胞极性会受到干扰，极性改变会致使上皮细胞黏附减弱，迁移能力增加，获得更强的运动性，直接参与伤口愈合或促进肿瘤细胞迁移^[24]。既往研究证实β-catenin表达升高可以激活Wnt信号通路下游靶基因进而促进EMT^[25]，因此，LGR5、CDK5可能通过Wnt/β-catenin信号通路调控EMT参与LST的特殊生长方式和癌变。LGR5和CDK5可能是潜在的LST及结直肠癌的治疗靶点，然而，具体机制还需进一步深入研究。本研究为进一步阐明LST和结直肠癌发病机制及防治提供了思路。