2. 中山大学附属第一医院生殖医学中心, 广东广州 510080;
3. 广州医药研究总院有限公司, 广东广州 510220
2. Reproductive Medicine Center, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou, Guangdong, 510080, China;
3. Guangzhou General Pharmaceutical Research Institute Company Limited, Guangzhou, Guangdong, 510220, China
β-地中海贫血(简称β-地贫)是由人β-珠蛋白(HBB)基因突变引起的，是我国南方发病率最高的单基因遗传病[1]。其中，HBB-28 (A>G)突变是我国β-地贫患者携带的5种最常见的HBB突变之一[2]。与其他亚型不同，HBB-28 (A>G)突变位于起始密码子上游28个碱基的启动子区内，突变的产生破坏了转录因子ATA box的结合，降低了HBB的RNA表达[3]。纯合子或复合杂合子-28(A>G)突变的患者可出现重度贫血或中间型贫血[4]，然而，由于纯合子患者临床材料有限，并且其基因突变位于非编码区，目前非编码区突变影响相关基因转录组表达水平的研究较少。
近年来，由于操作简单、成本低和效率高等优点，规律间隔成簇短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, CRISPR)技术被广泛应用于各种生物体的基因组编辑[5]。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在特定位点制造特定的DNA双链断裂(DNA Double Strand Breaks, DSBs)和同源定向修复(Homology Directed Repair, HDR)以引入或纠正特定的基因突变已经成为首选的方法[6]。本研究在CRISPR/Cas9技术的基础上，通过沉默突变阻断连续的再次靶向或再次切割的CRISPR/Cas靶点(Consecutive re-Guide or re-Cas steps to Erase CRISPR/Cas-blocked Targets，CORRECT)的新型无痕基因组编辑技术[7]，在人HBB基因上引入HBB-28 (A>G)点突变，高效建立人β-地贫HBB-28 (A>G)HEK293T纯合突变细胞株，为后续疾病的细胞和分子基础研究，以及建立基因突变修复方法奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株和质粒HEK293T细胞由本实验室保存，CRISPR/Cas9质粒PX459购自美国Addgene公司，pCMV-GFP-p62购自上海碧云天生物技术有限公司。
1.1.2 主要试剂和仪器限制性核酸内切酶BbsⅠ、T7E Ⅰ、AatⅡ、T4连接酶、T4磷酸化酶均购于美国NEB公司，小向导RNA (small guide RNA，sgRNA)以及PCR引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，单链寡核苷酸(single-stranded Oligo DNA Nucleotides, ssODNs)由苏州金唯智生物科技有限公司合成，Trans 5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司，质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，X-tremeGENE HP DNA细胞转染试剂盒购于上海罗氏制药有限公司。荧光倒置显微镜为德国徕卡(Leica)仪器有限公司产品，PCR基因扩增仪为赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品。
1.2 方法 1.2.1 sgRNA的设计与CRISPR/Cas9表达质粒构建查询人HBB基因序列(Genbank: NC_000011.10;https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，利用网站https://crispr.mit.edu设计sgRNA靶点。根据确定的sgRNA靶点序列合成2对互补引物，sgRNA均为正义链序列靶点，因此，需在引物5′端加上BbsⅠ酶的黏性末端，其中，CACC加在正向引物前，AAAC加在反向引物前(表 1)。sgRNA引物磷酸化与退火：分别取1 μL T4磷酸化酶、1 μL正向引物和1 μL反向引物(浓度均为100 μmol)，混匀后进行5′端磷酸化修饰，并经退火形成双链(37℃，30 min；95℃，10 min)。双链sgRNA与线性化CRISPR/Cas9质粒连接：分别取1 μL T4连接酶、2 μL退火产物，以及100 ng经BbsⅠ酶处理的线性化二合一CRISPR/Cas9质粒，混匀后于16℃连接过夜，获得PX459-sgRNA1-Cas9和PX459-sgRNA2-Cas9的共表达质粒。转化(热激法)：按照Trans 5α感受态细胞的产品说明书，将10 μL连接产物转化入100 μL感受态细胞中，轻轻摇匀，冰上放置30 min，42℃水浴中热激45 s，迅速置于冰上冷却2 min，涂布于含50 μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB固体平板，37℃倒置培养16-18 h。测序验证：分别挑取8个单克隆菌落至LB液体培养基中，37℃、220 r/min摇床扩增培养12-16 h，测序鉴定并挑选连接成功的PX459-sgRNA1-Cas9和PX459-sgRNA2-Cas9共表达阳性克隆，根据天根质粒小量提取试剂盒说明书提取阳性克隆质粒。
| 名称 Name |
引物序列(5′→3′) Primer sequence (5′→3′) |
| sgRNA1 | Forward：CACCAGGGCTGGGCATAAAAGTCA Reverse：AAACTGACTTTTATGCCCAGCCCT |
| sgRNA2 | Forward：CACCCAGGGCTGGGCATAAAAGTC Reverse：AAACGACTTTTATGCCCAGCCCTG |
1.2.2 ssODNs序列设计
选择突变位点左右两侧各50 bp序列作为同源臂，合成外源性同源重组模板ssODNs (图 1)。设计ssODNs时采用CORRECT技术[7]，即在不引起氨基酸移码突变或错义突变的前提下，为防止基因组DNA成功突变后被CRISPR/Cas9系统二次切割，依据氨基酸的简并性，在前间隔序列的邻近基序(Protospacer Adjacent Motif, PAM)附近引入同义突变碱基(A>C)，重组后以终止Cas9蛋白切割活性。因为HBB-28 (A>G)位于非编码区，故本研究均用阻断突变(Blocking Mutation Base)表示。为方便后续的鉴定，在引入阻断突变碱基的同时，引入一个新的限制性内切酶AatⅡ识别位点(5′-GACGTC-3′)。如图 1所示，ssODN1序列为正向序列，ssODN2为反向序列。
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| The red font is sgRNA sequence, the green font is PAM sequence, the yellow font is HBB-28 (A>G) mutation site, the blue font is A>C blocking mutation site, the lower horizontal line is the target sequence 图 1 sgRNA靶点和ssODN序列 Fig. 1 sgRNA targets and ssODN sequences |
1.2.3 脂质体转染
转染前于细胞培养瓶中复苏HEK293T细胞，使用含有10%的新生牛血清(FBS)、1%双抗(100 U/mL青霉素和链霉素)的DMEM培养基培养，当细胞传代2-3次性状稳定且状态较好时，将细胞消化后铺于细胞六孔板中，待六孔板中每孔的HEK293T细胞密度汇合到该孔总细胞的70%-80%时，使用X-tremeGENE HP DNA细胞转染试剂盒进行转染操作。在HEK293T细胞中脂质体分别转染1 μg、2 μg和3 μg含绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)的pCMV-GFP-p62表达载体，48 h后在荧光显微镜下观察GFP的表达丰度，评估转染效率，选择合适的质粒浓度进行转染。
转染：将脂质体X-tremeGENE HP、PX459-sgRNA1-Cas9/PX459-sgRNA2-Cas9共表达质粒、ssODN1/ssODN2和无血清培养基室温平衡至15-25℃，短暂漩涡混匀脂质体X-tremeGENE HP；用无血清培养基将PX459-sgRNA1-Cas9或PX459-sgRNA2-Cas9共表达质粒稀释至终浓度为1 μg质粒DNA/100 μL无血清培养基(0.01 μg/μL)，轻柔混匀；再加入1.5倍PX459-sgRNA1-Cas9或PX459-sgRNA2-Cas9共表达质粒体积的脂质体(脂质体切勿接触到塑料管壁)，室温孵育15-20 min，得到转染复合物；用吸管沿着边缘轻轻吸去六孔板中的细胞培养液，再加入2 mL新鲜的含有10%的FBS、1%双抗的DMEM培养基后，将处理好的转染复合物逐滴全部加入，轻轻摇匀，培养24 h后弃去培养液，并更换为2 mL含有0.6 μg/mL嘌呤霉素(Puromycin)的无血清培养基进行药物筛选，继续培养48 h，收集孔内的一半细胞并提取基因组DNA，PCR扩增含有突变位点的片段进行测序鉴定，得到作用sgRNA1和sgRNA2靶点的阳性克隆。
1.2.4 T7E Ⅰ实验与整合效率检测如图 1所示，在ssODN发生整合后，会在1号外显子上游28个碱基处引入HBB-28 (A>G)点突变和1号外显子上游26个碱基处引入阻断突变碱基(A>C)，此时将得到一个新的限制性内切酶AatⅡ识别位点(5′-GACGTC-3′)。为了验证不同靶点的切割效率，以及正、反链ssODN的整合效率，将实验分为4组：①sgRNA1+ssODN1、②sgRNA1+ssODN2、③sgRNA2+ssODN1、④sgRNA2+ssODN2。采用1.2.3节的方法将各组进行脂质体转染48 h后收取HEK293T细胞，收集野生型293T细胞和实验组①-④部分细胞提取基因组DNA，PCR扩增含靶点的片段，引物为HBB-FP：5′-GCAATTTGTACTGATGGTATGG-3′；HBB-RP：5′-ATAACAGCATCAGGAGTGGAC-3′。PCR扩增反应条件为预变性94℃、4 min; 变性94℃、30 s, 退火56℃、30 s，延伸72℃、30 s，35个循环；总延伸72℃、10 min，4℃保存。最后分别取200 ng PCR产物进行T7E Ⅰ(T7E Ⅰ 0.5 μL和相应buffer 1 μL，共10 μL体系，37℃，0.5 h)和AatⅡ(AatⅡ 0.5 μL和相应buffer 1 μL，共10 μL体系，37℃，1 h)酶切，使用10×Loading buffer终止酶切反应后，取8 μL酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，选择有切割效率的PCR产物进行Sanger测序。
凝胶成像后用ImageJ软件进行灰度分析，比较各组切割效率和整合效率。切割效率用T7E Ⅰ酶切活性表示，整合效率用AatⅡ酶切活性表示。切割效率[8]=1-[c/(a+b+c)]0.5(其中a、b分别为凝胶图中被切割2条电泳条带对应ImageJ软件的峰面积；c为未被切割条带的峰面积，也是最大的峰面积)。根据被整合细胞占T7E Ⅰ切割阳性细胞的百分比，设定相对整合效率的计算公式：相对整合效率＝(AatⅡ酶切活性/ T7E Ⅰ酶切活性)×100%。被AatⅡ切割越多，说明该组发生基因重组或整合的细胞越多，整合效率越高。
1.2.5 单克隆培养与鉴定根据酶切实验的结果，选择整合效率最高的实验组采用96孔板计数稀释接种的方法[9]进行单克隆筛选，细胞采用含有10%的FBS、1%双抗的DMEM培养基，于37℃、5% CO2培养箱培养4-5 d后，观察除去双细胞和多细胞孔，对细胞形态正常且单一细胞孔做标记；继续培养7-9 d，待细胞长满整个孔后，吸取孔内2/3的单克隆集落细胞提取基因组DNA，挑选10个单克隆集落细胞, 采用1.2.4节的PCR方法扩增含有突变位点的片段，并进行测序鉴定，获得含目标纯合突变的单克隆细胞株。
2 结果与分析 2.1 CRISPR/Cas9表达质粒构建根据图 2的质粒测序分析结果可知，PX459-sgRNA1-Cas9和PX459-sgRNA2-Cas9共表达质粒构建成功。
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| 图 2 PX459-sgRNA1-Cas9和PX459-sgRNA2-Cas9共表达质粒测序结果 Fig. 2 Sequencing result of co-expression plasmid PX459-sgRNA1-Cas9 and PX459-sgRNA2-Cas9 |
2.2 脂质体转染效率
荧光显微镜下观察发现，转染1 μg质粒时不到20%的细胞表达GFP，转染2 μg质粒时表达GFP的细胞比例达到80%，转染3 μg质粒时表达GFP的细胞比例在85%以上(图 3)。为了减少转染的毒性同时又达到较好的转染效果，选择转染2 μg质粒进行后续实验。
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| (a) Fluorescence spectra of transfected by 1 μg, 2 μg and 3 μg GFP plasmids; (b) The bright field and green fluorescence image of 2 μg GFP plasmid transfection 图 3 脂质体转染HEK293T细胞的效率 Fig. 3 Efficiency of liposome transfected into HEK293T cells |
2.3 HBB - 28基因(A>G)定点突变HEK293T细胞株的建立 2.3.1 sgRNA切割效率和ssODNs整合效率验证
sgRNA切割效率实验(T7E Ⅰ酶切活性)：PCR扩增包含有突变位点在内的片段，实验组①-④的PCR产物总长度是578 bp，且均表现出切割活性，酶切后分为3条条带：原有条带578 bp，以及被切割后的372 bp和206 bp两条条带(图 4)。结合灰度分析，实验组①-④的切割效率分别为27.19%、22.72%、18.62%和21.49%(表 2)。对于HBB-28基因，活性最高的是sgRNA1，因此，后续的基因定点突变实验选用sgRNA1进行。
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| M: Marker; ①: sgRNA1+ssODN1;②: sgRNA1+ssODN2;③: sgRNA2+ssODN1;④: sgRNA2+ssODN2 图 4 不同靶点切割效率和不同ssODNs整合效率比较 Fig. 4 Comparison of editing efficiency and integration efficiency of different targets and ssODNs |
| 组别 Group |
切割效率(%) Cutting efficiency(%) |
整合效率(%) Integration efficiency(%) |
相对整合效率(%) Relative integration efficiency (%) |
| ① | 27.19 | 26.41 | 97.14 |
| ② | 22.72 | 22.25 | 97.96 |
| ③ | 18.62 | 14.78 | 79.42 |
| ④ | 21.49 | 12.84 | 59.72 |
ssODNs整合效率实验(AatⅡ酶切活性)：当ssODNs整合至目标位置时，会被AatⅡ酶识别并切割，如图 4的电泳图及表 2的灰度分析结果所示，实验组①-④均有AatⅡ酶的酶切活性，整合效率分别为26.41%、22.25%、14.78%和12.84%，说明这4组均有ssODNs整合。
根据表 2汇总的各组切割效率、整合效率和相对整合效率可知，实验组①的切割效率和整合效率最高，其相对整合效率为97.14%，与相对整合效率最高的实验组② (97.96%)相差不大。为了减少实验结果的误差，对实验中的PCR产物进行T7E Ⅰ酶切和AatⅡ酶切的重复实验，结果与初次实验差异不大。因此，选择实验组①进行后续的单克隆筛选实验。
2.3.2 测序鉴定结合图 4和表 2的灰度分析，以及图 5峰值结果，实验组①-④均发生了切割和整合，引入了β-地贫基因HBB-28 (A>G)和阻断突变碱基(A>C)，且实验组①和②的杂合峰值比实验组③和④高(图 5)，说明实验组①和②的切割效率和整合效率高，但未进行单克隆挑选，故显示为杂合的峰图。
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| The blue arrow shows HBB-28 pathogenic point mutation base (A>G), and the red arrow shows blocking mutation base (A>C) 图 5 各组总细胞提DNA后进行PCR测序的峰图 Fig. 5 Peaks of DNA extracted from total cells of each group for PCR sequencing |
2.4 β-地贫基因HBB- 28 (A>G)定点突变的单克隆HEK293T细胞株的建立
如图 6所示，单克隆HEK2937细胞株同时引入了HBB-28 (A>G)和阻断突变(A>C)碱基。10个单克隆中还包含5个杂合突变、1个非目标突变纯合细胞株以及3个无相应碱基突变的野生型细胞株。
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| The blue arrow shows HBB-28 pathogenic point mutation base (A>G), and the red arrow shows blocking mutation base (A>C) 图 6 野生型与HBB-28 (A>G)突变型单克隆HEK293T细胞株的测序峰图 Fig. 6 Sequencing peak maps of wild-type cells verse HBB-28 (A>G)mutant monoclonal HEK293T cells |
3 讨论
CRISPR/Cas9基因编辑技术是继锌指核酸酶(Zinc-Finger Nucleases，ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nucleases，TALENs)技术之后出现的第三代新型基因编辑技术。CRISPR/Cas9基因编辑技术通过导向sgRNA招募Cas9蛋白在细胞内靶基因特定位点进行特异切割形成DNA双链断裂，进而诱发同源重组和非同源末端连接的自我修复过程，实现对基因组特定靶点的编辑[5, 10]。该技术操作便捷、重复性好，而且易于设计、插入效率高，已在医学、药物、生命科学等多领域得到广泛应用[11]。
在哺乳动物细胞中，基因HDR频率相对少见，大多数情况下DSBs由非同源连接(Non-Homologous End Joining, NHEJ)修复[12]。然而，HDR介导的基因插入在人类疾病模型制备、基因治疗和农业遗传改良等方面具有重要作用，但是其效率很低[13]。因此，如何提高HDR的频率对提高编辑效率显得格外重要。其中，单链供体ssODNs模板的应用，有助于提高HDR的频率。与利用双链DNA(double strand DNA, dsDNA)模板或其他遗传操作进行小片段插入、缺失或点突变不同，对于短片段的插入，ssODNs作为供体模板具有更高的基因插入效率[14]。另外，dsDNA同源模板受拓扑结构、同源臂长度等影响，构建过程需要数周，而ssODNs合成时间短，且不需要任何筛选标记就可以一步完成基因精确修复，不会随机整合到基因组中，是一种更加安全、精确的基因编辑方法[15, 16]。
Kwart等[7]和Paquet等[17]利用CRISPR/Cas9和ssODN在人类多功能干细胞中引入与疾病相关的致病突变时发现，高达95%的已编辑位点的序列会被再次编辑，造成额外的indel突变破坏。利用CORRECT技术能够有效阻断多个位点的再次编辑，这些阻断突变碱基能以高效率、高精度选择性引入单等位或双等位基因序列，使HDR的编辑精度提高到每个等位基因的10倍，阻断突变的位点越接近PAM位点，HDR的效率越高[7, 17]。为了提高HDR的频率，本研究一方面利用CORRECT基因编辑新技术在CRISPR/Cas9靶向所需PAM序列附近插入同义突变碱基到HDR模板中，在很大程度上阻止不良的再次编辑，提高了ssODNs的相对整合效率(达97.14%)，获得了纯合的单克隆HBB-28 (A>G)细胞株。另一方面，本研究在PAM前5个碱基处引入限制性内切酶AatⅡ识别位点，同样得到较好的编辑和整合效率。比较ssODNs的正反方向对整合效率的影响发现，sgRNA1和sgRNA2均为正义链序列的靶点，对于编辑效率高的sgRNA1靶点，正、反向ssODNs的整合效率分别为26.41%和22.25%，相对整合效率分别为97.14%和97.96%，表明正、反方向的ssODNs对相对整合效率影响不大。对于编辑效率相对较弱的sgRNA2靶点，正、反向ssODNs的整合效率分别为14.78%和12.84%，相对整合效率分别为79.42%和59.72%，表明对sgRNA2靶点而言，正向ssODN1的相对整合效率更高。但该结果是否适用于其他靶点，需要进一步验证。尽管针对单个等位基因的阻断突变碱基(同义突变)的引入不影响氨基酸序列，但是引入的突变碱基是否在DNA或RNA水平影响细胞的转录调控或内部功能尚不清楚。遗传密码被破解以来，人们通常认为遗传密码具有简并性，同义突变是无害的，不会改变蛋白质序列[18, 19]。然而Shen等[20]最近的研究发现大多数同义突变是非常有害的，他们通过改造酿酒酵母基因组中21个有代表性的基因，制造了8 341个突变体，结果显示至少75%的同义突变显著损害酿酒酵母的适应度，且损害幅度超过0.1%，是自然选择在酿酒酵母中所能感知的最小适应度变化的10 000倍。但是该实验是在单倍体芽殖酵母中进行的，后期需要在不同生物体及其杂合状态下做进一步的实验验证。
本研究虽然未进行基因点突变后的细胞功能验证，但是在方法学上提供了一种新型、高效的点突变编辑方法，且该方法同样适用于特定基因突变位点的修复，为后续的研究奠定了模型和方法基础。
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