好氧发酵技术可实现市政污泥无害化、减量化和稳定化，是极具发展潜力的市政污泥处理技术^[1]。但发酵过程中高温、高含水率以及氧气分布不均匀的特性会导致甲烷(CH₄)释放^[2]，而CH₄是一种典型的温室气体，其温室效应是二氧化碳(CO₂)的25倍^{[3, 4]}。对此，研究人员积极探索减少市政污泥好氧发酵CH₄释放的措施，如通过调节物料性质、改变曝气或添加调理剂等方式^[5-9]。

已有研究表明，添加生物炭作为市政污泥好氧发酵的调理剂，不仅可以优化好氧发酵的效果，而且能减少CH₄的释放^{[3, 10]}，这是由于生物炭可以直接改变堆体的理化性质，间接导致甲烷菌和甲烷氧化菌等微生物的繁殖和代谢活动发生变化，最终影响CH₄的释放^{[11, 12]}。向秋洁等^[8]探究了竹炭对市政污泥好氧发酵CH₄释放的影响，结果显示当竹炭添加量低于5%时，CH₄释放量减少，说明竹炭不仅可以提高堆体的供氧能力和通气条件，还能吸附堆体中的CH₄。Sonoki等^[13]报道了相似的研究结果，绒毛枹栎生物炭的多孔特性能提高堆体的通气性，进而降低甲烷菌的活性，增强甲烷氧化菌的活性。Liu等^[14]研究表明，生物炭对铵态氮(NH₄⁺-N)的吸附降低了甲烷菌对NH₄⁺-N的利用，从而抑制了甲烷菌的生长和活性。易建婷^[15]在市政污泥好氧发酵中分别添加水稻生物炭和竹炭，结果显示两组CH₄累计释放量有显著差异(P < 0.05)，可能与两种生物炭的颗粒大小和孔隙度差异有关。综合上述研究，在市政污泥好氧发酵中添加生物炭，对减少CH₄释放有积极作用，然而大多数研究集中在生物炭的添加量^[16]、制备原料^[17]以及颗粒大小^[18]等宏观层面上。孔隙结构是生物炭基本的物理特性^[19]，但目前仍缺乏生物炭孔隙结构对市政污泥好氧发酵过程中CH₄释放的影响的深入研究。

本研究在市政污泥好氧发酵过程中添加不同孔隙结构的生物炭，探讨不同孔隙结构对堆体环境及CH₄释放的影响，进一步分析各孔隙结构影响甲烷菌和甲烷氧化菌代谢活动的途径，并通过研究生物炭孔隙结构与CH₄释放规律、环境因子及微生物之间的相关性，以期阐明生物炭孔隙结构对市政污泥好氧发酵过程中CH₄释放的影响，为利用生物炭减少市政污泥好氧发酵的CH₄释放提供理论参考。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 好氧发酵材料

污泥(SW)采集自广西南宁市明阳工业园区污水处理厂，稻壳购置于河南省竹马儿电子商贸有限公司，EM菌剂购自河南益加益生物工程有限公司。榉木生物炭(WB)由奥地利博林泰森公司(Polytechnik Luft- und Feuerungstechnik GmbH)提供，稻壳生物炭(RB)和玉米芯生物炭(CB)分别从陕西森亚泰家庭园艺专营店和河南立泽环保科技有限公司购置。各原材料基本特性如表 1所示。

1.1.2 市政污泥好氧发酵反应器

本实验所用反应器主体为容积220 L的不锈钢桶(φ 600 mm×800 mm)，外部包裹50 mm厚的保温棉，在桶壁底部开设一个小孔用于连接曝气管，在距离曝气管高度100 mm处搭建一块亚克力板曝气盘(φ 580 mm×10 mm)。反应器侧面设有3个取样口用于采集固体样品。在反应器顶部中心设有一小孔并连接直径为20 mm的塑料管，用于排气和测温。好氧发酵反应器如图 1所示。

1.2 方法 1.2.1 实验设计与样品采集

(1) 市政污泥好氧发酵实验。

将40 kg污泥、10 kg稻壳和0.01% EM菌剂混合均匀作为对照组(CK)，实验组在CK的基础上再分别添加5 kg的榉木生物炭、稻壳生物炭和玉米芯生物炭。混合均匀的物料在反应器进行44 d的好氧发酵，于第7天、14天、24天、34天进行翻堆。通过气体流量计将曝气量控制在0.1 m³/(min·m³)。

(2) 样品采集与处理。

气体样品在发酵前12 d每天采集并测试，在12 d之后则隔天进行采集。固体样品在发酵的第0天、3天、7天、11天、16天、23天、30天、37天和44天采集，其中第7天先采样再翻堆。固体样品混匀后分成两个部分：一部分置于4℃的冰箱中保存，用于pH、NH₄⁺-N、产甲烷潜势(Methane Production Potential，MPP)和甲烷氧化潜势(Methane Oxidation Potential，MOP)等指标测定；另一部分于-20℃超低温冰箱中保存，用于测定微生物群落。发酵温度为每日同一时间反应器上部、中部和底部温度的平均值。

1.2.2 样品分析方法

(1) 生物炭表征。

生物炭的微观孔隙形貌采用扫描电子显微镜(日立S3400N，日本)表征。生物炭的孔径、比表面积及孔容使用全自动比表面积分析仪(麦克ASAP 2460，美国)进行测定，通过密度泛函理论分析孔径分布。本研究以生物炭孔径代表生物炭孔隙结构。根据国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)孔径分类标准，多孔材料按孔径大小可以划分为微孔(< 2.00 nm)、中孔(2.00-50.00 nm)和大孔(>50.00 nm)。

(2) 气体及理化性质测定。

使用气相色谱仪(安捷伦8890，美国)分析CH₄，选择氢火焰离子化检测器(FID)和30 m×0.25 mm的毛细管柱(安捷伦HP-5，美国)进行测定。仪器参数设置如下：进样口和检测器温度设为250℃，柱箱温度为40℃，保持时间为5 min，载气(N₂)流速为1.99 mL/min，载气压力为10 psi，氢气和空气流速分别为30 mL/min和400 mL/min。使用pH计(雷兹DZB-718L，中国)测定样品的pH值，采用纳氏比色法测定NH₄⁺-N^[20]。

(3) 产甲烷潜势和甲烷氧化潜势的测定。

参考Ma等^[21]的方法，并结合顶空气相色谱(HS-GC)技术进行设计，HS-GC系统由顶空进样器(安捷伦7697A，美国)和气相色谱仪(安捷伦8890，美国)组成。顶空进样器的参数设置如下：加热炉温度设为80℃，传输线和平衡回路分别设为40℃和100℃，连续注射时间为0.6 min，样品填充压力为15 psi，保持时间为0.25 min。气相色谱仪参数设置同1.2.2节(2)点内容。

MPP实验步骤如下：称取2 g鲜样于20 mL顶空瓶，在氮气操作箱中排除空气，5 min之后封盖，再移至25℃恒温培养箱中培养250 h，最后通过HS-GC测定瓶中CH₄的浓度。MOP实验步骤如下：称取0.5 g鲜样于20 mL顶空瓶中并封盖，再将1 mL浓度为50%的CH₄标准气注射至顶空瓶内，随后于25℃恒温培养箱中培养100 h，使用HS-GC测定CH₄的减少量。

(4) 微生物群落测序。

选择污泥和第3天、23天、44天的样品测定微生物群落，分别代表空白对照、高温期、降温期和腐熟期的微生物群落。采用引物515F (5′-GTGYCAGCCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3′)扩增16S rRNA基因的V4区^[22]。PCR反应程序设置如下：首先95℃预变性3 min，然后95℃变性30 s，退火30 s，72℃延伸45 s，再72℃延伸10 min。应用IlluminaMiseq平台进行高通量测序，该工作委托上海美吉生物医药科技有限公司完成。

1.2.3 数据分析

本文使用SPSS 25.0软件处理和分析实验数据。所有图像均采用Origin 9.0绘制。采用Spearman方法进行相关分析，使用CANOCO 5.0的冗余分析(Redundancy Analysis，RDA)建立CH₄释放与其他指标之间的关系。

2 结果与分析 2.1 生物炭孔隙结构

WB的孔径最小、比表面积最大；CB孔径最大、比表面积最小；而RB则介于两者之间，且与WB更为相似(表 1)。WB和RB在0.00-2.00 nm出现明显的微孔峰值，且微孔结构分别占各自总孔隙结构的87.84%和73.72%，表明WB和RB的孔隙结构以微孔结构为主。CB则在93.13-233.91 nm显示出明显的大孔峰值且大孔结构占89.94%，表明玉米芯生物炭以大孔结构为主(图 2)。

生物炭表面形貌如图 3所示，WB的骨架清晰且厚实、孔道流畅，内壁光滑无小孔，孔隙分布均匀。RB的骨架较为清晰，但厚度较薄，整体形似圆形管道堆叠，在各通道连接处形成直径更小的孔隙。CB呈蜂窝状结构，各孔紧密地连接，孔道内壁遍布不连通的小孔。

2.2 生物炭孔隙结构对市政污泥好氧发酵堆体环境的影响

WB的最高发酵温度可达72.6℃，RB、CB和CK的最高温度分别为70.9℃、67.1℃和68.5℃[图 4(a)]。好氧发酵过程中，CK、WB、RB和CB的高温期(> 55℃)分别为4 d、8 d、8 d和7 d。在整个发酵周期中，所有发酵组的温度变化呈波浪形特征，在翻堆之后温度逐渐上升。所有发酵组的初始NH₄⁺-N含量较为接近，在发酵过程中各组的NH₄⁺-N呈先增后减的变化规律，且实验组的NH₄⁺-N浓度均低于CK [图 4(b)]。在发酵第3天，CK、WB、RB、CB的NH₄⁺-N含量均达到最大值，之后逐渐减少。各组初始pH值为7.75-8.00，随着好氧发酵的进行，pH呈先增后减的变化趋势，发酵结束后各发酵组的pH值为6.72-7.00[图 4(c)]，说明施用生物炭并未破坏堆体的酸碱平衡。

2.3 生物炭孔隙结构对CH₄释放规律、MPP、MOP的影响

图 5(a)和图 5(b)显示了各组CH₄释放的规律。CK、WB、RB和CB的CH₄释放速率最大值分别为21.58 mg/(kg·d)、9.58 mg/(kg·d)、12.93 mg/(kg·d)和15.64 mg/(kg·d)。进入腐熟期后，CH₄释放速率逐渐减少并趋于稳定。当发酵结束时，CK、WB、RB和CB的CH₄累计释放量分别为5 296.89 mg、3 080.99 mg、3 517.51 mg和4 862.76 mg。与CK相比，WB、RB和CB分别减少41.83%、33.59%和8.20%，其中WB和RB的CH₄减排效果最佳。

MPP和MOP的动态变化如图 5(c)和图 5(d)所示。初始样品的MPP远高于其他发酵时期，这与CH₄释放速率的变化趋势相对应。在发酵7 d后，各组的MPP逐步趋于稳定且潜势较弱；MOP在发酵前期较弱，而在11 d后，各组均有所增强。

2.4 生物炭孔隙结构对市政污泥好氧发酵中甲烷菌和甲烷氧化菌群落的影响

从图 6(a)可以看出，SW主要包含的甲烷菌为甲烷杆菌属(Methanobacterium)、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)和甲烷鬃毛菌属(Methanosaeta)。WB和RB均出现嗜热自养甲烷杆菌属(Methanothermobacter)，Methanothermobacter在WB具有较高的丰度(45.45%)，在RB的丰度相对较低(9.09%)，而在CK和CB中未检测到Methanothermobacter。与WB和RB相比，CB在高温期和腐熟期的甲烷菌种类更丰富。

发酵过程中甲烷氧化菌的群落演替见图 6(b)。SW的甲烷氧化菌种类丰富，但随着反应的进行，所有发酵组的甲烷氧化菌种类逐渐减少。高温期时，Unclassified_f_Methylococcaceae为各组的优势菌群，甲基热菌属(Methylocaldum)和甲基杆菌-甲基罗布氏菌属(Methylobacterium-Methylorubrum)也有较高的相对丰度。在降温期和腐熟期，各组的优势菌群更替为Norank_f_Methylococcaceae，且相对丰度均达到90%以上，与高温期样品相比甲烷氧化菌种类更单一。综上可知，所有发酵组甲烷氧化菌的演替规律趋同，不同生物炭孔隙结构对甲烷氧化菌的演替及其物种组成的影响相似。

2.5 生物炭孔隙结构与CH₄释放及其影响因素的相关性分析

通过RDA可建立生物炭孔隙结构与环境因素、微生物之间的相关性(图 7)。RDA1和RDA2贡献率分别为81.84%和0.05%。CH₄释放速率、温度和NH₄⁺-N的箭头长度较长，说明三者对甲烷菌和甲烷氧化菌组成的解释量较大，且3种因素间的夹角最小，说明NH₄⁺-N和温度是影响CH₄释放的重要因素。生物炭孔径与CH₄释放速率、温度、NH₄⁺-N呈正相关关系。pH是箭头长度最短的环境因子，与CH₄释放速率间的角度接近直角，说明两者间的相关性较弱。MOP与MPP、CH₄释放速率、孔径之间呈负相关关系。

3 讨论

本研究结果表明，在市政污泥好氧发酵过程中添加生物炭可减少CH₄释放，这是因为生物炭的孔隙结构具有良好的氧气传输能力，可以减少堆体局部厌氧环境的产生。此外，实验组CH₄释放规律的差异可能与不同孔隙结构有关。生物炭的微孔结构对小分子物质(气体、液体小分子等)具有较强的吸附性能^[23]，故推测以微孔结构为主的榉木生物炭和稻壳生物炭可以吸附更多CH₄，降低CH₄释放速率并减少CH₄累积释放量。

堆体温度是影响好氧发酵进程的重要因素，也是评价腐熟的重要指标。本研究通过添加生物炭的方式不仅可以提高发酵温度，还能延长高温期，从而促进堆肥腐熟，使堆料无害化，这是由于生物炭可提高堆体的含氧量，增强好氧微生物的活性，有利于堆体升温^[24]。本研究结果表明，WB和RB的温度高于CK和CB，而WB和RB的孔隙结构特征以微孔结构为主，说明微孔结构更有利于氧气分布和传输，从而抑制CH₄释放。WB和RB由于氧传递效果优于CB和CK，因此使体系更多地处于好氧环境，进而促进NH₄⁺-N进行硝化反应，降低堆体中NH₄⁺-N的含量。NH₄⁺-N对MPP具有增强作用，对MOP具有抑制作用^[11]，由此可知，WB和RB对CH₄转化的影响高于CK和CB。

发酵过程中各组甲烷菌群落呈不同的演替规律。Methanothermobacter因其适应性强而成为优势菌群，Methanothermobacter的最适生长温度为55-65℃^[25]，其对高温环境的适应性高于堆体中的其他甲烷菌属，且温度越高，Methanothermobacter的相对丰度越大，这可能是由于WB和RB的高发酵温度抑制了大部分甲烷菌的生长，说明生物炭微孔结构可通过提高发酵温度的方式影响甲烷菌的演替。生物炭孔隙能为微生物提供生存和繁衍的场所^[26]。本研究发现，CB的甲烷菌种类更丰富，说明玉米芯生物炭的大孔结构不仅可以成为甲烷菌的理想栖息地，而且也能容纳更多数量的甲烷菌，进而导致CB的CH₄释放量大于WB和RB。

RDA结果显示，NH₄⁺-N和温度是影响CH₄释放的主要因素，NH₄⁺-N是甲烷菌的主要氮源^[27]，NH₄⁺-N含量降低可导致甲烷菌的生理活动减缓，最终减少CH₄释放。此外，高温环境也会抑制甲烷菌的活性^[28]。本研究发现，孔隙结构小的生物炭更有利于减少CH₄释放，这是因为孔隙结构小的生物炭比表面积更大，对NH₄⁺-N的吸附作用更强，从而提高MOP；同时，孔隙结构小的生物炭能使堆体达到较高的温度，进而减少CH₄的产生。综上所述，生物炭的孔隙结构对减少市政污泥好氧发酵过程中CH₄释放有积极作用，后续可结合生物炭的添加量与添加时间探讨最佳工艺条件，进一步提高CH₄的减排效果。

4 结论

本研究通过添加不同孔隙结构的生物炭对市政污泥进行好氧发酵实验，结果表明，WB、RB和CB的CH₄释放量与CK相比明显减少；WB和RB能减少高温期和腐熟期的甲烷菌种类；生物炭孔径与CH₄释放速率呈正相关关系。本研究结果表明，以微孔结构为主的WB和RB能够有效抑制好氧发酵过程中甲烷菌的活性，CH₄减排效果较佳。研究结果对使用生物炭调理剂减少市政污泥好氧发酵过程中CH₄释放具有一定的参考价值。

致谢:

感谢奥地利博林泰森公司(Polytechnik Luft- und Feuerungstechnik GmbH)提供的帮助！