2. 广西中医药大学, 广西中药药效研究重点实验室, 广西南宁 530200;
3. 成都中医药大学药学院, 四川成都 611137
2. Guangxi Key Laboratory of Efficacy Study on Chinese Materia Medica, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning, Guangxi, 530200, China;
3. Faculty of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu, Sichuan, 611137, China
类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis, RA)是一种慢性、系统性、自身免疫性炎症疾病，主要攻击滑膜关节，进而导致关节破坏、关节畸形和功能丧失等障碍疾病，这是造成劳动力丧失和残疾的主要原因，严重危害人类健康[1, 2]。在我国，RA总患病率为0.32%-0.36%[3]。目前临床上常用于类风湿性关节炎的药物为非甾体抗炎、甾体激素等[4]，均存在诸多不良反应。RA在中医属“痹证”范畴，其病由人体正气不足、脏腑功能失调、风湿寒热燥等外邪入侵，痰瘀气滞，气血运行不畅所引起[5]。中医药具有疗效好、依赖性低、副作用少等优点，利用其治疗RA疾病已成为研究热点[6]。
厚藤(Ipomoea pes-caprae)为旋花科(Convolvulaceae)番薯属(Ipomoea)植物，是我国常用海洋中药材，具有祛风除湿、消痈散结、拔毒消肿的功效，在民间应用广泛。现代药理研究报道，厚藤具有抗炎、免疫调节、抗氧化等功效[7]。目前，厚藤抗RA作用的研究报道较少，本文探讨厚藤提取物(Ipomoea pes-caprae Extract, IPE)对Ⅱ型胶原诱导关节炎(Collagen-induced Arthritis, CIA)模型大鼠的治疗作用，为临床应用及产品开发提供研究基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物SPF级雄性SD大鼠，6周龄，体质量160-200 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物许可证号SCXK (湘) 2019-0004。动物饲养于温度(23±2)℃、湿度50%-60%、12 h/12 h昼夜交替光照的环境中，自由进食饮水。动物实验经广西中医药大学动物伦理委员会批准(批准号DW20190418-015)。
1.1.2 药材厚藤采自广西防城港市北仑河口国家级自然保护区，经广西中医药大学韦松基教授鉴定为旋花科植物厚藤(Ipomoea pes-caprae (L.)Sweet)的全草。
1.1.3 药品及试剂牛Ⅱ型胶原(CⅡ, 美国Chondrex，批号：190578)，弗氏不完全佐剂(IFA, 美国Chondrex，批号：190572)，弗氏完全佐剂(CFA, 美国Chondrex，批号：190447)，雷公藤多苷(江苏美通制药公司，批号：200401)，PGE2 ELISA Kit (Bioswamp生物科技有限公司，批号：RA20013)，RF ELISA Kit (上海酶联生物科技有限公司，批号：ml525301)，CRP ELISA Kit (上海酶联生物科技有限公司，批号：ml038253)。
1.1.4 仪器CPA225D万分之一天平(德国赛多利斯科学仪器北京公司)，HDM-500型恒温电热套(江苏天由发展有限公司)，Hei-VAP型旋转蒸发仪(德国Heidolph公司)，TGL-16M型台式高速冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，M200PRO型酶标仪[帝肯(上海)贸易有限公司]。
1.2 方法 1.2.1 厚藤提取物的制备称取厚藤全草2.5 kg，切成约10 cm粗段，加水提取2次，第1次加12倍量水，第2次加10倍量水，煮沸后再煎30 min，用200目纱布过滤，合并药液，55℃减压浓缩至稠膏，取提取物稠膏，稀释至相应灌胃浓度进行实验。
1.2.2 动物分组、模型复制及给药60只大鼠经适应性喂养5 d后，按体质量随机选取8只作为空白组，其余52只大鼠用于复制模型。造模时，将牛Ⅱ型胶原(CⅡ)溶液与等体积弗氏完全佐剂(CFA)混合乳化后，除空白组外，其余组大鼠取背部脊柱两侧和尾根部皮内注射配置好的胶原乳剂0.1 mL，共0.3 mL。初次免疫第7 d，将CⅡ溶液与等体积弗氏不完全佐剂(IFA)混合乳化后，在大鼠右侧踝关节皮下注射0.1 mL进行第2次免疫。空白对照组于相同部位注射等量生理盐水。造模24 d后，挑选造模成功(关节炎指数AI≥3)的大鼠，根据炎症指数随机分为5组，即模型组，阳性组，厚藤提取物高、中、低剂量组，每组8只。
厚藤提取物高、中、低剂量组分别按2.271 2，1.135 6，0.567 8 g/kg鼠重(分别相当于人每日服生药材120，60，30 g)灌胃，阳性对照组按9 mg/kg鼠重给予雷公藤多苷混悬液(加蒸馏水配制成0.6 mg/mL雷公藤多苷混悬液)灌胃，空白组和模型对照组给予等体积的纯化水，每次灌胃容量按1.5 mL/100 g鼠重给予。每日1次，连续21 d。
1.2.3 大鼠情况观察自给药起，每日观察并记录大鼠活动情况、精神状况、皮毛光泽度、大小便等变化。
1.2.4 踝关节肿胀度测定造模前，在每只大鼠踝关节测量处用马克笔进行画线标记，确保每次测量位置一致。经2次免疫后，每3 d采用2-3 mm宽纸条和透明软尺，固定测量大鼠右后足踝关节0.5 mm处的关节周径。踝关节肿胀度=(致炎后关节周径－致炎前初始周径)/致炎前初始周径。
1.2.5 足跖肿胀度测定大鼠经2次免疫后，每3 d用数显游标卡尺测量大鼠右后足跖厚度，足趾肿胀度＝(致炎后足跖厚度－致炎前足跖厚度)/致炎前足跖厚度。
1.2.6 关节炎症指数评价根据关节炎症评分与计数的标准[8](表 1)，对大鼠进行关节炎指数评分(总分为四足评分之和)。
| 评分值 Score value |
症状 Symptoms |
| 0 | 正常 No evidence of erythema and swelling |
| 1 | 踝关节或脚掌中部有红斑或轻度肿胀 Erythema or mild swelling confined to the mid-foot (tarsals) or ankle joint |
| 2 | 踝关节至脚掌中部有红斑和肿胀 Erythema and swelling extending from the ankle to the foot |
| 3 | 踝关节和足跖关节有红斑和中度肿胀 Erythema and moderate swelling extending from the ankle to the metatarsal joints |
| 4 | 踝关节至脚有红斑和严重肿胀 Erythema and severe swelling encompass the ankle, foot and digits |
1.2.7 血清中PGE2、RF、CRP含量测定
末次给药后，大鼠禁食不禁水12 h。采集血液标本前，用10%水合氯醛按0.3 mL/100 g鼠重腹腔注射使各组大鼠麻醉，腹主动脉取血，室温放置2 h，3 000 r/min离心10 min，吸出血清，于-80℃低温冰箱保存待测。采用ELISA试剂盒按照说明书检测各组大鼠血清中前列腺素E2(Prostaglandin E2, PGE2)、类风湿因子(Rheumatoid Factor, RF)、C-反应蛋白(C-reaction Protein, CRP)表达情况。
1.2.8 滑膜组织病理分析腹主动脉取血后，截取大鼠的踝关节，剔除表面皮肤和肌肉，置于4%多聚甲醛溶液中固定3 d后，换入新的固定液继续固定4 d，将踝关节用PBS清洗3次，继而用纯化水清洗3次，将踝关节转移至20倍体积的脱钙液中脱钙，脱钙液每周更换1次，4-6周时用针刺、钳夹的方法检查脱钙情况，待针刺无阻力感时终止脱钙，将组织脱水、石蜡包埋、切片，经切片脱蜡后进行HE染色。
1.2.9 数据处理实验数据以均值±标准差(x±s)表示，用Graphpad Prism 8.0统计软件处理，组间比较采用t检验。
2 结果与分析 2.1 大鼠后肢肿胀情况观察大鼠后肢踝关节肿胀情况如图 1所示。空白组(图 1a)大鼠活动自如，无关节炎症现象，毛发顺滑光亮，饮食、大小便正常。模型组(图 1b)大鼠踝关节肿胀严重，以右后足踝关节肿胀最为明显，行动迟缓，毛发枯萎且色泽暗淡，精神逐渐萎靡，进食减少。给予厚藤提取物干预后，大鼠踝关节肿胀程度得到减轻。
|
| 图 1 各组大鼠后肢肿胀情况 Fig. 1 Hindlimb swelling of rats in each group |
2.2 厚藤提取物对CIA大鼠踝关节肿胀度的影响
由表 2可知，各组造模大鼠踝关节肿胀度与空白组相比均显著提高(P < 0.01)。各治疗组与模型组相比均无显著性差异(P>0.05)，其中，厚藤提取物高剂量组有减轻踝关节肿胀度的趋势。厚藤提取物高、中、低剂量组与阳性组比较，无统计学意义(P>0.05)。
| 给药天数 Administration days(d) |
空白组 Blank control group |
模型组 Model group |
阳性组 Positive control group |
厚藤提取物高剂量组 High dose IPE group |
厚藤提取物中剂量组 Middle dose IPE group |
厚藤提取物低剂量组 Low dose IPE group |
| 0 | 0.070±0.054 | 0.479±0.189## | 0.499±0.134## | 0.466±0.144## | 0.487±0.138## | 0.529±0.120## |
| 3 | 0.028±0.052 | 0.402±0.146## | 0.414±0.101## | 0.379±0.125## | 0.422±0.139## | 0.441±0.112## |
| 6 | 0.005±0.056 | 0.355±0.138## | 0.364±0.083## | 0.322±0.125## | 0.383±0.152## | 0.408±0.118## |
| 9 | 0.028±0.072 | 0.352±0.133## | 0.381±0.111## | 0.328±0.121## | 0.378±0.157## | 0.392±0.091## |
| 12 | 0.035±0.057 | 0.353±0.126## | 0.366±0.105## | 0.315±0.109## | 0.361±0.169## | 0.379±0.113## |
| 15 | 0.052±0.062 | 0.376±0.109## | 0.395±0.082## | 0.334±0.093## | 0.383±0.152## | 0.379±0.092## |
| 18 | 0.055±0.060 | 0.376±0.107## | 0.376±0.083## | 0.328±0.087## | 0.368±0.146## | 0.363±0.095## |
| 注：与空白组比较##P < 0.01 Note: ##P < 0.01 compared with blank control group | ||||||
2.3 厚藤提取物对CIA大鼠足跖肿胀度的影响
厚藤提取物对CIA大鼠足跖肿胀度的影响结果如表 3所示。与空白组相比，各组造模大鼠足跖肿胀度均显著提高(P < 0.01)。与模型组相比，厚藤提取物各治疗组在给药18 d后，随着给药浓度的升高，足跖肿胀度有逐渐下降的趋势，但各组间无显著性差异(P>0.05)。厚藤提取物各组与阳性组比较，均无显著性差异(P>0.05)。
| 给药天数 Administration days (d) |
空白组 Blank control group |
模型组 Model group |
阳性组 Positive control group |
厚藤提取物高剂量组 High dose IPE group |
厚藤提取物中剂量组 Middle dose IPE group |
厚藤提取物低剂量组 Low dose IPE group |
| 0 | 0.056±0.036 | 0.606±0.332## | 0.550±0.194## | 0.571±0.270## | 0.582±0.280## | 0.631±0.246## |
| 3 | 0.059±0.027 | 0.535±0.309## | 0.489±0.161## | 0.458±0.306## | 0.506±0.265## | 0.609±0.281## |
| 6 | 0.070±0.029 | 0.493±0.273## | 0.523±0.194## | 0.420±0.282## | 0.476±0.261## | 0.519±0.292## |
| 9 | 0.067±0.029 | 0.516±0.264## | 0.505±0.203## | 0.442±0.286## | 0.431±0.279## | 0.521±0.304## |
| 12 | 0.072±0.033 | 0.494±0.270## | 0.409±0.220## | 0.397±0.285## | 0.399±0.318## | 0.484±0.312## |
| 15 | 0.073±0.025 | 0.480±0.251## | 0.415±0.200## | 0.412±0.286## | 0.411±0.297## | 0.484±0.299## |
| 18 | 0.078±0.028 | 0.485±0.249## | 0.394±0.198## | 0.369±0.273## | 0.381±0.298## | 0.458±0.293## |
| 注：与空白组比较##P < 0.01 Note: ##P < 0.01 compared with blank control group | ||||||
2.4 厚藤提取物对CIA大鼠关节炎症指数的影响
由图 2可知，与空白组相比，各组造模大鼠关节炎指数显著升高(P < 0.01)。与模型组相比，阳性组、厚藤提取物高剂量组在给药15 d后关节炎症指数降低(P < 0.05)，厚藤提取物中剂量组在给药18 d后关节炎症指数降低(P < 0.05)。与阳性组相比，厚藤提取物各治疗组均无统计学意义(P>0.05)。
|
| 与空白组比较##P < 0.01；与模型组比较*P < 0.05 ##P < 0.01 compared with blank control group; *P < 0.05 compared with model group 图 2 给药后大鼠关节炎症指数评价变化 Fig. 2 Evaluation changes of joint inflammation index in rats after administration |
2.5 厚藤提取物对CIA大鼠血清中PGE2、RF、CRP表达的影响
由表 4可知，模型组大鼠与空白组相比，血清中PGE2、RF、CRP水平均显著升高(P < 0.01)。与模型组相比，各给药组能显著降低RF水平(P < 0.01)；除厚藤提取物低剂量组外，厚藤提取物高、中剂量组能显著降低PGE2、CRP水平(P < 0.05，P < 0.01)。与阳性组相比，厚藤提取物低剂量组血清中PGE2含量明显升高(P < 0.05)，厚藤提取物各组RF含量均显著升高(P < 0.01)，而CRP含量无显著性差异(P>0.05)。
| 组别Group | PGE2 (pg/mL) | RF (IU/mL) | CRP (ng/mL) |
| 空白组 Blank control group |
92.92±28.93 | 78.97±16.82 | 2 662±78.43 |
| 模型组 Model group |
152.2±23.25## | 184.4±12.99## | 2 901±82.93## |
| 阳性组 Positive control group |
103.9±19.98** | 83.73±8.943** | 2 679±152.2** |
| 厚藤提取物高剂量组 High dose IPE group |
99.41±26.76** | 101.7±8.560**ΔΔ | 2 709±113.2** |
| 厚藤提取物中剂量组 Middle dose IPE group |
121.9±31.90* | 141.6±10.37**ΔΔ | 2 755±168.8* |
| 厚藤提取物低剂量组 Low dose IPE group |
133.3±20.38Δ | 154.2±18.62**ΔΔ | 2 794±131.2 |
| 注：与空白组比较##P < 0.01；与模型组相比*P < 0.05，**P < 0.01；与阳性组相比ΔP < 0.05，ΔΔP < 0.01 Note: ##P < 0.01 compared with blank control group; *P < 0.05, **P < 0.01 compared with model group; ΔP < 0.05，ΔΔP < 0.01 compared with positive control group | |||
2.6 厚藤提取物对CIA大鼠滑膜组织病理变化的影响
大鼠踝关节病理切片结果如图 3所示。光学显微镜下，空白组踝关节组织软骨结构完整，骨层清晰，关节面光滑，软骨细胞分布均匀，软骨内无血管和神经，骨小梁较宽，骨髓腔中细胞分布密集、无空旷区；滑膜结构清晰完整，衬里层由单层或双层滑膜细胞组成，排列疏松且部分不连续，滑膜组织无炎性细胞浸润及纤维组织增生。模型组软骨和软骨下层骨组织受侵蚀，见局部软骨细胞严重减少，部分软骨细胞坏死，见软骨细胞着色较深，胞质溶解，排列紊乱，软骨层及软骨下层骨组织形成纤维裂隙，裂隙间大量毛细血管增生形成血管翳，较多炎性细胞浸润，见核呈圆形深染的淋巴细胞和核呈杆状或分叶状的中性粒细胞，骨组织中见大量的纤维组织填充，可见核呈长椭圆形的成纤维细胞增生。与模型组相比，厚藤提取物低剂量组踝关节组织病变程度相差不大，厚藤提取物中剂量组踝关节组织病变程度相对有所减轻，阳性组和厚藤提取物高剂量组踝关节组织病变程度得到明显减轻。
|
| 图 3 厚藤提取物对CIA大鼠踝关节病理切片的影响 Fig. 3 Effect of I.pes-caprae extracts on pathological sections of ankle joint in CIA rats |
3 讨论
厚藤作为一种常用海洋中药，现代研究表明，厚藤中含有树脂糖苷类、黄酮类、酚酸类等成分，具有抗炎、镇痛、免疫调节、抗肿瘤等多种药理活性[7]。本课题组前期研究发现，厚藤水提物具有抗急性痛风性关节炎(Acute Gouty Arthris, AGA)作用[9]，AGA与RA都属于风湿病，归属于中医“痹证、痹病”等范畴，本研究旨在探讨厚藤提取物对CIA大鼠的治疗作用。
CIA大鼠关节肿胀和炎症指数评价是反映病程的主要指标，进而评定药物的治疗效果。实验结果表明，与模型组相比，厚藤提取物各治疗组的踝关节肿胀度、足跖肿胀度有减轻的趋势但无显著性差异(P>0.05)，厚藤提取物高、中剂量组可降低CIA大鼠关节炎症评分指数。在实验过程中，造模大鼠发病时间、病情程度不一。首次免疫时将CⅡ和CFA混合乳化后，在大鼠背部两侧及尾根部3点皮内注射，造成大鼠后期出现不同肿胀情况，部分大鼠两后足均出现肿胀现象，个别大鼠出现前肢肿胀；第2次免疫时，选择大鼠右后足进行注射免疫。因此，在实验期间造模大鼠普遍为右后足严重肿胀，其余足不同程度肿胀。在给药前，按炎症评分指数(大鼠四足评分之和)分层随机分组，踝关节肿胀度、足跖肿胀度测量部位为大鼠右后足；给药后，大鼠右后足肿胀消退缓慢，而继发性肿胀消退较快。与模型组比较，厚藤提取物各治疗组大鼠炎症指数评分明显降低，而踝关节肿胀度、足跖肿胀度降低但无显著性差异(P>0.05)。
RA病情发生与多种细胞因子密切相关。在RA模型中，PGE2发挥着关键作用，炎性因子PGE2可以增强单核细胞和中性粒细胞的趋化性，刺激淋巴细胞的增殖和细胞因子的释放[10]，PGE2过度表达可使血管舒张，微循环通透性增加，加重渗出与水肿，诱导软骨破坏，从而加重RA炎症反应[11, 12]。RF作为一种特异性抗体，由RA产生，RF表达升高，可加重患者器官功能的损伤[13]。CRP最早在肺炎球菌感染病人中发现，属于急性期蛋白，在发生炎症、组织损失时，表达水平迅速上升，在临床上常被用作诊断炎性反应、免疫防御功能的标志物[14, 15]。RF和CRP与RA疾病发展密切相关，可作为诊断和判定RA严重程度的指标[16, 17]。
4 结论本研究评价了厚藤提取物对CIA模型大鼠的抗炎作用，结果显示，厚藤提取物对CIA大鼠有减轻肿胀、缓解滑膜炎症状的作用，其对CIA大鼠关节的保护作用可能是通过降低血清中PGE2、RF、CRP表达水平，从而抑制炎症反应，其具体分子作用机制还需深入探究。
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