0 引言

钩藤为茜草科植物钩藤Uncaria rhynchophylla (Miq.) Miq.ex Havil.、大叶钩藤Uncaria macrophylla Wall.、毛钩藤Uncaria hirsuta Havil.、华钩藤Uncaria sinensis (Oliv.) Havil.或无柄果钩藤Uncaria sessilifructus Roxb.的干燥带钩茎枝，秋、冬二季采收，去叶，切段，晒干^[1]，具有息风定惊、清热平肝的功效。现代药学研究表明，钩藤主要具有镇静、降血压、抗阿尔茨海默病和抗肿瘤等多种药理作用^[2-6]，吲哚生物碱是其主要的药效物质，其中大叶钩藤主要含有钩藤碱、异钩藤碱、柯诺辛碱(Corynoxine)、柯诺辛碱B (Corynoxine B)等生物碱。

目前，有关钩藤化学成分的研究主要集中于钩藤碱和异钩藤碱，对柯诺辛碱B和柯诺辛碱的研究相对较少。通过查阅文献和抗肿瘤筛选实验证实，柯诺辛碱B及柯诺辛碱是钩藤中很重要的抗肿瘤药效物质。因此，本研究建立了运用HPLC同时测定柯诺辛碱B和柯诺辛碱的方法，并测定其在不同采收月份大叶钩藤及其不同药用部位中的含量，以期为钩藤药材质量标准的建立提供科学数据。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要仪器

Waters alliance E2695型高效液相色谱仪(美国waters公司), BS110S型1/10万电子分析天平(梅特勒公司), B2200s超声波清洗器(必能信超声有限公司)。

1.1.2 主要试剂

钩藤药材采自广西南宁市高峰林场，经广西中医药研究院黄云峰副研究员鉴定为大叶钩藤(Uncaria macrophylla Wall.)；柯诺辛碱(纯度≥98，批号：BCY-0155)，柯诺辛碱B(纯度≥98，批号：BCTG-0924)，均购自江西佰草源生物科技有限公司；色谱纯甲醇(美国Fisher公司)；水为超纯水；其他试剂为分析纯。

1.2 方法 1.2.1 色谱条件

色谱柱：Inertsil ODS-3 C₁₈色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；检测波长：246 nm；柱温：25℃；流动相：甲醇-0.02%三乙胺(68∶32)；流速：1 mL/min；进样体积：10 μL。色谱图见图 1。

1.2.2 混合对照品溶液的制备

精密称定柯诺辛碱B和柯诺辛碱对照品适量，置于容量瓶内，加甲醇溶解并定容至刻度，制成每1 mL分别含0.13, 0.296 mg的混合对照品溶液。

1.2.3 供试品溶液的制备

取大叶钩藤药材粗粉约1.0 g，精密称量，置于具塞锥形瓶内，精密加入甲醇25 mL，密塞称重，超声提取40 min，放冷称重并用甲醇补足失重，摇匀，用0.45 μm有机微孔滤膜滤过，制得供试品溶液。

1.2.4 耐用性试验

用Inertsil ODS-3 C₁₈(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Kromasil C₁₈(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Agilent Eclipse XDB-C₁₈(4.6 mm×250 mm，5 μm)等不同品牌色谱柱进样测定，结果本品供试液中柯诺辛碱B和柯诺辛碱色谱峰的分离度均大于1.5，理论板数分别按柯诺辛碱B和柯诺辛碱色谱峰计算，均不低于3 000，表明本方法在不同色谱柱的适用性良好。

1.2.5 线性关系考察

分别精密吸取1.2.2节混合对照品溶液1，3，5，10，15 μL，按1.2.1节色谱条件进行测定，以峰面积值(y)为纵坐标，各待测物进样量(x)为横坐标，分别绘制标准曲线。

1.2.6 精密度试验

取同一份供试品溶液，按1.2.1节色谱条件连续进样6次，测定各待测成分峰面积，峰面积相对标准偏差应小于等于2.00%

1.2.7 稳定性试验

取同一供试品溶液，于制备后0, 1, 2, 6, 10, 18 h分别进行测定，峰面积相对标准偏差应小于等于3.00%

1.2.8 重复性试验

精密称取同一样品6份，每份约1.0 g，按1.2.3节方法制备供试品溶液，在1.2.1节色谱条件下进行测定，每份供试品溶液平行进样2次，取平均值并计算供试品中各待测成分含量及其RSD。若待测成分含量为0.01%-0.10%，则RSD应小于等于4.00%；若待测成分含量在0.10%-1.00%，则RSD应小于等于3.00%。

1.2.9 加样回收试验

精密称取已知含量(重复性实验样品)的同一批钩藤药材6份，每份约0.5 g，分别置于具塞锥形瓶中，每个锥形瓶中均精密加入7.00 mL混合对照品溶液(每1 mL混合对照品溶液含0.128 mg柯诺辛碱B，0.308 mg柯诺辛碱)和18.00 mL甲醇，按1.2.3节方法制备供试品溶液，在1.2.1节色谱条件下进行测定，计算回收率。

回收率%=(C-A)/B×100%，

式中，A为供试品中所含被测成分的量，B为加入对照品的量，C为实测值。

1.2.10 样品测定

精密称取供试品适量，按1.2.3节方法制备供试品溶液，按1.2.1节色谱条件进行测定，每份供试品溶液平行进样2次，取平均值并计算供试品中各待测成分含量。

2 结果与分析 2.1 线性关系考察

由表 1可知，各成分在各自的线性范围内具有良好的线性关系。

2.2 精密度试验

供试品溶液中柯诺辛碱B和柯诺辛碱峰面积的RSD (n=6)分别为0.86%、0.74%，表明仪器精密度良好。

2.3 稳定性试验

柯诺辛碱B和柯诺辛碱峰面积的RSD分别为2.05%、2.82%，表明供试品溶液在18 h内稳定。

2.4 重复性试验

柯诺辛碱B和柯诺辛碱峰面积的RSD (n=6)分别为1.48%、2.23%，表明该方法重复性良好。

2.5 加样回收试验

由表 2可知，供试品中柯诺辛碱B和柯诺辛碱的平均回收率(n=6)分别为99.47%和100.06%，RSD分别为1.56%和0.98%，表明该方法准确度良好。

2.6 样品测定

根据表 3的结果可以看出，不同月份采收的大叶钩藤中柯诺辛碱B和柯诺辛碱的含量呈现无明显规律的波动现象，其中，8月份采收的药材中柯诺辛碱B和柯诺辛碱含量最高。

3 讨论

2020年版《中华人民共和国药典》^[1]规定钩藤的药用部位为带钩茎枝，采收季节为秋冬季节。钩藤带钩茎枝在粉碎后常有较多纤维，很难继续被粉碎成细粉，这些纤维主要存在于药材的木质部中。因此，笔者将其单独取出，与过筛后的细粉分别测定其中柯诺辛碱B和柯诺辛碱的含量。结果显示，细粉中柯诺辛碱B和柯诺辛碱的含量要明显高于纤维中的含量，提示柯诺辛碱B和柯诺辛碱很可能主要存在于大叶钩藤带钩茎枝的皮部，在木质部中含量较低。带钩茎枝中的柯诺辛碱B含量明显高于叶子，柯诺辛碱含量则略低于叶子，但两个药用部位中柯诺辛碱B和柯诺辛碱的含量之和却相同，提示大叶钩藤叶子可能也具有很好的药用价值。这对于2020年版《中华人民共和国药典》^[1]中关于“去叶”规定的合理性提出一定的思考。表 3结果表明，8月份采收的药材中柯诺辛碱B和柯诺辛碱含量最高，这对药典规定“秋冬季节采收”提供一定的数据支撑。

根据2020年版《中华人民共和国药典》^[1]记载，钩藤项下只有1个薄层鉴别项，没有含量测定项，质量控制指标还有所欠缺，质量标准有待完善。随着中药现代化、国际化的发展，人们对药材质量标准的制定提出了更高的要求，一个能体现药材药理学特征和优良临床价值的质量评价体系显得越发重要，这就要求广大科研工作者运用各种技术，获取药材环境、遗传、性状、化学、药理等特征数据^[7]。

4 结论

本研究方法可准确、快捷地测定大叶钩藤中柯诺辛碱B和柯诺辛碱的含量，该结果可为大叶钩藤的化学成分、适宜采收季节和药用部位的研究提供科学数据。