2. 那坡康正天然植物提取有限责任公司, 广西百色 533900;
3. 广西壮族自治区中医药研究院, 广西南宁 530022
2. Napo Kangzheng Plant Extracts Co., Ltd., Baise, Guangxi, 533900, China;
3. Guangxi Institute of Chinese Medical & Pharamaceutical Sciences, Nanning, Guangxi, 530022, China
左旋多巴(L-dopa)收载于世界各国药典，在帕金森综合症的临床治疗中起十分重要的作用[1]。1961年Birkmayer发现L-dopa有抗帕金森综合症作用[2]，1968年美国食品药品监督管理局(FDA)批准应用于临床，1973年上市销售，市场需求日渐增长。L-dopa的生产途径有化学合成法、生物酶催化法、生物发酵法和植物提取法。化学合成法因L-dopa和D-dopa手性拆分技术难度大，成本高，仅有欧洲、日本等发达国家采用；生物酶催化法和生物发酵法因技术不成熟，产量低，目前没有量产；植物提取法因原料丰富易得，工艺简单，逐步成为主流[3]。植物提取法最初以蚕豆荚皮、蚕豆及藜豆为原料，后多采用猫豆；工艺也从酸提-铅沉法[4]、稀醋酸法[5]发展到酸浸-离子交换法[6]。广西以其猫豆资源优势，近二十年逐渐成为世界L-dopa的主要产区[7]，生产工艺为用稀HCl水溶液浸提，浸提液上001×7(732)阳离子交换树脂柱，将L-dopa富集于柱上；交换饱和后用水洗柱，再用浓氨水将L-dopa从柱上洗脱；洗脱液用HCl中和，减压浓缩，析出粗品；粗品用稀HCl溶液加热溶解至饱和，冷却析出结晶，过滤，烘干，即得L-dopa产品[8]；用过的阳离子交换柱，须用NaOH溶液和HCl溶液再生才能用于下一次交换。在上柱、洗柱及柱再生工序有大量工艺废水产生；每生产1 kg L-dopa，可产生1.5-2.0 t高含淀粉、蛋白质、HCl和NaOH的废水，环保压力大，所有传统生产厂家因环境评价不合格而面临关停。目前国内外为解决L-dopa生产工艺排放黑臭废水的研究鲜有报道。中国学者大多着重于新技术、新手段的应用，如汪桂芳等[9]利用膜分离技术提高分离效果，杨卫华[10]采用重组酪氨酸酚裂解酶催化合成左旋多巴。波兰Polanowska等[11]为了环境保护和缩短工艺流程，尝试用0.2%醋酸水为溶剂从蚕豆中提取左旋多巴，但只是完成实验室提取试验，没有精制出产品，也没有进行工艺中试。
本研究摒弃传统工艺，创新性地开发一种新的生产工艺，虽然水的浓缩、蒸发量较大，但不产生含淀粉、蛋白质、HCl和NaOH的废水，能全面解决传统工艺的黑、臭、高COD工业废水问题，且产品得率、产品质量与传统工艺相当，可减少企业环保压力。
1 材料与方法 1.1 仪器Alliance 2695型四元泵带紫外检测器高效液相色谱仪(Waters公司)，GM705H型破壁料理机(上海飞利浦(中国)投资有限公司)，HB43-S型水分测定仪(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)，DHG9246A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)。
1.2 材料聚丙烯酰胺(PAM，非离子型，广州东歌化工科技有限公司)；聚合氯化铝(PAC，巩义市碧波供水材料有限公司)；HCl、NaOH和MgCl2(西陇科学股份有限公司)；甲醇(Thermo Fisher)；维生素C(VC，东营市华璇生物科技有限公司)；单宁酸(广州市德晟化工有限公司)；蒙脱石(粤江新材料(广州)有限公司)；食品级95%酒精(广西崇左东亚糖业有限公司)；含量测定用试剂为色谱纯，水为重蒸水；其余制剂为分析纯。猫豆(又名狗爪豆)，经广西中医药大学韦松基教授鉴定为豆科藜豆属狗爪豆Mucuna pruriens (Linn.) DC.var.Utilis (Wall.ex Wight) Bak.ex Burck的成熟、干燥种子[12]。
1.3 方法 1.3.1 工艺流程常温下用含VC水将干猫豆打成水浆，加PAM，静置沉淀(第一次沉淀)，滤取滤液；滤液加热煮沸，冷至室温，加PAM，静置沉淀(第二次沉淀)，滤取滤液，浓缩，静置析出L-dopa粗品；滤取粗品，用pH值为3.5的HCl水溶液煮沸溶解至饱和，趁热滤取滤液，冷却，结晶析出L-dopa，滤取结晶，烘干得L-dopa原料药产品。
1.3.2 供试液制备方法 1.3.2.1 含VC水的制备常温下操作，将1 g VC加入1 000 mL水中，充分搅拌使之完全溶解；用HCl调节pH值为4.5-5.0。
1.3.2.2 PAM溶液的配制取1 g非离子型PAM加入到1 000 mL去离子水中，快速搅拌使之全部溶解。即配即用。与料液(水浆或滤液)混合时，要快速、充分地搅拌均匀。
1.3.2.3 猫豆水浆的制备常温下操作，将含VC水和干猫豆一起放入破壁料理机中，不加热，转速7 500 r/min打浆10 min，得混悬状水浆。
1.3.3 L-dopa含量测定按《欧洲药典》中提及的方法[13]进行。
1.3.4 澄清效果测定 1.3.4.1 澄清效果指标在规定料液温度下操作；先将料液与沉淀剂快速、充分地搅拌均匀，再保温静置至规定时长，一次性倒入布氏漏斗，用2层Φ11 cm中速定性滤纸在-0.1 MPa真空度下抽滤10 min，测量滤液体积(VF)。
1.3.4.2 不同沉淀剂对澄清效果的影响60 g猫豆，打成1 800 mL水浆，分成9等份，每份200 mL，分别与不同沉淀剂(各自预先溶于5 mL水)快速混匀，静置，沉淀1 h，抽滤，测量滤液体积(VF)；取滤液测定L-dopa含量(C)。
1.3.5 基于猫豆原料的L-dopa转移率计算L-dopa转移率T=(W产品×C产品)/(W原料×C原料)×100%，
式中：W产品为L-dopa产品质量；
C产品为L-dopa产品中L-dopa的含量；
W原料为猫豆原料的质量；
C原料为猫豆原料中L-dopa的含量。
2 结果与分析 2.1 操作温度对水浆沉淀澄清的影响预试验结果表明，水浆温度超过65℃，无论加入何种沉淀剂，水浆均呈大粘度的稀薄液体，难以过滤。因此工艺全部在室温下操作，水浆温度22-28℃。
2.2 不同沉淀剂对水浆沉淀澄清的影响数据表明，不添加沉淀剂的水浆难以自然沉淀；加入PAC和PAM的沉淀效果最好。添加熟石膏粉、MgCl2、明矾、蒙脱石、PAC，水浆中L-dopa含量降低，且添加明矾、蒙脱石、PAC的水浆颜色变深；其余添加沉淀剂对水浆中的L-dopa含量没有影响(表 1)。因此本工艺选用PAM作沉淀剂。
| 沉淀剂 Precipitants |
水浆中沉 淀剂含量Precipitant content in soymilk (g·L-1) |
VF (mL) | C (mg·mL-1) |
| 无添加 No addition |
0 | 5.33±2.52** | 1.58±0.19 |
| 熟石膏粉 Gypsum powder |
2 | 11.33±5.13** | 1.24±0.04# |
| MgCl2 | 2 | 15.00±4.58** | 1.06±0.12 |
| 明矾 Alum |
2 | 18.67±4.72** | 0.56±0.19## |
| 蒙脱石 Montmorillonite |
2 | 20.33±8.02** | 1.22±0.18# |
| 单宁酸 Tannic acid |
2 | 32.33±7.51* | 1.50±0.15 |
| 酒石酸 Tartaric acid |
2 | 30.67±7.02* | 1.51±0.16 |
| PAC | 0.1 | 125.33±26.76 | 0.48±0.13## |
| PAM | 0.1 | 99.33±13.01 | 1.53±0.10 |
| 注：经组间t检验，VF列，与PAM组比较，**P＜0.01，*P＜0.05；C列，与无添加组比较，##P＜0.01，#P＜0.05 Note: By t-test, column VF，compared with PAM group, **P＜0.01, *P＜0.05；column C，compared with no addition group，##P＜0.01，#P＜0.05 | |||
2.3 第一次沉淀工序的参数优选
采用L9(34)正交试验法。常温下操作，10.0 g猫豆按表 2用不同倍量的含VC水打成水浆(体积V)，加入PAM溶液，快速搅拌混匀，静置沉淀，抽滤，测量滤液体积(VF)。以V=300 mL为基准，按V′F=(300/V)×VF校正，结果如表 3，方差分析结果如表 4。
| 水平Level | 因素Factors | |||
| A水浆中PAM含量 PAM content in soymilk (g·L-1) |
B VC水-猫豆比Vol.of VC solution/Mucuna pruriens bean weight (mL·g-1) |
C静置时间 Standstill time (h) |
D空白 Blank |
|
| 1 | 0.05 | 30 | 1 | — |
| 2 | 0.10 | 35 | 1.5 | — |
| 3 | 0.15 | 40 | 2 | — |
| 实验号 Number of test |
因素Factors | V′F (mL) | |||
| A | B | C | D | ||
| 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 72.00 |
| 2 | 1 | 2 | 2 | 2 | 109.71 |
| 3 | 1 | 3 | 3 | 3 | 122.25 |
| 4 | 2 | 1 | 2 | 3 | 235.00 |
| 5 | 2 | 2 | 3 | 1 | 270.86 |
| 6 | 2 | 3 | 1 | 2 | 212.25 |
| 7 | 3 | 1 | 3 | 2 | 242.00 |
| 8 | 3 | 2 | 1 | 3 | 244.29 |
| 9 | 3 | 3 | 2 | 1 | 263.25 |
| K1 | 101.32 | 183.00 | 176.18 | 202.04 | |
| K2 | 239.37 | 208.29 | 202.65 | 187.99 | |
| K3 | 249.85 | 199.25 | 211.70 | 200.51 | |
| 极差 Range (R) |
148.53 | 25.29 | 35.52 | 14.05 | |
| 方差来源 Source of variance |
离差平方和 Sum of deviation squares |
自由度 Degree of freedom |
均方 Mean square |
F值 F value |
显著性 Significance |
| A | 41 227.73 | 2 | 20 613.87 | 115.60 | P < 0.01 |
| B | 985.14 | 2 | 492.57 | 2.76 | |
| C | 2 044.65 | 2 | 1 022.32 | 5.73 | |
| D (Blank) | 356.64 | 2 | 178.32 | — | |
| Note: F0.05(2, 2)=19，F0.01(2, 2)=99 | |||||
极差分析显示，因素影响大小为A＞C＞B，结果提示选A3B2C3。方差分析显示，A有显著影响(P＜0.01)，B、C影响不明显(P＞0.05)。对数据进行单因素分析，A1→A2变化明显(P＜0.05)，A2→A3变化不明显(P＞0.05)，拐点在A2，因此选A3较妥；B、C因素变化拐点不明显(P＞0.05)，可结合实际情况选择，越接近极差分析结果越佳。综合考虑，选择A3B2C2，即常温下操作，1 kg猫豆用35 L含VC水磨成水浆；1 L水浆加0.15 g PAM，快速、充分搅拌混合，常温静置1.5 h，即可进行过滤。
2.4 第二次沉淀工序的参数优选采用L9(34)正交试验法。按第一次沉淀工序优化参数制备滤液，将滤液加热煮沸15-30 min，使水溶性蛋白和淀粉变性析出，冷却降温到所需温度。沉淀剂仍选用PAM，PAM在超过65℃的水中会出现分解，因此考察温度定为25-50℃。取煮沸后冷却降温的滤液9份，每份200 mL，按表 5的用量和温度操作，加入PAM溶液，快速搅拌混匀，保温静置沉淀一定时间，抽滤，测量滤液体积(VF)，结果如表 6，方差分析结果如表 7。
| 水平Level | 因素Factors | |||
| A滤液中PAM含量 PAM content in filtrate (g·L-1) |
B静置时间 Standstill time (h) |
C温度 Tempera- ture (℃) |
D空白 Blank |
|
| 1 | 0.01 | 1 | 25 | — |
| 2 | 0.05 | 1.5 | 40 | — |
| 3 | 0.1 | 2 | 50 | — |
| 实验号 Number of test |
因素Factors | VF (mL) | |||
| A | B | C | D | ||
| 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 70 |
| 2 | 1 | 2 | 2 | 2 | 51 |
| 3 | 1 | 3 | 3 | 3 | 90 |
| 4 | 2 | 1 | 2 | 3 | 116 |
| 5 | 2 | 2 | 3 | 1 | 149 |
| 6 | 2 | 3 | 1 | 2 | 172 |
| 7 | 3 | 1 | 3 | 2 | 122 |
| 8 | 3 | 2 | 1 | 3 | 160 |
| 9 | 3 | 3 | 2 | 1 | 137 |
| K1 | 70.33 | 102.67 | 134.00 | 118.67 | |
| K2 | 145.67 | 120.00 | 101.33 | 115.00 | |
| K3 | 139.67 | 133.00 | 120.33 | 122.00 | |
| 极差 Range (R) |
75.33 | 30.33 | 32.67 | 7.00 | |
| 方差来源 Source of variance |
离差平方和 Sum of deviation squares |
自由度 Degress of freedom |
均方 Mean square |
F值 F value |
显著性 Significance |
| A | 10 518.22 | 2 | 5 259.11 | 143.00 | P < 0.01 |
| B | 1 389.56 | 2 | 694.78 | 18.89 | P < 0.1 |
| C | 1 614.89 | 2 | 807.44 | 21.95 | P < 0.05 |
| D (Blank) | 73.56 | 2 | 36.78 | — | |
| Note: F0.1(2, 2)=9，F0.05(2, 2)=19，F0.01(2, 2)=99 | |||||
极差分析显示，因素的影响大小排序为A＞C＞B，应选A2B3C1。方差分析显示，A影响非常显著(P＜0.01)，C影响显著(P＜0.05)，B影响不明显(P＜0.1)。对数据进行单因素分析，A1→A2变化明显(P＜0.05)，A2→A3变化不显著(P＞0.05)，拐点出现在A2，因此选A3较妥；B、C的变化拐点不明显(P＞0.05)。综合考虑，选A3B3C1，即在室温(25℃)下操作，1 L滤液加0.1 g PAM，快速搅拌混合，静置2 h，即可进行过滤。
2.5 浓缩工序参数的优选按第一、二次沉淀工序优化参数制备8 000 mL滤液，分为8等份，各自减压浓缩至不同体积，冷却至室温，静置6 h，滤取结晶，烘干，称重，含量测定，计算基于猫豆的L-dopa转移率，结果如表 8。数据表明，当浓缩液体积是猫豆重量的2-2.5倍量时，L-dopa析出效果最好，过滤性亦佳。
| 浓缩液-猫豆比 Vol.of concentrated solution/Mucuna pruriens bean weight (mL·g-1) |
L-dopa转移率 Transfer rate of L-dopa (%) |
过滤性 Filterability |
| 1.0 | 27.41 | 难滤Difficult |
| 1.5 | 34.35 | 难滤Difficult |
| 2.0 | 58.28 | 可滤Filterable |
| 2.5 | 59.72 | 可滤Filterable |
| 3.0 | 51.32 | 可滤Filterable |
| 3.5 | 40.11 | 可滤Filterable |
2.6 精制方法研究
沿用传统工艺的成熟精制方法[14]。往耐酸容器中加入适量pH值为3.5的盐酸水溶液(预先溶有3%的VC)，加热至沸，加入L-dopa粗品溶解至饱和，加入粗品质量4%的药用级活性炭粉，搅拌，保温40 min；趁热滤取饱和液，自然冷却至常温，析出结晶；滤取结晶，干燥后得到L-dopa产品。
2.7 工艺中试验证将本工艺在广西那坡康正天然植物提取有限责任公司进行3批中试生产，产品按《欧洲药典》进行含量测定。结果如表 9所示, 工艺运行平稳，产品得率和产品质量与传统工艺相当，工艺只产生少量含HCl的工业废水。
| 批次 Batch |
猫豆投料量 Input of M.pruriens bean (kg) |
猫豆中L-dopa L-dopa content in M.pruriens bean (%) |
产品质量 Quality of product (kg) |
产品中L-dopa含量 L-dopa content in the product (%) |
L-dopa转移率 Transfer rate of L-dopa (%) |
产品得率 Yield rate of product (%) |
| 1 | 100 | 4.18 | 2.21 | 99.94 | 52.83 | 2.21 |
| 2 | 200 | 4.71 | 4.77 | 100.24 | 50.75 | 2.38 |
| 3 | 300 | 4.84 | 7.95 | 99.35 | 54.40 | 2.65 |
| 平均 Average |
200 | 4.58 | 4.98 | 99.84 | 52.66 | 2.41 |
3 讨论
L-dopa不溶于乙醇、石油醚、乙酸乙酯等有机溶剂；在水中微溶，常温下600 mL水可溶解1 g[15]。预试验表明，猫豆其他成分对L-dopa有增溶作用，水中溶解度可超过3 mg·mL-1，因此只要有足量的水，猫豆磨成水浆10 min，豆中的L-dopa可溶解转移入水中。L-dopa易溶于酸水，但如用pH < 3.5强酸水提取，会因强酸水溶解太多杂质而导致L-dopa无法从浓缩液中析出。
本工艺的技术难点在于尽可能减少提取液中的杂质和提高产品得率。工艺采用室温下水提、煮沸凝固析出水溶性淀粉和水溶性蛋白、加PAM沉淀剂等措施，目的是最大限度地减少提取液中的杂质。猫豆皮含有大量纤维，是第一次沉淀过滤的良好助滤材料，但形成的滤渣含水率较高，带走较多提取液；两次PAM沉淀过滤，累计损失约15%提取液，相当于损失约15%的L-dopa；浓缩析出粗品工序，有15%-20%的L-dopa残留于母液，造成L-dopa的重大损失。沉淀、过滤、析出粗品工序尚有待优化以提高L-dopa转移率，最终提高产品得率。
在浓缩析出L-dopa工序的母液中尚含有少量L-dopa，可通过加入乙醇析出。工厂实际将母液直接烘干成为低含量L-dopa产品出售，既避免黑臭工艺废水的产生，又省去防爆设备购置及防爆车间建设。
酪氨酸是L-dopa产品的相关物质之一，《欧洲药典》要求其含量≤0.5%，《美国药典》要求≤0.1%[16]。长期的生产数据表明，L-dopa结晶母液的pH值越接近中性，结晶中酪氨酸含量越低。本工艺全程控制pH值为5-6，经精制，产品中的酪氨酸含量很容易达到《中国药典》和《欧洲药典》要求，部分产品可达到《美国药典》要求。
PAM能与分散于水溶液中的悬浮颗粒架桥、附着结团，有极强的絮凝、沉淀作用，广泛应用于自来水生产、食品行业废水处理等领域[17]。工艺使用PAM作沉淀剂，可确保毒性安全。猫豆水浆加热至沸时，遇到MgCl2或熟石膏，水浆中的蛋白质可凝固成豆腐状，但过滤性不佳，滤饼含水率高，L-dopa损失大，因此没有进一步研究。
本工艺不产生黑、臭、高COD工业废水，每生产1 kg L-dopa，仅产生10-20 L含HCl工艺废水。试生产结果表明本工艺绿色环保，L-dopa产品得率可接受；沉淀滤渣可用于动物饲料或生产淀粉、蛋白质产品，猫豆资源可全部利用。浓缩工序的水蒸发量很大，将在后续研究中引进膜分离技术去除大部分水后再进行浓缩。此外，与猫豆同属的蚕豆，其叶、花、幼果、成熟种子和根中的L-dopa含量均很高，尤以鲜叶(22.4 mg·g-1)为最[18]；作者后续研究将以叶、花、幼果和根为生产原料进行试验，探究新工艺的通用性和可行性。
4 结论本研究开发的新生产工艺解决了传统工艺的黑、臭、高COD工业废水污染问题，且产品得率和产品质量与传统工艺相当，适合于工业化规模生产。
| [1] |
PASCUAL S B, KULISEVSKY J, BARBANOJ M, et al. Levodopa and executive performance in Parkinson's disease: A randomized study[J]. Journal of the International Neuropsychological Society: JINS, 2008, 14(5): 832-841. DOI:10.1017/S1355617708081010 |
| [2] |
BERNHEIMER H, BIRKMAYER W, HORNYKIEWI- CZ O, et al. Brain dopamine and the syndromes of Parkinson and Huntington Clinical, morphological and neurochemical correlations[J]. Journal of the Neurological Sciences, 1973, 20(4): 415-455. DOI:10.1016/0022-510X(73)90175-5 |
| [3] |
蒋宇, 余从田, 吴正钧, 等. 猫豆与左旋多巴的检测及生产工艺研究进展[J]. 食品工业, 2014, 35(4): 145-149. |
| [4] |
中国医学科学院卫生研究所劳动卫生研究室. 从蚕豆荚皮中提取左旋多巴[J]. 卫生研究, 1974(1): 10-12. |
| [5] |
北京医学院药学系74届工农兵学员左旋多巴毕业实践小组. 藜豆中左旋多巴的提取和含量测定[J]. 中草药通讯, 1974(4): 20-22, 19, 63. |
| [6] |
广西壮族自治区东兰制药厂. 猫豆中提取左旋多巴的实验报告[J]. 中草药通讯, 1976(5): 10-11, 49. |
| [7] |
黄艳, 赵小超, 李学坚, 等. 左旋多巴原料药精制母液化学成分的研究[J]. 中成药, 2019, 41(9): 2122-2126. DOI:10.3969/j.issn.1001-1528.2019.09.021 |
| [8] |
赵小超. 左旋多巴生产废液的化学成分及活性研究[D]. 南宁: 广西中医药大学, 2018.
|
| [9] |
汪桂芳, 李传润, 曹政, 等. 从猫豆中提取左旋多巴的膜分离工艺探索[J]. 安徽化工, 2014, 40(1): 17-20. DOI:10.3969/j.issn.1008-553X.2014.01.004 |
| [10] |
杨卫华. 重组酪氨酸酚裂解酶催化合成左旋多巴的工艺研究[D]. 杭州: 浙江大学, 2019.
|
| [11] |
POLANOWSKA K, ŁUKASIK R M, KULIGOWSKI M, et al. Development of a sustainable, simple, and robust method for efficient L-dopa extraction[J]. Molecules, 2019, 24(12): 2325. DOI:10.3390/molecules24122325 |
| [12] |
广西中药资源普查办公室. 广西中药资源名录[M]. 南宁: 广西民族出版社, 1993: 130.
|
| [13] |
European Directorate for the Quality of Medicines & Health Care (EDQM). European pharmacopoeia 9.0[S]. Strasbourg: EDQM, 2017: 2892.
|
| [14] |
广西邦尔药业有限公司. 一种从猫豆中提取左旋多巴的方法: 201611023242.8[P]. 2017-05-10.
|
| [15] |
北京医学院药学系72届工农兵学员毕业实践左旋多巴注射液研制组. 左旋多巴注射液的试制及其稳定性的初步考察[J]. 北京医学院学报, 1976(1): 10-16. |
| [16] |
The United States pharmacopieial convention(USP). USP36-NF31[S]. [S. l. ]: USP, 2017: 4095.
|
| [17] |
童甲甲. 不同离子型PAM的合成与应用研究[D]. 淮南: 安徽理工大学, 2017.
|
| [18] |
ETEMADI F, HASHEMI M, RANDHIR R, et al. Accumulation of L-dopa in various organs of faba bean and influence of drought, nitrogen stress, and processing methods on L-dopa yield[J]. The Crop Journal, 2018, 6(4): 426-434. DOI:10.1016/j.cj.2017.12.001 |