珊瑚来源放线菌Streptomyces albidoflavus M13.1的次级代谢产物化学成分研究
林玉坤1,2, 谢春兰2, 贾凌云1, 张改云2, 杨献文2, 潘英妮1     
1. 沈阳药科大学中药学院, 辽宁沈阳 110016;
2. 自然资源部第三海洋研究所海洋生物遗传资源重点实验, 福建厦门 361005
摘要: 为了研究珊瑚来源放线菌Streptomyces albidoflavus M13.1中的次级代谢产物,利用硅胶色谱法、凝胶色谱法、薄层色谱法、中压液相色谱法等技术对珊瑚来源放线菌Streptomyces albidoflavus M13.1发酵物的乙酸乙酯提取物进行分离和纯化,通过核磁共振氢谱(1H-NMR)、核磁共振碳谱(13C-NMR)、质谱(MS)等波谱数据及文献对照方法对化合物进行结构鉴定。从放线菌S.albidoflavus M13.1分离鉴定出13个化合物,分别为5-(6-methyl-7-oxooctyl)furan-2(5H)-one(1)、肉桂酸(2)、环(亮-脯)二肽(3)、5-(6,7-dihydroxy-6-methyloctyl)furan-2(5H)-one(4)、环(丙-脯)二肽(5)、香豆酸(6)、环(丙-亮)二肽(7)、N-乙酰基酪胺(8)、环(4-羟基-脯-苯丙)二肽(9)、环(甘-丙)二肽(10)、环(甘-脯)二肽(11)、尿嘧啶核苷(12)、2'-O-甲氧基尿嘧啶核苷(13)。这13个化合物均为首次从珊瑚来源的S.albidoflavus M13.1样品中分离得到,且均无明显的抗肿瘤细胞增殖活性。
关键词: 珊瑚    放线菌    次级代谢产物    提取分离    结构鉴定    
Study on Chemical Constituents of the Secondary Metabolites of Coral-derived Actinomycete Streptomyces albidoflavus M13.1
LIN Yukun1,2, XIE Chunlan2, JIA Lingyun1, ZHANG Gaiyun2, YANG Xianwen2, PAN Yingni1     
1. School of Traditional Chinese Medicine of Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang, Liaoning, 110016, China;
2. Key Laboratory of Marine Biogenetic Resources, Third Institute of Oceanography, Ministry of Natural Resources, Xiamen, Fujian, 361005, China
Abstract: In order to study the secondary metabolites of the coral-derived actinomycetes Streptomyces albidoflavus M13.1, silica gel chromatography, gel chromatography, thin-layer chromatography, medium pressure liquid chromatography and other techniques were used to separate and purify the ethyl acetate extract of the coral-derived actinomyces S.albidoflavus M13.1.The structure of the compound was identified by spectral data such as proton nuclear magnetic resonance spectroscopy (1H-NMR), carbon nuclear magnetic resonance (13C-NMR), mass spectrometry (MS) and literature comparison methods.13 compounds were isolated and identified from the actinomyces S.albidoflavus M13.1, which are 5-(6-methyl-7-oxooctyl)furan-2(5H)-one (1), cinnamic acid (2), cyclo-(Leu-Pro) (3), 5-(6, 7-dihydroxy-6-methyloctyl)furan-2(5H)-one (4), cyclo-(Ala-Pro) (5), coumaric acid (6), cyclo-(Ala-Leu) (7), N-acetyltyramine (8), cyclo-(4-OH-Pro-Phe) (9), cyclo-(Gly-Ala) (10), cylco-(Gly-Pro) (11), uridine (12), and 2'-O-methoxyluridine (13).All 13 compounds were isolated for the first time from the S.albidoflavus M13.1.These 13 compounds were all isolated from the sample of coral-derived S.albidoflavus M13.1 for the first time.
Key words: coral    actinomycetes    secondary metabolites    extraction and isolation    identification of structures    
0 引言

海洋放线菌是海洋微生物的重要组成部分,也是产生多种天然化合物的重要来源。链霉菌是海洋放线菌中研究最多的一个菌属,截至2016年从海洋链霉菌中分离得到的次级代谢产物有547个[1],包括生物碱类、甾体类、萜类、聚酮类等化合物,其中生物碱类化合物是主要的结构类型。迄今为止,大多数链霉属放线菌是从海洋沉积物中分离得到的,而从珊瑚中分离到的链霉属放线菌次级代谢产物研究鲜有报道。本研究通过对珊瑚来源的链霉属放线菌次级代谢产物进行研究,丰富珊瑚来源的链霉属放线菌次级代谢产物的结构类型,为进一步研究和开发珊瑚来源链霉属放线菌的化学成分提供参考。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 仪器和试剂

旋转蒸发仪(N-1100,上海诶朗科技有限公司),核磁共振仪(Bruker Avance Ⅱ 400 MHz),高分辨质谱仪(Waters Xevo G2 Q-TOF),紫外可见分光光度计(UV-800,上海元析仪器有限公司),中压制备体系(C-605,BUCHI),反向色谱柱(ODS,YMC),柱层层析硅胶和薄层层析硅胶板(山东省烟台江友硅胶开发有限公司产品),Sephadex LH-20凝胶(GE Healthcare Bio-Sciences AB),分析纯试剂(广州市化学试剂厂)。

1.1.2 菌种

放线菌分离自海南琼东海域蜂巢珊瑚样品,经16S rRNA序列分析鉴定为Streptomyces albidoflavus M13.1[2]。菌种保存于厦门海洋微生物菌种保藏管理中心。

1.2 菌种活化及发酵培养

将保存于-80℃甘油管的菌株接种到已灭菌的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基[3]上,于28℃恒温箱中培养3—5 d;挑取单菌落接种到2216E液体培养基中,于28℃,180 r·min-1条件下培养7 d,作为发酵的种子液;取20 mL发酵种子液接种至装有380 mL液体培养基[4](含有淀粉20 g、葡萄糖10 g、酵母提取粉5 g、细菌学蛋白胨5 g、海盐30 g)的1 L锥形瓶中,共接种100瓶,于28℃、180 r·min-1条件下培养7 d,共得到40 L发酵液。

1.3 提取与分离

将发酵液离心得到上清液,用等体积的乙酸乙酯萃取上清液,萃取3次后合并萃取液,减压浓缩得到乙酸乙酯粗提物21 g。将得到的粗提物用硅胶拌样后置于柱层析硅胶中,用洗脱剂石油醚和二氯甲烷-甲醇(体积比50:1→1:1)依次进行洗脱,在薄层硅胶板上点样、展开、显色后,将其划为10个馏分(Fr1-Fr10)。

Fr3 (69.8 mg)经过ODS反相硅胶中压色谱柱甲醇-水(体积比50:50→100:0)、Sephadex LH-20凝胶洗脱得到化合物1(25.8 mg)、2(46.8 mg)。Fr5(186.5 mg)经过ODS反相硅胶中压色谱柱甲醇-水(体积比60:40→100:0)、Sephadex LH-20凝胶及薄层色谱板制备得到化合物3(1.5 mg)。Fr7(1.04 g)经过ODS反相硅胶中压色谱柱甲醇-水(体积比15:85→100:0)、Sephadex LH-20凝胶甲醇-水洗脱得到化合物4(4.1 mg)和5(5.1 mg)。Fr8(419.2 mg)经过ODS反相硅胶中压色谱柱甲醇-水(体积比50:50→100:0)、Sephadex LH-20凝胶洗脱得到化合物6(66.2 mg)、7(3.5 mg)、8(57.8 mg)。Fr9(317.6 mg)经过ODS反相硅胶中压色谱柱甲醇-水(体积比15:85→100:0)、Sephadex LH-20凝胶洗脱得到化合物9(2.4 mg)、10(4.7 mg)。最后一段Fr10(611.0 mg)经过ODS反相硅胶中压色谱柱甲醇-水(体积比25:75→100:0)、Sephadex LH-20凝胶及乙腈-水(体积比10:90→95:5)的HPLC液相色谱柱纯化得到化合物11(13.6 mg)、12(2.0 mg)、13(2.6 mg)。

2 结果与分析 2.1 化合物结构鉴定

化合物1:白色粉末,高分辨质谱HR-ESI-MS m/z: 247.133 9 [M+Na]+1H-NMR(CD3OD, 400 MHz), δH 7.71 (1H, dd, J=5.7, 1.1 Hz, H-3), 6.11(1H, dd, J=5.7, 1.9 Hz, H-2), 5.13(1H, m, H-4), 2.57(1H, m, H-10), 2.14 (3H, s, H-12), 1.80(1H, m, H-5a), 1.60—1.69(2H, m, H-9a, H-5b), 1.34—1.46(7H, m), 1.06(3H, d, J=7.0 Hz, H-13); 13C-NMR(CD3OD, 100 MHz), δC 216.5(C-11), 176.4(C-1), 160.2(C-3), 122.1(C-2), 86.1(C-4), 48.6(C-10), 34.5(C-5), 34.3(C-9), 30.9(C-7), 28.7(C-12), 28.5(C-8), 26.4(C-6), 17.1(C-13)。上述数据与文献[5]报道的数据基本一致,故鉴定化合物为5-(6-methyl-7-oxooctyl)furan-2(5H)-one。

化合物2:白色粉末,高分辨质谱HR-ESI-MS m/z: 319.081 6 [2M+Na]+1H-NMR (CD3OD, 400 MHz), δH 7.60—7.38 (5H, m), 7.67 (1H, d, J=16.0 Hz, H-8), 6.47 (1H, d, J=16.0 Hz, H-7);13C-NMR (CD3OD, 100 MHz), δC 170.9 (COOH), 146.9 (C-1), 136.3 (C-4), 131.9 (C-8), 130.5 (C-3, C-5), 129.7 (C-2, C-6), 119.4 (C-7)。上述数据与文献[6]报道的数据基本一致,故鉴定化合物为肉桂酸。

化合物3:黄色粉末,高分辨质谱HR-ESI-MS m/z:211.1143 [M+H]+1H-NMR (CD3OD, 400 MHz), δH 4.25 (1H, t, J=6.92 Hz, H-9), 4.12 (1H, m, H-6), 3.51—3.48 (2H, m, H-3), 2.32—2.26 (2H, m, H-5), 2.06—1.83 (4H, m), 1.48—1.53 (1H, m), 0.95 (3H, d, J=2.68 Hz, H-12), 0.94 (3H, d, J=2.44 Hz, H-13);13C-NMR (CD3OD, 100 MHz), δC173.3(C-1), 169.4(C-7), 60.8(C-6), 55.1(C-9), 46.9 (C-3), 39.9 (C-10), 29.6 (C-5), 26.2 (C-11), 24.1 (C-4), 23.8 (C-12), 22.7 (C-13)。上述数据与文献[7]报道的数据基本一致,故鉴定化合物为环(亮-脯)二肽。

化合物4:白色粉末,高分辨质谱HR-ESI-MS m/z:265.144 6 [M+Na]+1H-NMR(CD3OD, 400 MHz), δH7.71(1H, d, J=5.7Hz, H-4), 6.11(1H, dd, J=5.7, 1.5 Hz, H-3), 5.14(1H, m, H-5), 3.56(1H, d, J=6.4 Hz, H-7′), 1.82—1.64(2H, m, H-1′), 1.49—1.36(8H, m, H-2′, 3′, 4′, 5′), 1.11(3H, d, J=6.4 Hz, H-8′), 1.07(3H, s, 6′-Me); 13C-NMR(CD3OD, 100 MHz), δC 176.4(C-2), 160.2(C-4), 122.0(C-3), 86.1(C-5), 76.2(C-6′), 74.6(C-7′), 39.5(C-5′), 34.5 (C-1′), 31.6(C-4′), 26.5(C-2′), 24.7(C-3′), 22.1(C6′-Me), 18.1 (C-8′)。上述数据与文献[8]报道的数据基本一致,故鉴定化合物为5-(6, 7-dihydroxy-6-methyloctyl)furan-2(5H)-one。

化合物5:白色粉末,1H-NMR(CD3OD, 400 MHz), δH 4.20(2H, m, H-3, 6), 3.51(2H, m, H-9), 2.50—2.00(4H, m, H-7, H-8), 1.37(3H, d, J=6.92 Hz, H-10);13C-NMR(CD3OD, 100 MHz), δC173.1(C-2), 169.6(C-5), 61.0(C-6), 52.6(C-3), 46.9(C-9), 29.7(C-7), 24.1(C-8), 16.2(C-10)。上述数据与文献[9]报道的数据基本一致,故鉴定化合物为环(丙-脯)二肽。

化合物6:白色粉末,1H-NMR (CD3OD, 400 MHz), δH 7.58(1H, d, J=15.92 Hz, H-7), 7.43(2H, d, J=8.4 Hz, H-2, 6), 6.81(2H, d, J=8.35 Hz, H-3, 5), 6.26(1H, d, J=15.88 Hz, H-8);13C-NMR(CD3OD, 100 MHz), δC171.2(C-9), 161.1(C-4), 146.5(C-7), 131.1(C-2, 6), 127.2(C-1), 115.8(C-3, 5), 115.8(C-8)。上述数据与文献[10]报道的数据基本一致,故鉴定化合物为香豆酸。

化合物7:白色粉末,高分辨质谱HR-ESI-MS m/z: 207.110 7 [M+Na]+1H-NMR(CD3OD, 400 MHz), δH 4.0(1H, d, J=0.72 Hz, H-3), 3.93(1H, dd, J=8.4, 4.72 Hz, H-6), 1.75(2H, m, H-7), 1.63(1H, m, H-8), 1.44(3H, d, J=7.08 Hz, H-11), 0.96(6H, t, J=6.84 Hz, H-9, 10); 13C-NMR(CD3OD, 100 MHz), δC172.0(C-2), 171.5(C-5), 55.1(C-6), 52.4(C-3), 45.6(C-7), 25.8(C-8), 24.0(C-10), 22.6(C-9), 21.4(C-11)。上述数据与文献[11]报道的数据基本一致,故鉴定化合物为环(丙-亮)二肽。

化合物8:白色粉末,高分辨质谱HR-ESI-MS m/z:202.084 8 [M+Na]+1H-NMR(CD3OD, 400 MHz), δH7.04(2H, d, J=8.4 Hz, H-2′, 6′), 6.73(2H, d, J=8.44 Hz, H-3′, 5′), 3.34(2H, t, J=7.24 Hz, H-1), 2.69(2H, t, J=7.6 Hz, H-2), 1.91(3H, s, H-Me); 13C-NMR(CD3OD, 100 MHz), δC173.7(C=O), 157.3(C-4′), 131.7(C-1′), 131.2(C-2′, 6′), 116.7 (C-3′, 5′), 42.9(C-1), 36.1(C-2), 23.0(Me)。上述数据与文献[12]报道的数据基本一致,故鉴定化合物为N-乙酰基酪胺。

化合物9:白色粉末,高分辨质谱HR-ESI-MS m/z: 283.107 1 [M+Na]+1H-NMR(CD3OD, 400 MHz), δH 7.30—7.20(5H, m, H-Ar), 4.48(1H, t, J=4.96 Hz, H-4), 4.35(1H, dd, J=11.6, 4.1 Hz, H-6), 4.27(1H, t, J=4.72 Hz, H-9), 3.70(2H, dd, J=13.0, 5.08 Hz, H-3), 3.27—3.13(2H, m, H-5), 2.05(2H, dd, J=13.5, 5.92 Hz, H-10); 13C-NMR(CD3OD, 100 MHz), δC 171.8(C-1), 167.6(C-7), 137.9(C-1′), 131.5(C-2′, 6′), 130.0(C-3′, 5′), 128.6(C-4′), 69.0(C-4), 58.8(C-6), 58.1(C-9), 55.7 (C-3), 39.4(C-5), 38.5(C-10)。上述数据与文献[13]报道的数据基本一致,故鉴定化合物为环(4-羟基-脯-苯丙)二肽。

化合物10:白色粉末,1H-NMR(CD3OD, 400 MHz), δH 4.00(1H, q, J=7 Hz, H-2), 3.91(2H, brs, H-2′), 1.43(3H, d, J=7.04 Hz, H-3); 13C-NMR(CD3OD, 100 MHz), δC 172.1(C-1), 169.3(C-1′), 52.2(C-2), 45.9(C-2′), 19.9(C-3)。上述数据与文献[14]报道的数据基本一致,故鉴定化合物为环(甘-丙)二肽。

化合物11:白色粉末,1H-NMR(CD3OD, 400 MHz), δH 4.22(1H, m, H-2), 4.09(1H, d, J=16.8 Hz, H-2′), 3.73(1H, d, J=16.8 Hz, H-2′), 3.55—3.50(2H, m, H-5), 2.30—1.85(4H, m, H-3, 4);13C-NMR (CD3OD, 100 MHz), δC 172.5(C-1), 166.9(C-1′), 60.3(C-2), 47.5(C-2′), 46.8(C-5), 29.9(C-3), 23.8(C-4)。上述数据与文献[15]报道的数据基本一致,故鉴定化合物为环(甘-脯)二肽。

化合物12:白色晶体,高分辨质谱HR-ESI-MS m/z:267.1 [M+Na]+1H-NMR(CD3OD, 400 MHz), δH 8.00(1H, d, J=8.08 Hz, H-6), 5.88(1H, d, J=4.56 Hz, H-1′), 5.69 (1H, d, J=8.08 Hz, H-5), 4.15(2H, m, H-2′, 3′), 3.99(1H, m, H-4′), 3.38(2H, dd, J=12.28, 2.72 Hz, H-5′); 13C-NMR(CD3OD, 100 MHz), δC 166.8(C-4), 153.0(C-2), 143.2(C-6), 103.2(C-5), 91.2(C-1′), 86.8(C-4′), 76.2(C-3′), 71.8(C-2′), 62.8(C-5′)。上述数据与文献[16]报道的数据基本一致,故鉴定化合物为尿嘧啶核苷。

化合物13:白色粉末,高分辨质谱HR-ESI-MS m/z:281.075 3 [M+Na]+1H-NMR(CD3OD, 400 MHz), δH 8.08(1H, d, J=8.12 Hz, H-6), 5.94(1H, d, J=3.6 Hz, H-1′), 5.68(1H, d, J=8.08 Hz, H-5), 4.23(1H, t, J=5.6 Hz, H-3′), 3.96(1H, m, H-4′), 3.84(2H, m, H-5′), 3.75 (1H, dd, J=12.36, 2.92 Hz, H-2′), 3.51(3H, s, -OCH3); 13C-NMR (CD3OD, 100 MHz), δC166.7(C-4), 152.7(C-2), 143(C-6), 103.0(C-5), 89.3(C-1′), 86.6(C-4′), 85.5(C-2′), 70.3(C-3′), 62.1(C-5′), 59.3(C2′-OMe)。上述数据与文献[17]与文献报道的数据基本一致,故鉴定化合物为2′-O-甲氧基尿嘧啶核苷。

化合物113的化学结构如图 1所示。

图 1 化合物113结构 Fig. 1 Structures of compound 113

2.2 化合物活性测定结果

采用CCK-8法,测定13个化合物对人宫颈癌细胞(HELA)、食管癌细胞(ECA-109)、肝癌细胞(BEL-7402)、膀胱癌细胞(BIU-87)、胰腺癌细(PANC-1)的抗细胞增殖活性。结果显示,13个化合物均无明显的抗肿瘤细胞增殖活性。

3 结论

从放线菌S.albidoflavus M13.1次级代谢产物中,分离获得13个化合物。经鉴定,其中有6个二肽类化合物,分别为环(亮-脯)二肽(3)、环(丙-脯)二肽(5)、环(丙-亮)二肽(7)、环(4-羟基-脯-苯丙)二肽(9)、环(甘-丙)二肽(10)、环(甘-脯)二肽(11);有2个呋喃类化合物,分别为5-(6-methyl-7-oxooctyl)furan-2(5H)-one(1)、5-(6, 7-dihydroxy-6-methyloctyl)furan-2(5H) -one(4);有2个核苷类化合物,分别为尿嘧啶核苷(12)、2′-O-甲氧基尿嘧啶核苷(13);此外还有1个肉桂酸(2)、1个香豆酸(6)、1个N-乙酰基酪胺(8)。以上13个化合物均为首次从珊瑚来源的S.albidoflavus M13.1样品中分离得到。对13个化合物进行了体外抗肿瘤细胞增殖活性检测,均未发现明显的活性化学成分。

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