2. 广西中医药大学, 广西中医药科学实验中心/广西中医基础研究重点实验室, 广西南宁 530200
2. Guangxi Key Laboratory of Chinese Medicine Foundation Research, Guangxi Scientific Experimental Center of Traditional Chinese Medicine, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning, Guangxi, 530200, China
癌症是威胁人类健康的重大疾病。据统计，2018年全球有1 810万新发癌症病例和960万癌症死亡病例，中国分别约占23.7%和30%，相比其他国家，我国癌症的发病率和死亡率最高[1], 用于恶性肿瘤的医疗费用每年超过2 200亿，经济损失重大。随着人口老龄化、工业化、城市化进程的加剧以及生活方式改变等，中国的癌症负担仍会继续增加[2]。因此，加强肿瘤防治相关研究，减少肿瘤的发病率和死亡率，有助于减轻癌症负担。
海洋真菌是海洋微生物的重要类群，因为生活在高压、高盐、低温(热液口为高温)、低光照、寡营养、低溶氧等独特环境条件中，所以海洋真菌可产生具有特异、新颖、化学结构多样的次级代谢活性物质，已成为化学和药学等领域关注的焦点[3, 4]。海洋真菌的代谢产物富含抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗菌等活性物质[5-9]，是药物开发的重要资源库[10]。朱伟明教授课题组多次报道海盐田的嗜盐真菌具有结构新颖的代谢产物，并发现多个代谢产物对肿瘤细胞有细胞毒作用[11-14]。然而，细胞毒药物也会对正常细胞产生毒性，有较大的毒副作用。靶向治疗可以明显减少毒副作用，是当前癌症治疗研究的主流趋势。成纤维细胞生长因子受体(Fibroblast Growth Factor Receptor, FGFR)过表达与肿瘤进程密切相关，因此，靶向FGFR治疗肿瘤成为临床研究的热点领域[15]。为进一步探讨嗜盐真菌靶向FGFR抗肿瘤作用，本研究从海盐田中分离嗜盐真菌，并开展嗜盐真菌发酵提取物的抑制肿瘤细胞增殖作用研究，发掘和评估靶向抗肿瘤的嗜盐真菌资源，为今后全方面开展嗜盐真菌代谢产物靶向FGFR抗肿瘤研究提供依据和基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品于2019年5月在广西北海竹林盐场的海盐田(21°44′N，109°27′E)采集样品。采集的样品放入无菌袋中，将无菌袋放入有冰袋的隔温箱中带回实验室，置于-20℃冰箱保存。
1.1.2 培养基PDA液体培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，100 g海盐，蒸馏水定容至1 000 mL，121℃灭菌20 min。固体培养基在此基础上添加15 g琼脂。
查氏固体培养基：硝酸钠3 g，磷酸氢二钠1 g，硫酸镁0.5 g，氯化钾0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，蔗糖30 g，琼脂15 g，100 g海盐，蒸馏水定容至1 000 mL，121℃灭菌20 min。
DMEM/F12(#10-092-CVR)培养基购自Corning Cellgro公司。
1.2 方法 1.2.1 真菌分离取约2 g新鲜田泥样品，加入2 mL无菌水，研磨混匀，即为样品原液；再用无菌水依次稀释制备10-2、10-3和10-4悬液，每个浓度悬液各取0.2 mL分别涂布于PDA固体培养基和查氏固体培养基中，置于25℃恒温培养箱培养14-30 d。第1周每天检查1次，此后每3 d检查1次，发现有菌丝长出时，将其转接到另一新的平板上进行三区划线纯化，如有杂菌则进行二次纯化或多次纯化，直至得到单一纯净的菌落，记录菌落数及菌落的形态特征。
1.2.2 真菌鉴定采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司，SK8259)提取DNA，然后以ITS1和ITS4为引物，PCR梯度扩增ITS基因序列；再用1%琼脂糖凝胶电泳(150 V、100 mA、20 min)检测PCR扩增产物，并用Bio-RAD凝胶成像仪观察电泳结果；检验条带合格后，采用SanPrep柱式DNAJ胶回收试剂盒(BBI，SK8131)纯化回收DNA；所得胶回收产物委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行ITS rDNA测序分析；最后用DNA Star软件整理测序结果，并利用BLAST数据库比对ITS rDNA基因序列，从中选取相似性较高且是有效描述的典型菌株基因序列作为参比对象。
1.2.3 真菌发酵及代谢物提取将对数生长期的菌株接种于1 L的锥形瓶中(10 mL/瓶)，每瓶含有300 mL PDA液体培养基，共3瓶，25℃静止发酵30 d后收集菌丝体；用丙酮提取菌丝体，减压回收丙酮得到提取物，再用乙酸乙酯萃取，减压回收得到乙酸乙酯萃取物，低温保存。
1.2.4 真菌代谢物抑制肿瘤细胞增殖活性检测取对数生长期的乳腺癌细胞MDA-MB-231和FGFR2过表达的乳腺癌细胞MDA-MB-231 (S252W)，用DMEM/F12培养基(含10% FBS)稀释至密度为(3—5)×104个/mL，再分别接种至96孔板中，每孔100 μL，37℃孵育过夜。配置含5 mg/mL提取物的培养基，倍比稀释10个浓度作为给药浓度，并设定0.2%二甲基亚砜(DMSO)对照组(阴性对照)，设3个复孔。培养48 h后，每孔加入10 μL Cell Counting Kit-8 (CCK-8)试剂，置于37℃培养箱中放置2 h。用微孔板酶标仪读数，测定波长为450 nm。抑制率(%)=[(OD对照-OD给药)/OD对照]×100%。
1.2.5 真菌代谢物抑制FGFR2蛋白激酶活性检测用酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)[16]检测真菌乙酸乙酯萃取物对FGFR2酪氨酸激酶酶活的抑制。以Poly (Glu, Tyr) 4:1为反应底物，将其包埋在酶标板后，在酶标板的对应样品孔加入1 μL待测试样品(1 mg/mL)，相应的阴性对照孔加DMSO，设5个复孔；每孔加上50 μL反应缓冲液稀释的FGFR2激酶(空白对照中用反应缓冲液代替激酶溶液)；再加入5 μmol/L ATP溶液50 μL启动反应，在37℃、100 r/min条件下反应1 h；T-PBS洗板3次，加入抗体PY99，37℃下反应0.5 h；无钾PBS洗板3次，加入辣根过氧化物酶标记的抗鼠IgG，37℃下反应0.5 h；最后通过邻苯二胺(OPD)显色(25℃避光反应)10 min，终止反应，于490 nm波长测OD值，并按照以下公式计算抑制率：样品的抑制率(%)=[1-(OD样品-OD空白)/(OD阴性对照-OD空白)]×100%。
2 结果与分析 2.1 海盐田的真菌多样性分析共分离得到26株菌，根据菌落形态特征差异进行初步排重后，所得13株菌进行ITS rRNA基因扩增和序列分析。基于BLAST数据库的比对结果(表 1)，被测序菌株属于11个不同种，分布于2纲2目3科4属。青霉菌属(Penicillium)为优势菌属，含有6种，占分离种的54.54%，其次是曲霉属(Aspergillus)菌株含有3种，链格胞菌属(Alternaria)和附球菌属(Epicoccum)各有1种。
| 菌株编号 Strain code |
近似种 Similar species |
ITS rRNA基因序列相似性 ITS rRNA sequence identity (%) |
|
| GXIMD02011 | Alternaria alternata strain HLG202018 | 99.81 | |
| GXIMD02012 | Aspergillus flavus clone EF-533 | 100.00 | |
| GXIMD02010 | A.tamarii strain MS-Deb-PCB3F | 99.12 | |
| GXIMD02004 | A.versicolor isolate F | 100.00 | |
| GXIMD02001 | Epicoccum sorghinum | 100.00 | |
| GXIMD02009 | Penicillium citrinum strain NSF4 | 99.40 | |
| GXIMD02013 | P.meleagrinum var. viridiflavum | 99.12 | |
| GXIMD02006 | P.janthinellum strain MSEF36 | 99.63 | |
| GXIMD02005 | P.oxalicum strain WZ-288 | 100.00 | |
| GXIMD02008 | P.oxalicum isolate C7-8 | 99.82 | |
| GXIMD02007 | Penicillium sp.PK-2012 | 99.65 |
2.2 真菌发酵产物抗肿瘤活性分析
各个菌株发酵产物的乙酸乙酯萃取物抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231和FGFR2过表达的乳腺癌细胞MDA-MB-231(S252W)增殖活性结果如表 2所示，可知菌株E.sorghinum (编号GXIMD02001)的提取物对FGFR2过表达的乳腺癌细胞MDA-MB-231(S252W)有较强的抑制，其半抑制浓度(Half Maximal Inhibitory Concentration，IC50)为11.02 μg/mL，而对乳腺细胞MDA-MB-231几乎没有抑制活性(IC50为1 348 μg/mL)。该实验结果表明真菌E.sorghinum (编号GXIMD02001)可能是通过靶向FGFR2发挥抗肿瘤作用。其他菌株提取物对FGFR2过表达和未过表达的乳腺癌细胞增殖抑制活性未显示差异。两株真菌A.versicolor (编号GXIMD02004)和P.citrinum (编号GXIMD02009)对乳腺癌细胞MDA-MB-231(S252W)和MDA-MB-231的IC50为11.94-16.41 μg/mL，具有较显著抗肿瘤活性作用。5株真菌P.oxalicum (编号GXIMD02005)、P.janthinellum (编号GXIMD02006)、P.oxalicum (编号GXIMD02008)、A.alternata (编号GXIMD02011)和P.meleagrinum (编号GXIMD02013)具有较弱的抗乳腺癌作用，IC50为219.2-449.7 μg/mL。
| 样品 Sample |
IC50(μg/mL) | |
| MDA-MB-231 | MDA-MB-231(S252W) | |
| GXIMD02001 | 1 348.00 | 11.02 |
| GXIMD02004 | 16.41 | 11.94 |
| GXIMD02005 | 335.00 | 386.70 |
| GXIMD02006 | 475.20 | 449.70 |
| GXIMD02007 | 788.10 | 634.20 |
| GXIMD02008 | 396.90 | 290.90 |
| GXIMD02009 | 13.28 | 12.36 |
| GXIMD02010 | 741.80 | 437.20 |
| GXIMD02011 | 294.50 | 219.20 |
| GXIMD02012 | 1 292.00 | 1 194.00 |
| GXIMD02013 | 325.80 | 404.00 |
2.3 FGFR2蛋白激酶抑制活性分析
用酶联免疫吸附法(ELISA)检测菌株E.sorghinum (编号GXIMD02001)发酵产物的乙酸乙酯萃取物，在1 mg/mL浓度下对FGFR2激酶的抑制活性，结果其抑制率为91.5%。该结果从酶水平进一步证明菌株E.sorghinum (编号GXIMD02001)是通过靶向FGFR2发挥抗肿瘤作用。
3 讨论FGFR是酪氨酸激酶家族重要成员之一，是一类单跨膜糖蛋白分子，主要包括FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4 4种亚型，由于FGFR基因突变和扩增导致FGFR蛋白激酶过表达，FGFR持续激活从而诱导肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移，促进血管生成以及肿瘤的发生发展[17]。FGFR2过表达能够激活下游关键的信号通路，与乳腺癌的发生发展密切相关[18]。
已上市和临床在研的FGFR小分子抑制剂可分为多靶点抑制剂与选择性FGFR抑制剂。多靶点抑制剂如已上市药物Ponatinib、Nintedanib、Dovitinib和Lenvatinib均靶向于FGFR、VEGFR和PDGFR等多个激酶靶点[19-22]。这些多靶点FGFR抑制剂存在严重的毒副作用，主要是因其抑制VEGFR而引起高血压、蛋白尿、胃肠病变和皮肤反应等[23]。与多靶点FGFR抑制剂相比较，选择性FGFR抑制剂更加选择性地靶向抑制FGFR，利于疗效的发挥，规避多靶点FGFR抑制剂的毒性反应，更符合当下精准医疗的个性化用药的需求。2019年美国FDA加速批准的Pan-FGFR抑制剂Erdafitinib, 可用于治疗局部晚期或转移性膀胱癌，是首个获批上市的选择性FGFR抑制剂[24]。目前，仅有少量选择性FGFR抑制剂进入临床研究，包括3个临床三期(TAS-120、NVP-BGJ398和AZD4547)，1个临床二期和4个临床一期[25]。
本研究从北部湾海洋高盐环境中发现若干株具有抗肿瘤活性的真菌，其中，真菌E.sorghinum (编号GXIMD02001)对FGFR2过表达乳腺癌细胞有抑制增殖作用，并在酶水平上进一步验证其可能靶向FGFR2蛋白激酶发挥抗肿瘤作用，是首次报道海洋真菌靶向FGFR2抗肿瘤作用，对后续靶向抗肿瘤活性分子的挖掘具有重要的意义。然而，目前的研究对象是提取物，其具体的药效物质基础还不清楚，需要借助多学科交叉技术，结合化学信息和生物活性评价，充分阐明其靶向FGFR2抗肿瘤药效的物质基础。深入研究这些菌株的代谢产物将有利于北部湾海洋药用资源的开发和利用，有助于抗肿瘤先导化合物的发现，帮助人类对抗恶性肿瘤的威胁以及减轻经济负担。
4 结论本研究从高盐环境中共分离得到26株嗜盐真菌，经初步排重后获得13株菌，分子鉴定结果显示隶属于3科4属11种，其中青霉菌属菌株(Penicillium)为优势菌群。真菌E.sorghinum (编号GXIMD02001)靶向FGFR2发挥抗肿瘤作用，这是首次报道海洋真菌具有靶向FGFR2抗肿瘤作用。真菌A.versicolor (编号GXIMD02004)和P.citrinum (编号GXIMD02009)显著抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231和MDA-MB-231(S252W)增殖。5株真菌P.oxalicum (编号GXIMD02005)、P.janthinellum (编号GXIMD02006)、P.oxalicum (编号GXIMD02008)、A.alternata (编号GXIMD02011)和P.meleagrinum (编号GXIMD02013)具有较弱的抗乳腺癌作用。本研究为北部湾海洋微生资源的抗肿瘤药物开发利用奠定基础。
| [1] |
BRAY F, FERLAY J, SOERJOMATARAM I, et al. Global cancer statistics 2018:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. CA:A Cancer Journal for Clinicians, 2018, 68(6): 394-424. DOI:10.3322/caac.21492 |
| [2] |
曹毛毛, 陈万青. 中国恶性肿瘤流行情况及防控现状[J]. 中国肿瘤临床, 2019, 46(3): 145-149. DOI:10.3969/j.issn.1000-8179.2019.03.283 |
| [3] |
BARZKAR N, JAHROMI S T, POORSAHELI H B, et al. Metabolites from marine microorganisms, micro, and macroalgae:Immense scope for pharmacology[J]. Marine Drugs, 2019, 17(8): 464. DOI:10.3390/md17080464 |
| [4] |
付逸群, 于颖敏, 马瑞遥, 等. 海洋来源真菌生物活性物质研究进展[J]. 山东化工, 2019, 48(22): 63-65, 67. |
| [5] |
DESHMUKH S K, PRAKASH V, RANJAN N. Marine fungi:A source of potential anticancer compounds[J]. Frontiers in Microbiology, 2018, 8: 2536. DOI:10.3389/fmicb.2017.02536 |
| [6] |
DESHMUKH S K, GUPTA M K, PRAKASH V, et al. Mangrove-associated fungi:A novel source of potential anticancer compounds[J]. Journal of Fungi, 2018, 4(3): 101. DOI:10.3390/jof4030101 |
| [7] |
FAN M Q, NATH A K, TANG Y J, et al. Investigation of the anti-prostate cancer properties of marine-derived compounds[J]. Marine Drugs, 2018, 16(5): 160. DOI:10.3390/md16050160 |
| [8] |
WANG W H, PARK C, OH E, et al. Benzophenone co-mpounds, from a marine-derived strain of the fungus pestalotiopsis neglecta, inhibit proliferation of pancreatic cancer cells by targeting the mek/erk pathway[J]. Journal of Natural Products, 2019, 82(12): 3357-3365. DOI:10.1021/acs.jnatprod.9b00646 |
| [9] |
DU L, FENG T, ZHAO B, et al. Alkaloids from a deep ocean sediment-derived fungus Penicillium sp.and their antitumor activities[J]. The Journal of Antibiotics, 2010, 63(4): 165-170. |
| [10] |
JIN L M, QUAN C S, HOU X Y, et al. Potential pharmacological resources:Natural bioactive compounds from marine-derived fungi[J]. Marine Drugs, 2016, 14(4): 76. DOI:10.3390/md14040076 |
| [11] |
ZHENG J K, WANG Y, WANG J F, et al. Antimicrobial ergosteroids and pyrrole derivatives from halotolerant Aspergillus flocculosus PT05-1 cultured in a hypersaline medium[J]. Extremophiles, 2013, 17(6): 963-971. DOI:10.1007/s00792-013-0578-9 |
| [12] |
WANG Y, ZHENG J K, LIU P P, et al. Three new compounds from Aspergillus terreus PT06-2 grown in a high salt medium[J]. Marine Drugs, 2011, 9(8): 1368-1378. DOI:10.3390/md9081368 |
| [13] |
ZHENG J K, ZHU H J, HONG K, et al. Novel cyclic hexapeptides from marine-derived fungus, Aspergillus sclerotiorum PT06-1[J]. Organic Letters, 2009, 11(22): 5262-5265. DOI:10.1021/ol902197z |
| [14] |
WANG W L, ZHU T J, TAO H W, et al. Two new cytotoxic quinone type compounds from the halotolerant fungus Aspergillus variecolor[J]. The Journal of Antibiotics, 2007, 60(10): 603-607. DOI:10.1038/ja.2007.77 |
| [15] |
谢静文, 刘群鹏, 郑智伟, 等. FGFR抑制剂的研究进展[J]. 生物产业技术, 2018(5): 52-68. DOI:10.3969/j.issn.1674-0319.2018.05.008 |
| [16] |
孙长安, 房雷, 苟少华. FGF401构效关系研究发现一种新颖的FGFR4选择性抑制剂(英文)[J]. 有机化学, 2020, 40(1): 84-94. |
| [17] |
KATOH M. Fibroblast growth factor receptors as trea-tment targets in clinical oncology[J]. Nature Reviews Clinical Oncology, 2019, 16(2): 105-122. DOI:10.1038/s41571-018-0115-y |
| [18] |
LEI H P, DENG C X. Fibroblast growth factor receptor 2 signaling in breast cancer[J]. International Journal of Biological Sciences, 2017, 13(9): 1163-1171. DOI:10.7150/ijbs.20792 |
| [19] |
ROSKOSKI R. Properties of FDA-approved small molecule protein kinase inhibitors:A 2020 update[J]. Pharmacological Research, 2020, 152: 104609. DOI:10.1016/j.phrs.2019.104609 |
| [20] |
GOZGIT J M, WONG M J, MORAN L, et al. Ponatinib (AP24534), a multitargeted pan-FGFR inhibitor with activity in multiple FGFR-amplified or mutated cancer models[J]. Molecular Cancer Therapeutics, 2012, 11(3): 690-699. |
| [21] |
VARONE F, SGALLA G, IOVENE B, et al. Nintedan-ib for the treatment of idiopathic pulmonary fibrosis[J]. Expert Opinion on Pharmacotherapy, 2018, 19(2): 167-175. |
| [22] |
SUYAMA K, IWASE H. Lenvatinib:A promising molecular targeted agent for multiple cancers[J]. Cancer Control, 2018, 25(1): 31-34. DOI:10.1177/1073274818789361 |
| [23] |
GHEDINI G C, RONCA R, PRESTA M, et al. Future applications of FGF/FGFR inhibitors in cancer[J]. Expert Review of Anticancer Therapy, 2018, 18(9): 861-872. |
| [24] |
MARKHAM A. Erdafitinib:First global approval[J]. Drugs, 2019, 79(9): 1017-1021. DOI:10.1007/s40265-019-01142-9 |
| [25] |
LIU F T, LI N G, ZHANG Y M, et al. Recent advance in the development of novel, selective and potent FGFR inhibitors[J]. European Journal of Medical Chemistry, 2020, 186: 111884. DOI:10.1016/j.ejmech.2019.111884 |