0 引言

芒果苷是漆树科植物芒果叶的活性成分，其药理作用十分广泛但均甚弱，无法单独开发成药物。作者将芒果苷与罗汉果甜苷、薄荷脑进行配伍，研制具有抗炎、化痰、清咽功效的新药双苷清咽含片(SGQY tablet)，该含片药物直接作用于咽喉病灶，避免药物的首过效应，可提高药物的生物利用度。这无论是对研究芒果苷的成药性还是拓宽芒果苷的应用途径，均具有重要的促进作用。芒果苷具有抗炎、祛痰、镇咳、平喘等作用^[1]。罗汉果甜苷是广西道地药材罗汉果的活性部位，具有化痰、止咳、抗氧化等作用^[2]；罗汉果甜苷为低热量型甜味剂，在食品和药品研发中作为矫味剂得到广泛应用^[3]。薄荷脑是中药材薄荷挥发油的结晶物，具有抗炎等药理作用^[4]。为了弄清芒果苷、罗汉果苷和薄荷脑的最佳用量配比，本研究对双苷清咽含片的处方进行优化。采用星点设计-效应面优化法^[5]，运用Design-expert 8.0.5软件中的星点设计方法(Central composite design，CCD)和分析方法，结合动物体内抗炎药效试验结果，分析评价芒果苷、罗汉果甜苷和薄荷脑在双苷清咽含片抗炎药效中的贡献，对含片处方进行优化，为最终确定新药双苷清咽含片的处方提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物

昆明种小鼠，雄性，18~22 g，由广西医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK桂2009-0002，动物饲养于空调室内，室温(22±2)℃，相对湿度(60±5)%，饲喂标准颗粒饲料，自由饮水和摄食。

1.1.2 药物及试剂

芒果苷(批号：20130611，广西邦尔植物制品有限责任公司)；罗汉果甜苷(批号：20140810，广西桂林三宝药业有限公司)；薄荷脑(批号：140221，黄山天目薄荷药业有限公司)；二甲苯(AR级，批号：120621，广州苏喏化工有限公司)；冰乙酸(AR级，批号：20121017，成都市科龙化工试剂厂)；伊文思兰(AR级，批号：130925，嘉兴市精博化学品有限公司)；生理盐水(批号：H14070405，贵州天地药业有限责任公司)

1.1.3 仪器

EL204型分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；WHX微型漩涡混合器型(上海跃进医疗器械厂)；KQ5200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；ST16R型Thermo离心机(赛默飞世尔科技-实验室产品(德国))；UV1800紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；J02011型打孔器(广州市捷星教学仪器有限公司)。

1.2 方法 1.2.1 处方优化的实验设计

取含片中的3个活性成分芒果苷(X1)、罗汉果甜苷(X2)、薄荷脑(X3)为抗炎药效的影响因素。文献[1-2]报道芒果苷和罗汉果甜苷抗炎、化痰作用的最低起效剂量(Dmin)分别为100 mg·kg^-1，75 mg·kg^-1；分别取1/2 Dmin和2 Dmin为极小值和极大值，并换算成占含片素片片重的比例：芒果苷5.20%~20.80%，罗汉果甜苷3.90%~15.60%。薄荷脑在含片中的主要作用是矫味剂，根据前期研究结果，适用范围为素片片重的0.10%~0.50%。用Design-Expert 8.0.5软件计算出各因素的水平，如表 1。

1.2.2 对小鼠腹腔通透性及二甲苯致小鼠耳廓肿胀度的影响^[1] 1.2.2.1 受试药物溶液的制备

软件系统按表 1生成20组芒果苷、罗汉果甜苷和薄荷脑的用量组合(处方)。按处方分别精密称取芒果苷、罗汉果甜苷和薄荷脑，置于小瓶中，不加含片成型辅料，直接加入生理盐水10 mL，涡旋混合3 min后，超声处理10 min使之充分混合，作为受试药物悬液。

1.2.2.2 动物试验

取小鼠200只，随机分为20组，每组10只。每组小鼠按0.2 mL·10 g^-1体重每天i.g(经口灌胃)给药，连续7 d。末次给药1 h后，给各鼠按0.1 mL·10 g^-1体重尾静脉注射0.2%伊文斯兰溶液。将二甲苯0.05 mL滴于小鼠右耳，左耳滴0.05 mL的生理盐水作空白对照。继而i.p(腹腔注射给药)0.6%冰醋酸，0.2 mL/只。

1.2.2.3 小鼠耳廓肿胀度的测定

末次给药后15 min，脱颈椎处死小鼠，沿耳廓基部剪下左右两耳，用直径6 mm打孔器分别在两耳的同一部位打下圆形耳片，立即分别称重(W)。左、右耳片的重量差值即为耳廓肿胀度Y1，算式如下：Y1=W_右耳-W_左耳。

1.2.2.4 小鼠腹腔通透性的测定

对小鼠i.p 6 mL生理盐水进行清洗，收集腹腔液于3 000 r/min离心5 min。取上清液于紫外-可见分光光度计590 nm处测定OD值(Y2)。

1.2.2.5 数据处理

实验设计、因素水平计算、实验数据处理，均采用Design-Expert8.0.5软件进行。

2 结果与分析 2.1 处方优化及多元线性拟合

双苷清咽含片的不同处方及其效应如表 2所示。

采用软件对表 2的数据进行多元线性回归和方差分析；方差分析结果见表 3~4，二次多项式方程如下：

$ \begin{array}{l} Y1 = {\rm{11}}{\rm{.51254 - 0}}{\rm{.80978 \times X1 - 0}}{\rm{.30901 \times X2 - }}\\ {\rm{7}}{\rm{.80428 \times X3 + 1}}{\rm{.15550E - 003X1 \times X2 + 0}}{\rm{.12019X1}}\\ {\rm{ \times X3 + 0}}{\rm{.012876 \times X2 \times X3 + 0}}{\rm{.020855 \times X}}{{\rm{1}}^{\rm{2}}}{\rm{ + }}\\ {\rm{0}}{\rm{.013964 \times X}}{{\rm{2}}^{\rm{2}}}{\rm{ + 9}}{\rm{.34524 \times X}}{{\rm{3}}^2}(P < 0.000{\rm{ }}1,\;{R^2} = 0.991{\rm{ }}5); \end{array} $

$ \begin{array}{l} Y2 = {\rm{0}}{\rm{.25132 - 0}}{\rm{.015322 \times X1 - 3}}{\rm{.68521E - 003 \times }}\\ {\rm{X2 - 0}}{\rm{.061111 \times X3 + 8}}{\rm{.33608E - 005 \times X1 \times X2}}\\ {\rm{ + 2}}{\rm{.37981E - 003 \times X1 \times X3 - 2}}{\rm{.34979E - 003 \times X2}}\\ {\rm{ \times X3 + 3}}{\rm{.24583E - 004 \times X}}{{\rm{1}}^{{\rm{2}}}}{\rm{ + 1}}{\rm{.20765E - }}\\ {\rm{004 \times X}}{{\rm{2}}^{{\rm{2}}}}{\rm{ + 0}}{\rm{.088690 \times X}}{{\rm{3}}^{2}}(P < 0.000{\rm{ }}1,{R^2} = 0.987\;2)。\end{array} $

方差分析结果显示，抑制小鼠耳廓肿胀度的主次顺序、以及对小鼠腹腔通透性影响的主次顺序，同为X1>X2>X3，即芒果苷＞罗汉果甜苷＞薄荷脑，其中芒果苷具有极显著影响(P < 0.000 1)，罗汉果甜苷具有显著影响(P < 0.05)，薄荷脑无统计学显著意义(P>0.05)；模型回归方程具有显著意义，失拟项结果不显著，说明回归方程良好；方程中X1、X2、X3、X1²、X2²和X3²项为三因素对各效应的单独作用，X1X2、X1X3、X2X3项为两因素的交互作用。

由此可见，对双苷清咽含片抗炎药效的影响因素中，芒果苷的影响极大，罗汉果甜苷有显著影响，薄荷脑无显著影响。

2.2 效应面描绘与分析

分别固定3个自变量中的一个为中值，绘制Y1和Y2的三维等高线效应面图(图 1~6)。

以上6个图显示，Y1效应面的曲面变化程度依次为图 1＞图 2＞图 3，Y2效应面的曲面变化程度依次为图 4＞图 5＞图 6，说明无论是对抑制小鼠耳廓肿胀度的影响，还是对小鼠腹腔通透性的影响，因素的影响大小排序均为芒果苷＞罗汉果甜苷＞薄荷脑，与方差分析结果相一致。

2.3 处方优化结果

通过软件系统的优化计算，双苷清咽含片的处方优化结果见表 5。处方最优范围为(占素片片重)：芒果苷8.50%~17.5%，用量越大越好；罗汉果甜苷6.37%~13.13%，用量越大越好；薄荷脑0.18%~0.42%，用量对抗炎药效没有显著影响。结合文献^[1-2]报道的剂量，芒果苷和罗汉果甜苷均取其最低起效剂量，换算成占含片素片重，分别为13.00%和9.75%，薄荷脑取其中值即0.30%，得到最优处方为(占素片片重)：芒果苷13.00%，罗汉果甜苷9.75%，薄荷脑0.30%。软件系统据此最优处方预测的Y1和Y2的值分别为1.98和0.085，与表 2第2，7，9，12，16号试验的实测Y1和Y2相似，说明最优处方是可行的。

3 讨论

正交试验优化方法采用线性数学模型拟合，存在实验次数少、精度不高、建立的数学模型预测性不佳等问题，其优化结果仅得出一个既定的点(由开展正交试验前拟定的水平和因素所确定)。而采用星点设计-效应面优化法建立的数学模型及其效应面，给出的优化结果是一个区域范围，给处方优化有更多的选择；效应面具有直观、方便、预测性精确等的优点。

薄荷脑虽然具有抗炎作用，其最低起效剂量为100 mg·kg^-1[4]，但在双苷清咽含片中是作为矫味剂使用，用量极少，给予小鼠的剂量不足5 mg·kg^-1，故其用量与抗炎药效间未呈现“量-效关系”。相反，双苷清咽含片的抗炎药效主要取决于芒果苷和罗汉果甜苷的用量，且呈良好的“量-效关系”。

双苷清咽含片的处方在前期研究中曾采用正交试验方法进行了优化^[6]，结果为芒果苷占含片素片片重10.40%、罗汉果甜苷占7.80%、薄荷脑占0.30%；本次采用星点设计-效应面法优化结果为芒果苷占含片素片片重13.00%，罗汉果甜苷占9.75%，薄荷脑占0.30%。两次优化结果虽然相近，但略有差异。正交设计是一种高效、多因素优化实验设计，利用正交表将影响因素和因素水平进行组合和均匀搭配，可大大减少实验次数；而星点设计-效应面优化法主要考察自变量对效应的作用并对其进行优化，要求自变量必须连续且可被实验者准确控制^[7]。由此可见，较前一次优化，本次结果应更为精确。

4 结论

星点设计-效应面优化法的二次回归模型预测性好，可快速准确地给出双苷清咽含片的最优处方；双苷清咽含片的抗炎药效主要取决于芒果苷和罗汉果甜苷的用量，薄荷脑的用量无显著影响。