0 引言

铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是我国传统名贵中药材，具有益胃生津、滋阴去热的显著功效，被2015年版《中华人民共和国药典》单列收载^[1]。抗疲劳是铁皮石斛主要药理作用之一^[2]，开展铁皮石斛抗疲劳药效物质基础研究，有利于促进铁皮石斛相关功效的开发应用。

国内外现代研究表明，铁皮石斛具有增强免疫力、抗疲劳、降血糖、抗肿瘤等作用^[3-4]；对阴虚所致肠胃疾病和糖尿病等具有明确疗效^[5-6]，特别是用于消除癌症放疗、化疗的副作用和恢复体能等方面，效果十分明显^[7]。铁皮石斛化学成分主要有多糖、芪类、多酚、黄酮、生物碱等^{[3-4, 8]}。各地人工种植铁皮石斛指纹图谱及其品质有所差异^[9-10]。

随着铁皮石斛药理学研究的深入，特别是铁皮石斛医疗保健价值的发现与确证，铁皮石斛人工种植面积及产量均大幅增加，导致铁皮石斛药材品质参差不齐。虽然铁皮石斛近年被批准为药食两用植物，但其深加工产品比较有限。广西是铁皮石斛道地药材的主产区之一，要实现高质量发展，极其需要药效物质基础研究成果的有力支撑。目前关于铁皮石斛化学成分与药效学的关联性研究鲜有报道。

本研究以游泳时间、游泳疲劳后血清乳酸及肝糖原含量为抗疲劳药效指标，利用偏最小二乘回归法(PLSR)分析铁皮石斛指纹图谱与其抗疲劳作用的关联性，拟为阐明铁皮石斛的抗疲劳药效物质奠定实验基础。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 药材

铁皮石斛分别采自云南文山、广西凌云、广西桂林和广西容县，经广西中医药研究院中药研究所鉴定为Dendrobium offcinale Kinura et Migo。

1.1.2 实验动物

KM小鼠，雌雄各半，体质量为18~22 g，SPF级，购于广西医科大学实验动物中心，生产许可证号：SCXK桂2014-0002。

1.1.3 主要试剂

乳酸测试盒和肝糖原测试盒(购自南京建成生物工程研究所)；甲醇(色谱纯，购自天津市四友精细化学品有限公司)，95%乙醇(食用酒精，购自南宁广耀实验装备有限责任公司)，乙腈(色谱纯，购自德国默克公司)。

1.1.4 主要仪器

LC-20AT型高效液相色谱仪(购自岛津公司)，Shim-pack VP-ODS色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，购自岛津公司)；TDL-5-A低速离心机(上海安亭科学仪器厂生产)；B11500-BS电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械有限公司生产)；1510酶标仪(购自Thermo Fisher Scientific Oy)。

1.2 方法 1.2.1 样本制备 1.2.1.1 提取物制备

取铁皮石斛干品，粉碎，过药典检验二号筛(24目)。(1)取铁皮石斛细粉250 g，加水浸泡1 h，煎煮提取3次，每次1 h；合并提取液，滤过，浓缩滤液成稠膏，经干燥，即得到水提取物。(2)另取铁皮石斛细粉250 g，加95%乙醇浸泡1 h，加热回流提取3次，每次1 h；合并提取液，滤过，浓缩滤液成稠膏，经干燥，即得到醇提取物。

1.2.1.2 供试品制备

(1) 取铁皮石斛水提取物粉末约1.0 g，精密称定，置锥形瓶中，加50%甲醇25 mL，精确称量，加热回流30 min，放冷至常温；用50%甲醇补足减失的质量，摇匀；经4 000 r/min离心10 min，取上清液滤过，得到水提取物供试品溶液。(2)取铁皮石斛醇提取物粉末约0.2 g，精密称定，置锥形瓶中，加100%甲醇25 mL，精确称量，超声处理(240 W, 40 kHz, 40℃)30 min，放冷；用100%甲醇补足减失的质量，摇匀；过滤，滤液即为醇提取物供试品溶液。

1.2.1.3 药效实验样品制备

按小鼠每公斤体质量灌胃40 mL体积给予生药1.633 g(即1.633 g/kg)的要求，称取相当于4.899 g生药的水提取物或醇提取物，加适量蒸馏水溶解，配成120 mL药液。

1.2.2 指纹图谱^[11] 1.2.2.1 色谱条件

体积流量1.0 mL·min^-1，进样量10 μL。

(1) 水提取物

流动相：甲醇(A)—水(B)；时间梯度0 min→10 min→30 min→ 0 min，甲醇(A)对应的浓度梯度5%→12%→23%→5%；检测波长为254 nm；柱温25℃。

(2) 醇提取物

流动相：乙腈(A)—水(B)；梯度洗脱：时间梯度0 min→10 min→38 min→50 min→65 min，乙腈(A)对应的浓度梯度8%→15%→28%→20%→8%；检测波长为310 nm；柱温30℃。

1.2.2.2 方法学考察

对实验方法进行稳定性、重复性、精密度考察，以指纹图谱相似度RSD在4.2%以内，各色谱峰相对保留时间RSD在2.2%以内，为符合分析要求。

1.2.2.3 HPLC指纹图谱

按1.2.2.1项的色谱条件分别记录色谱图。色谱峰经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年版)》软件(选择时间窗0.4，生成色谱的方法：平均值)予以多点校正，自动匹配，分别生成水提取物、醇提取物的对照HPLC指纹图谱。

1.2.3 药效实验

各取小鼠50只，随机分为正常组、铁皮石斛提取物组。各提取物组分别按1.633 g/kg(生药/体质量)灌胃给予铁皮石斛提取物，正常组灌胃给予等量蒸馏水，每天1次，连续10 d。

1.2.3.1 负重游泳小鼠游泳时间的测定^[12]

末次给药后1 h，使小鼠鼠尾负重5%体质量的铅块，于(25±1.0)℃水中进行负重力竭游泳实验，记录游泳时间。

1.2.3.2 游泳疲劳小鼠血清乳酸及肝糖原的测定^[13]

末次给药后1 h，使小鼠不负重于30℃水中游泳90 min，分别于游泳前0 min、游泳结束后0 min、20 min，经眼球取血测定血清乳酸含量，游泳结束后20 min取肝脏测定肝糖原。

1.2.3.3 统计学方法

采用SPSS 22.0软件分析数据，实验数据以“均数±标准差”(x±s)表示，采用方差分析作组间比较。

1.2.4 谱效相关性分析^[14] 1.2.4.1 统计学方法

采用Simca-p 13.0软件的偏最小二乘法(PLSR)及交叉验证方差分析(Analysis of variance testing of cross-validated predictive residuals，CV-ANOVA)开展谱效相关性分析研究，其中PLSR用于建立色谱峰与药效的谱效模型，CV-ANOVA用于检验PLSR分析模型的可靠性。正交信号校正法(Orthogonal Signal Correction, OSC)用于色谱峰面积数据处理。

1.2.4.2 谱效相关性分析方法

药效指标游泳时间、肝糖原含量的实验数据预处理：Y_n＝(各试样组-正常对照组)/正常对照组×100%。

药效指标乳酸含量的实验数据预处理：Y_n＝(正常对照组-各试样组)/正常对照组×100%。

色谱峰面积数据的OSC预处理^[15]：将经预处理的药效数据设为因变量Y，各提取物色谱共有峰面积数据设为自变量X，采用Simca-p 13.0软件建立PLSR分析模型，以CV-ANOVA检验该模型有无统计学意义。如所建模型无统计学意义(P＞0.05)，则采用上述软件OSC对色谱峰面积数据进行过滤，分解X数据为两部分，与Y垂直、对药效Y无贡献的部分舍去，与药效Y密切相关的部分记为Xo。以Xo为自变量，采用上述软件建立PLSR分析模型，以CV-ANOVA检验模型的统计学意义。

2 结果与分析 2.1 指纹图谱特征峰

按1.2.2.3节的操作，分别获得铁皮石斛水提取物和醇提取物的对照指纹图谱。分别查看各提取物色谱图峰的响应值，把具有3个以上共有峰和(或)具有2个较大响应值的共有峰列为研究对象，分别将各提取物进样量换算为毫克生药，以校正相应提取物共有峰面积数据，对应不出峰的峰面积作为0处理，得到30个特征相对明显的共有峰。4个产地铁皮石斛提取物的指纹色谱峰数据见表 1。

2.2 对负重游泳小鼠游泳时间的影响

与对照组比较，各产地铁皮石斛提取物组小鼠游泳时间分别延长38.8%~115.2%，差异极其显著(P＜0.01)，详见表 2。

2.3 对游泳疲劳小鼠血乳酸及肝糖原的影响

与对照组比较，各产地铁皮石斛提取物组小鼠血液中乳酸含量分别降低3.0%~8.3%，肝糖含量分别增加38.5%~119.0%，其差异有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01或P < 0.001)。

2.4 谱效分析

将色谱峰面积作为自变量X，经中心化(Zero-centered)处理；药效指标作为因变量Y，经Unit Variance Scaling (UV)处理。

2.4.1 指纹图谱与游泳时间的谱效分析

因以游泳时间为因变量Y，以色谱共有峰面积为自变量X，以Simca-p 13.0软件建立的PLSR分析模型无统计学意义，就以OSC滤过色谱共有峰面积数据得到自变量Xo，再以Y与Xo建立PLSR分析模型。经CV-ANOVA检验有统计学意义(P＜0.05)，R²X、R²Y和Q²累计值分别为0.575, 0.996和0.936，说明该模型对药效Y有较强的解释能力和预测能力。在Xo相对于Y有统计学意义的10个回归系数中，正回归系数有4个，分别对应色谱峰X₄、X₈、X₁₅、X₂₃；负回归系数有6个，分别对应色谱峰X₁、X₃、X₉、X₁₁、X₂₄、X₂₅。实验结果分析表明，各色谱共有峰与力竭游泳小鼠的游泳时间之间有着明显的相关性，见图 1、表 4。

2.4.2 指纹图谱与乳酸含量的谱效分析

按照1.2.4.1项的操作，应用Simca-p 13.0软件对乳酸含量因变量Y及指纹图谱色谱峰进行谱效分析，获得Xo相对于Y有统计学意义的19个回归系数，其中，正回归系数10个，分别对应色谱峰X₁、X₃、X₅、X₇、X₉、X₁₁、X₂₀、X₂₄、X₂₅、X₃₀，负回归系数9个，分别对应色谱峰X₄、X₈、X₁₀、X₁₃、X₁₅、X₁₈、X₂₁、X₂₃、X₂₇。这表明各色谱共有峰与游泳小鼠的乳酸含量之间有着明显的相关性，见表 4、图 2。

2.4.3 指纹图谱与肝糖原含量的谱效分析

按照1.2.4.1项的操作，应用Simca-p 13.0软件对肝糖原含量因变量Y及指纹图谱色谱峰进行谱效分析，获得Xo相对于Y有统计学意义的12个回归系数，其中，正回归系数2个，分别对应色谱峰X₂₇、X₂₈，负回归系数10个，对应色谱峰X₄、X₈、X₁₁、X₁₃、X₁₄、X₁₇、X₁₈、X₂₁、X₂₃、X₂₅。这表明各色谱共有峰与游泳小鼠的肝糖原含量之间有着明显的相关性，见表 4、图 3。

3 讨论

铁皮石斛在不同品种石斛中占有着重要的地位，但目前市场上铁皮石斛质量参差不齐^[16]。质量控制是提高药材质量的重要手段，而指纹图谱技术是实现药材质控及药材国际化的关键技术^[17]。本实验以指纹图谱各色谱峰峰面积作为各成分的含量指标，监控不同产地铁皮石斛提取物的内在质量。从指纹图谱结果可知，铁皮石斛不同产地之间总体上色谱峰均相同，但不同产地之间保留时间基本一致的色谱峰面积有一定差别；铁皮石斛不同溶剂提取物之间色谱峰面积有较大差异，这从技术层面说明不同产地药材药效有强弱区别、不同溶剂提取对药效有较大影响。

运动耐力降低是疲劳的最直观表现，而负重游泳力竭实验和游泳疲劳实验是经典的抗疲劳药效实验^[18]。力竭游泳时间是反映运动耐力的重要指标^[19]。在本实验中，4个产地铁皮石斛提取物组负重小鼠力竭游泳时间均显著延长，表明铁皮石斛提取物具有较强的提高运动耐力、延缓运动疲劳的作用。在生化层面上，机体内血中乳酸含量与机体疲劳程度呈正相关，肝糖原含量与机体供能呈正相关，在本实验中，4个产地铁皮石斛提取物组疲劳小鼠乳酸含量各有下降、肝糖原含量均明显增加，表明铁皮石斛提取物具有较强的抗疲劳作用。对于游泳时间、乳酸含量及肝糖原含量指标的影响，各产地或不同溶剂提取的提取物之间有较大差别，反映出药材质量的差异性。

利用中药指纹图谱技术与统计学分析方法，考察化学成分变化与中药药效强弱的关联性，研究两者的“谱-效”关系^[20-21]，有助于阐明药效物质基础和提高药材质量控制水平。本实验选择PLSR方法分析铁皮石斛指纹图谱与其抗疲劳作用之间的关联性，各色谱共有峰面积数据分别经OSC方法过滤，得到与药效密切相关的数据Xo作为自变量。经PLSR建模分析，Xo相对于游泳时间的正回归系有4个，其色谱峰均来自水提取物，这表明延长游泳时间的铁皮石斛化学成分主要在水提取物中，分别对应第4, 8, 15, 23号色谱峰；Xo相对于乳酸含量的正回归系数有10个，其中8个为醇提取物色谱峰，2个为醇提取物和水提取物共有色谱峰，但醇提取物色谱峰面积分别为水提取物的4.0和2.2倍，这表明降低机体乳酸含量的铁皮石斛化学成分主要在醇提取物中，分别对应第1, 3, 5, 7, 9, 11, 20, 24, 25, 30号色谱峰；Xo与肝糖原含量的正回归系数仅2个，均来自水提取物色谱峰，这表明提高肝糖原含量的铁皮石斛化学成分主要在水提取物中，分别对应27, 28号色谱峰。

4 结论

不同产地铁皮石斛水提取物和醇提取物均有抗疲劳作用，PLSR能较好地表征铁皮石斛液相色谱与其药效之间的相关性，延长游泳时间、降低机体乳酸含量或提高肝糖原含量等药效的铁皮石斛主要化学成分各不相同，为进一步阐明铁皮石斛抗疲劳药效物质基础和促进铁皮石斛相关产品开发提供了科学依据。